La protéine d'hétérochromatine 1 est un régulateur de la précision d'épissage de l'ARN déficiente dans la rectocolite hémorragique

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Nature Communications volume 13, Numéro d'article : 6834 (2022) Citer cet article

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Les défauts d'épissage de l'ARN ont été liés à des troubles humains, mais restent mal explorés dans les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI). Nous rapportons ici que l'expression de la chromatine et du régulateur d'épissage alternatif HP1γ est réduite dans la colite ulcéreuse (CU). En conséquence, l'inactivation du gène HP1γ dans l'épithélium intestinal de la souris déclenche des traits de type IBD, notamment l'inflammation et la dysbiose. En parallèle, nous constatons que sa perte de fonction augmente largement le bruit d'épissage, favorisant l'utilisation de sites d'épissage cryptiques sur de nombreux gènes ayant des fonctions dans la biologie intestinale. Il en résulte la production de progérine, une variante d'épissage toxique de l'ARNm de la prélamine A, responsable du syndrome de Hutchinson-Gilford Progeria du vieillissement prématuré. Le bruit d'épissage est également largement détecté chez les patients atteints de CU en association avec l'inflammation, les transcrits de progérine s'accumulant dans la muqueuse du côlon. Nous proposons que le suivi de l'activité HP1γ et de la précision de l'épissage de l'ARN puisse aider à la prise en charge des MICI et, plus généralement, du vieillissement accéléré.

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), y compris la colite ulcéreuse (CU) et la maladie de Crohn (MC), sont des troubles intestinaux inflammatoires chroniques caractérisés par une inflammation incontrôlée entraînant des lésions intestinales. Bien que des locus de gènes de susceptibilité aient été identifiés, les facteurs génétiques ne représentent qu'une partie de la variance globale de la maladie, ce qui indique un besoin de mieux explorer les interactions entre les gènes et l'environnement au cours du développement des maladies1. L'épigénétique capture les stress environnementaux et les traduit en modèles d'expression génique spécifiques, nous incitant à explorer les dérégulations de la chromatine dans la pathogenèse des MII. Dans une étude antérieure, nous avons identifié la protéine de l'hétérochromatine 1γ (HP1γ) comme un régulateur des gènes inflammatoires en réponse aux entérobactéries2. Les membres de la famille de protéines HP1, qui comprend également HP1α et HP1β chez la souris et l'homme, sont des lecteurs des modifications d'histone H3K9me2/3. Ils jouent un rôle clé dans la formation et le maintien de l'hétérochromatine, participant ainsi au silençage génique transcriptionnel3. En parallèle, les protéines HP1 présentent une activité de liaison à l'ARN, comme décrit chez plusieurs espèces4, et chez les mammifères, des études in vitro ont montré que HP1γ se lie aux motifs répétitifs introniques de l'ARN pré-messager5 pour favoriser le traitement co-transcriptionnel du pré-ARNm et l'épissage alternatif6,7,8. Ici, nous montrons que, dans l'épithélium intestinal, la régulation médiée par HP1γ de la transcription et du métabolisme de l'ARN est nécessaire à l'homéostasie intestinale et importante dans la compréhension des MII.

Nos observations précédemment rapportées sur l'impact de HP1γ sur le contrôle de l'inflammation dans l'intestin en réponse à une infection bactérienne2 nous ont incités à examiner l'expression de cette protéine dans le contexte de l'inflammation chronique. À cette fin, nous avons examiné une cohorte disponible de biopsies coliques dans des tissus non enflammés de patients atteints de CU et d'individus en bonne santé subissant des coloscopies de dépistage (Fig. 1a et Données supplémentaires 1 pour une description détaillée de la population). L'immunofluorescence quantitative (IF) a montré une expression fortement diminuée de HP1γ dans l'épithélium colique des patients atteints de RCH, par rapport aux individus sains (patients témoins) (Fig. 1a, b). L'expression compromise de HP1γ en association avec la CU a été confirmée à l'aide du modèle de souris EXCY2, qui combine un dysfonctionnement immunitaire (déficit en Il10) et un déficit en NADPH oxydase 1 (Nox1) de l'épithélium9. Aux stades précoces, ces souris ont présenté une colite chronique spontanée qui a évolué vers une dysplasie associée à la colite et des adénocarcinomes. L'expression réduite de HP1γ dans l'épithélium prévalait au stade inflammatoire chronique initial (âgé de 1 à 5 mois), tandis qu'au stade du cancer, l'expression était récupérée, en cohérence avec la détection accrue rapportée des membres de la famille des protéines Cbx dans divers cancers10,11 (Fig. 1c, d).

a, b L'expression de HP1γ est affectée chez les patients atteints de rectocolite hémorragique : (a) Immunofluorescence représentative dans des coupes de tissu colique colorées avec un anticorps anti-HP1γ (rouge) et Dapi (bleu) de coupes de côlon (barre d'échelle : 50 μm) et dans (b) ImageJ quantification de l'intensité moyenne du signal HP1γ de fluorescence/section chez les patients témoins (n = 10) et CU (n = 16), exprimée en valeur relative par rapport aux patients témoins (c, d ) Expression biphasique de HP1γ dans le modèle de souris IL10/NOX1 KO, c Immunomarquage avec anticorps anti-HP1γ (rouge) et fluorescence Dapi (bleu) et en (d) ImageJ quantification de l'intensité moyenne de la fluorescence. n = 6 souris pour chaque groupe, barre d'échelle : 80 µm, (e) expression d'ARNm pour Reg3b et Reg3g à partir d'épithéliums de villosités et de côlon de souris Ctrl (contrôle) et Cbx3 KO (n = 3–6 souris/groupe) (f) expression d'ARNm de Tnf, Il1b et II6 par RT-qPCR à partir d'épithélium du côlon de souris Ctrl (contrôle) et Cbx3 KO (n = 3–4 souris/groupe) (g) Enrichissement significatif du transcriptome Cbx3 KO du côlon avec signature pro-inflammatoire, les valeurs nominales P bilatérales ont été calculées par GSEA. ( h ) Évolution temporelle de la diversité bêta chez les souris mâles et femelles Villin-Cre Cbx3. Schéma illustrant le déroulement temporel de la collecte d'échantillons fécaux avant (définissant le groupe A) et après les traitements (Vhc ou Tamox) (définissant les groupes B-E), chez les souris femelles (n = 8) et mâles (n = 6). L'analyse statistique est fournie dans les données supplémentaires 4. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM ; test t de Student bilatéral (b, d, e, f). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ces observations, suggérant un rôle pour HP1γ dans l'inflammation chronique, nous ont incités à générer un modèle murin Villin-creERT2:Cbx3-/-, permettant une inactivation inductible du gène Cbx3 (codant pour la protéine HP1γ) dans la lignée épithéliale de l'intestin. Chez ces souris, appelées souris Cbx3 KO, le gavage au tamoxifène a entraîné une déplétion complète de la protéine HP1γ dans l'épithélium des tissus testés, bien que la déplétion ait été accompagnée d'une régulation à la hausse des isoformes HP1α et HP1β (Fig. 1 supplémentaire), comme indiqué précédemment12. L'observation de ces tissus par coloration par immunofluorescence n'a indiqué aucun changement dans les marques d'hétérochromatine constitutive, y compris H3K9me3 et H4K20me3, et les chromocentres visualisés par coloration au DAPI sont apparus inchangés (Figs. 1, 2 supplémentaires).

Le séquençage d'ARN de nouvelle génération sur des cellules épithéliales purifiées provenant de cryptes, de villosités et de côlon chez de jeunes souris adultes (âgées de 8 à 10 semaines) a indiqué des changements importants dans le paysage du transcriptome dans l'épithélium de souris Cbx3 KO, avec des scores de signature accrus dans les voies impliquées dans l'oxydation des lipides, symptomatique de dommages oxydatifs (Données supplémentaires 2). De plus, nous avons noté une diminution marquée de l'expression des ARNm codant pour les peptides antimicrobiens (AMP), notamment les défensines, les cathélicidines et les AMP de type gène régénérant (Reg) (Données supplémentaires 3 et Fig. 1e). Dans le côlon, nous avons en outre noté une augmentation substantielle de l'expression des gènes inflammatoires confirmée par Q-PCR (Fig. 1f, g et données supplémentaires 2).

L'inflammation ainsi que les altérations des productions d'AMP étant toutes deux propices à la dysbiose du microbiome intestinal13,14, nous avons en outre caractérisé les microbiomes fécaux chez la souris (n = 6 mâles et n = 8 femelles) via le séquençage Illumina de la région V3-V4 de l'ARNr 16 S bactérien. Dans l'analyse ultérieure des coordonnées principales UniFrac, les souris Cbx3 KO se sont regroupées loin des WT, ce qui indique un changement dans les communautés microbiennes (Fig. 1h et données supplémentaires 4 pour les détails des statistiques). Ce changement était exacerbé chez les femelles (valeur p = 0, 006) par rapport aux mâles (valeur p = 0, 015), bien que les communautés bactériennes soient similaires chez les deux sexes avant l'inactivation de Cbx3 (Fig. 1h). La composition bactérienne est également restée inchangée chez les souris femelles Cbx3 fl / fl traitées avec du tamoxifène en l'absence de la recombinase Cre, excluant un effet uniquement induit par l'administration de tamoxifène (Fig. 3 supplémentaire).

Comme le sexe peut influencer les facteurs de risque de MICI15, nous avons poursuivi des analyses séparées des souris mâles et femelles. Chez les souris femelles, 110 unités taxonomiques opérationnelles (OTU) ont été modulées en réponse à l'inactivation de HP1, tandis que chez les mâles, seules 60 OTU covariaient de manière significative avec l'inactivation de HP1 (données supplémentaires 5). Chez les femmes en particulier, nous avons observé une surreprésentation des bactéries colitogènes telles que E. coli et Alistipes, et une profonde régulation à la baisse des espèces bactériennes anti-inflammatoires telles que le producteur d'acides gras à chaîne courte (AGCC) Ruminococcaceae (Fig. 4 supplémentaire), les deux phénomènes étant symptomatiques d'un microbiote dysbiotique rapporté dans l'IBD16.

Ainsi, UC est associée à une expression réduite de HP1γ dans l'épithélium intestinal, tandis que l'inactivation du gène apparenté dans l'intestin de la souris entraîne des caractéristiques typiques de la rupture de l'homéostasie intestinale. Nous avons conclu que dans l'épithélium du côlon, HP1 exerce des fonctions protectrices, véhiculant l'anti-inflammation et l'homéostasie du microbiote.

Nous avons ensuite décrit les fonctions homéostatiques jouées par HP1γ dans l'intestin grêle. L'analyse du transcriptome indiquait un dé-silence des gènes cibles E2F lors de l'inactivation de Cbx3 (Données supplémentaires 2), en accord avec son rôle rapporté dans le contrôle de la division cellulaire médié par le rétinoblastome (Rb)17. Conformément à un effet de l'inactivation de Cbx3 sur le cycle cellulaire, le marqueur de prolifération Ki67 chez les souris mutantes a été détecté de manière ectopique au-delà du compartiment prolifératif normal, s'étendant tout le long des cryptes et à la base des axes des villosités (Fig. 5a supplémentaire). De plus, une impulsion d'une heure de l'analogue de thymine 5-bromo-29-désoxyuridine (BrdU), marquant les cellules en phase S, a entraîné un marquage fréquent des cellules dans le compartiment des cellules souches intestinales (ISC) des souris Cbx3 KO, comme en témoigne l'augmentation significative de la détection des cellules BrdU positives aux positions 0 à +4 de la crypte (Fig. 2a, b). Chez les souris témoins (Ctrl), ce marquage était principalement confiné au compartiment de la descendance immédiate de l'ISC, c'est-à-dire aux cellules d'amplification du transit, tandis que pour l'ISC, BrdU était mal incorporé, ce qui correspond à la phase G1 prolongée des cellules souches18. L'expansion de la niche des cellules souches chez les souris Cbx3 KO a également été documentée par une zone de détection élargie pour le marqueur Olfm4 de la souche (Fig. 5b, c supplémentaires). Enfin, les cultures de matrigel 3D entéroïde ex vivo ont montré une formation accélérée de bourgeons lorsque des cellules ont été collectées à partir de souris Cbx3 KO (Fig. 6a, b supplémentaires). Cependant, lors d'une culture prolongée, le rapport bourgeon par organoïde a considérablement chuté dans les organoïdes dérivés de Cbx3 KO, peut-être à la suite d'un épuisement cellulaire (Fig. 6a, b supplémentaires). Dans les organoïdes, la détection de cellules en phase S par incorporation d'EdU a également révélé des cellules positives aberrantes le long des axes des villosités, les cellules positives d'EdU remplissant la lumière des organoïdes (Fig. 2c et Fig. 6c supplémentaire).

( a ) Immunomarquage avec anticorps anti-BrdU (rouge) et Dapi (bleu) de sections iléales cryptées de souris KO Ctrl et Cbx3 (barre d'échelle: 20 μm) et en ( b ) Quantification des cellules positives BrdU (rouge) vs Dapi (bleu) au niveau du compartiment des cellules souches (position 0 à + 4) n = 3 animaux Ctrl, n = 20 sections; Cbx3 KO n = 15 sections), (c) Image représentative de la co-coloration EdU (rouge)/Dapi (bleu) dans des organoïdes dérivés de souris Ctrl et Cbx3 KO (barre d'échelle : 100 μm) chez n = 3 souris/groupe et la quantification est fournie dans la Fig. oz et al., 2012), les valeurs nominales P bilatérales ont été calculées par GSEA, (e) expression de l'ARNm d'Olfm4 et Ascl2 par RT-qPCR à partir de l'épithélium des villosités des souris KO Ctrl et Cbx3 (n = 3–4 souris/groupe) (f) Immunofluorescence représentative avec anticorps anti-nucléoline, n = 6 souris/groupe (barre d'échelle : 100 μm, 25 μM dans l'insert) (g) Microscopie électronique à transmission représentative (n = 3 souris par condition) caractérisant la structure nucléolaire à la partie supérieure des villosités : en (g-gauche), de l'hétérochromatine (hc) a été observée dans le noyau des souris ctrl et chez les souris Cbx3 KO, des nucléoles canoniques (n) ont été détectés, barre d'échelle = 5 µm, en (g-droite) : Grossissement montrant la zone d'intérêt avec un nucléole canonique chez la souris Cbx3 KO (g : composant granulaire ; fc : centre fibrillaire ; dfc; composant fibrillaire dense) barre d'échelle = 2 µm, (h) niveaux d'expression de l'ARNr 45 S et 18 S dans la crypte et les villosités chez les souris Cbx3 KO (n = 3–4 souris/groupe), (i) Immunofluorescence représentative avec anticorps anti-lysozyme (rouge) et Dapi (bleu) à la crypte iléale (barre d'échelle : 20 μm) et (j) Quantification de la zone d'expression du lysozyme. (n = 6 souris/groupe, avec un total de n = 40 champs/conditions) (k) Expression de l'ARNm de Sis (sucrase isomaltase) dans l'épithélium des villosités (n = 4–8 souris). Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM ; test t de Student bilatéral (b, d, e, h, j, k). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Parallèlement à cette homéostasie proliférative altérée, les villosités des souris mutantes étaient sujettes à des défauts de maturation, comme l'illustre une analyse GSEA, montrant une forte association entre les gènes dérégulés par l'inactivation de Cbx3 et les gènes associés à une signature des cellules souches intestinales, tandis que les réactions RT-qPCR ont révélé une expression accrue des marqueurs de souche Ascl2 et Olfm4 chez les souris mutantes (Fig. 2d, e). Le long de l'épithélium des villosités des souris Cbx3 KO, nous avons également noté l'expression de la nucléoline, un marqueur du nucléole, et des études de microcopie électronique ont fourni des preuves de la présence de structures nucléolaires canoniques dans la partie supérieure des villosités, notamment un composant granulaire, un centre fibrillaire et un composant fibrillaire dense (Fig. 2f, g). Cela contrastait fortement avec le déclin attendu de l'expression de la nucléoline le long de l'axe crypte-villosités (Fig. 2f, g), conséquence de la dilution progressive des ribosomes dans les populations de cellules post-mitotiques prospérant normalement sur les ribosomes hérités des cellules progénitrices19. La production ectopique d'organites nucléolaires a finalement été documentée par une augmentation de la production d'ARNr 18 s observée à la fois dans les cryptes et les villosités, en association avec un enrichissement en gènes impliqués dans la biogenèse ribosomale (Fig. 2h et Fig. 5d supplémentaire). Ainsi, la répression homéostatique des organites nucléolaires survenant au cours de la maturation des cellules épithéliales a été perdue. Il convient de noter que la quantification des lectures cartographiant les rétrotransposons dans les expériences d'ARN-seq a documenté que, contrairement à ce qui avait été rapporté précédemment pour l'inactivation de la méthyltransférase H3K9 Setdb1 dans l'épithélium intestinal, l'inactivation de HP1γ n'a pas entraîné une expression accrue de ces répétitions d'ADN normalement hétérochromatinisées. Ainsi, la dé-silence de l'ADNr et la perte de la répression nucléolaire le long des villosités chez les souris Cbx3 KO ne se sont pas produites dans un contexte de déstabilisation globale des structures hétérochromatiques (Fig. 7 supplémentaire).

Enfin, la production de lignées matures chez les souris Cbx3 KO a été affectée à la fois sur les lignées absorbantes et sécrétoires. De même, l'analyse GSEA des données ARN-seq des deux compartiments a montré des altérations dans les programmes d'expression des gènes de Paneth et d'entérocyte (Fig. 5e, f supplémentaires) et nous avons noté un défaut marqué dans l'expression du lysozyme, un marqueur cellulaire de Paneth, et de la sucrase isomaltase, un marqueur absorbant de différenciation des entérocytes (Fig. 2i, k). Dans l'ensemble, ces données étaient révélatrices d'une dérégulation dans le contrôle de la prolifération cellulaire et dans la production de lignées matures lors de l'épuisement de HP1γ.

Nous avons ensuite cherché à définir les fonctions de HP1γ sur l'homéostasie de l'ARN dans l'épithélium intestinal. La spectrométrie de masse a révélé que les agents d'interaction HP1γ étaient fortement enrichis en composants du spliceosome (Fig. 8a, b supplémentaires et données supplémentaires 6). Parmi eux, nous avons identifié des membres du spliceosome de l'étape catalytique 2 (également appelé complexe spliceosomal C de type U2) et des facteurs d'épissage essentiels à la reconnaissance des sites d'épissage, tels que les protéines riches en Ser/Arg (SR). La remise en question de certaines de ces interactions protéine-protéine avec la RNAse n'a pas suggéré d'implication de molécules d'ARN intervenantes, en accord avec des rapports antérieurs22 (Fig. 8c supplémentaire). Ceci était cohérent avec les études sur le rôle de HP1γ dans la régulation de l'épissage du pré-ARNm6,22. De même, l'analyse des données d'ARN-seq avec le pipeline d'analyse multivariée de l'épissage de transcription (rMATS) a confirmé que l'épissage avait un impact considérable sur l'inactivation de HP1γ. Des variations significatives de l'épissage comprenaient une tendance à une rétention accrue des introns dans l'intestin grêle mais pas dans le côlon, avec une augmentation et une diminution de l'inclusion d'exons alternatifs ont été observées (Fig. 3a et données supplémentaires 7–9, événements d'épissage alternatifs significatifs (FDR <0, 05) dans les épithéliums de la crypte, des villosités et du côlon). Certains de ces événements ont été validés par RT-qPCR (Fig. 9 supplémentaire).

( a ) Types et quantité d'altérations d'épissage détectées dans les épithéliums du côlon, des villosités et des cryptes par rMATS. Les types d'altérations d'épissage sont codés par couleur comme indiqué. SE : exons sautés, MXE : exons mutuellement exclusifs, A3'SS et A5'SS : sites d'épissage alternatifs 3'/5', RI : introns retenus. ( b ) Quantification des jonctions de novo dans les conditions de contrôle (Ctrl) et Cbx3 KO (KO) dans les cryptes, les villosités et les épithéliums du côlon après avoir consolidé les 3 répliques d'ARN-seq de souris ctrl ou Cbx3 KO dans chaque tissu. Les jonctions de novo ont été définies comme des jonctions non annotées dans la version mm9 du génome de la souris et non présentes dans les échantillons WT et mutants. La valeur p indiquée a été calculée avec un test t de Student bilatéral apparié, n = 3 (cryptes, villosités et côlon). La quantification des jonctions de novo dans les neurones de Purkinje de souris WT ou inactivés pour Rbm17 est présentée comme un contrôle positif. ( c ) Score maxEnt consolidé des sites de novo identifiés avec l'approche décrite en ( b ), comparé au score obtenu avec des jonctions annotées, et à ceux obtenus avec des séquences sélectionnées au hasard (noir et bleu, respectivement). Les valeurs indiquées proviennent de Cbx3 KO dans les cryptes, les villosités et le côlon (n = 3 souris, la valeur p a été calculée avec une Anova unidirectionnelle ordinaire). ( d ) Les jonctions de novo ont été quantifiées au niveau des gènes qui, sur le plan de la transcription, étaient affectés moins du double par l'inactivation de Cbx3 KO. Pour chaque condition indiquée, nous avons compté les gènes gagnant deux fois ou plus la jonction de novo (valeur p <0,05). ( e ) Des jonctions de novo dans le côlon (Pkm et Cdh1) ou les villosités (Lmna) ont été visualisées avec un navigateur génomique au voisinage des gènes indiqués. Chaque barre représente un couple donneur/accepteur "de novo", allant du site d'épissage 5' au site d'épissage 3'. (f) Les graphiques à barres montrent le nombre de jonctions de novo détectées au niveau des gènes indiqués au niveau des cryptes, des villosités et du côlon (n = 3 souris pour chaque condition, les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM ; les valeurs p indiquées ont été calculées avec un test t de Student bilatéral). Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

L'absence d'un modèle défini dans l'impact de HP1γ sur l'épissage nous a incités à examiner si ces nombreux événements d'épissage résulteraient d'un épissage bruyant23, comme cela est lié au cancer et à la neurodégénérescence24,25,26,27. À cette fin, nous avons identifié des jonctions d'épissage non annotées présentes dans une seule des deux conditions expérimentales (soit WT ou Cbx3 KO) pour chaque tissu. L'abondance de ces jonctions que nous appellerons désormais "de novo" a été significativement augmentée lors de l'inactivation de Cbx3 (Fig. 3b). Cette augmentation se situait dans une plage similaire à celle observée dans les neurones de Purkinje cérébelleux appauvris en Rbm17, une protéine de liaison à l'ARN censée réprimer l'utilisation de l'épissage cryptique26 (Fig. 3b). Les expériences de RT-PCR ont en outre documenté l'utilisation accrue de sites d'épissage cryptiques au niveau de l'exon ou de l'intron induite par l'inactivation de HP1γ (Fig. 10 supplémentaire).

L'évaluation de la qualité des donneurs et accepteurs d'épissage consensus avec un logiciel dédié a révélé qu'en moyenne, les jonctions de novo avaient un score inférieur à celui des jonctions annotées, mais supérieur aux séquences aléatoires (Fig. 3c). Cela suggérait que l'inactivation de HP1γ favorisait l'utilisation de sites d'épissage consensuels médiocres et augmentait peut-être la plage d'opportunités d'épissage. L'examen des données accessibles au public a identifié plusieurs partenaires moléculaires de HP1γ qui, lorsqu'ils sont inactivés, entraînent une augmentation significative du bruit d'épissage. Ces partenaires comprennent PPL128, un composant de spliceosome de type peptidyl prolyl isomérase, ZC3H13, une protéine à doigt de zinc recrutant des ARN méthyl transférases impliquées dans la modification de la méthylation de la N6-adénosine (m6A)29,30, et la protéine riche en Ser/Arg SRSF531 (Fig. 11 supplémentaire).

Enfin, l'examen du bruit d'épissage induit par l'inactivation de Cbx3 gène par gène a en outre démontré que, pour une grande majorité de gènes non affectés à leur niveau d'expression, le nombre de sites d'épissage actifs était significativement augmenté (Fig. 3d et Données supplémentaires 10 pour la liste des gènes). Ces gènes comprenaient des régulateurs de l'homéostasie intestinale. En particulier, nous avons noté que le gène Pkm, produisant à la fois les ARNm Pkm1 et Pkm2 par épissage alternatif, ce dernier protégeant contre la colite32, montrait une augmentation importante de l'épissage de novo dans le côlon (Fig. 3e, f, panneaux de gauche). De même, le gène Cdh1 codant pour la E-cadhérine, essentielle à la fonction de barrière épithéliale33, et sujet à une terminaison prématurée par épissage alternatif34, a été affecté par l'inactivation de Cbx3 au niveau des cryptes et du côlon (Fig. 3e, f panneaux du milieu). Enfin, nous avons observé un impact particulièrement fort au niveau du gène Lmna avec une multiplication par 9 en moyenne des jonctions de novo au niveau des villosités (Fig. 3e, f, panneau de droite).

L'importance biologique du bruit d'épissage a été mal caractérisée chez les mammifères, ce qui nous a incités à rechercher si l'utilisation accrue de jonctions d'épissage de novo au niveau du gène Lmna dans les villosités dépourvues de HP1γ pourrait entraîner la production de progérine. Le gène LmnA comprend 12 exons et, par épissage alternatif, il produira à la fois l'ARNm de la lamine A et de la lamine C. Parfois, un événement d'épissage rare entraînera également la production de progérine, une version tronquée de la lamine A agissant comme une isoforme de protéine négative dominante responsable du syndrome de Hutchinson Gilford Progeria (HGPS)35,36. Dans ce syndrome de vieillissement prématuré, la production de cette variante d'épissage est facilitée par une mutation génomique augmentant l'utilisation d'un site d'épissage de la progérine qui, dans les cellules normales, est utilisé à faible rendement lors de l'utilisation d'un site d'épissage à faible consensus37.

Nous avons donc appliqué la RT-PCR et la PCR quantitative Taqman à la détection des transcrits de la lamine A et de la progérine dans l'épithélium intestinal de la souris (Fig. 12a et Fig. 4a, b supplémentaires). La RT-PCR au point final utilisant des amorces nichant sur les exons 9 et 12 pour LmnA a montré des preuves de la détection du transcrit de la progérine chez Cbx3 KO mais pas chez les souris Ctrl (Fig. 12a supplémentaire). La PCR quantitative Taqman a en outre documenté une occurrence significativement accrue de l'événement d'épissage spécifique à la progérine lors de l'inactivation de Cbx3 dans l'épithélium des villosités (Fig. 4b). Le séquençage des produits finaux de la PCR a confirmé que ce produit d'épissage était identique à celui détecté chez les souris G609G HGPS (Fig. 4c). L'abondance du produit d'épissage est cependant restée nettement inférieure à celle observée dans l'épithélium du côlon ou de l'intestin grêle de souris Lmna G609G HGPS, en cohérence avec la force accrue de la progérine 5'SS fournie par la mutation37 (Fig. 4b et Supplémentaire Fig. 12b).

(a, b) Taqman Assays lamine A et progérine dans ctrl (n = 4), Cbx3 KO (n = 8), WT et HGPS G609G (n = 4 souris/groupe), test Mann-Witney U (c) Exemples de données de séquençage des produits finaux de PCR Taqman dans des échantillons de villosités Cbx3 KO, fibroblaste embryonnaire de souris (MEF) dérivé de souris G609G utilisé comme contrôle, (d) Imm unoblot avec l'anticorps monoclonal anti-progérine dans des lysats d'épithélium issus de souris Ctrl, Cbx3 KO et comme contrôle interne, Cbx3 fl/fl n'exprimant pas la recombinase Cre traitée au tamoxifène. L'expérience est représentative de 2 répétitions indépendantes, avec un total de n = 4 souris/groupe (e) Immunofluorescence représentative avec anticorps anti-progérine (rouge) et Dapi (bleu), barre d'échelle : 20 μm et en (f) quantification fournie par le pourcentage (%) de cellules exprimant la progérine en fonction de la position le long de l'axe de la crypte iléale (Cbx3 KO n = 23 sections, n = 3 souris). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± SEM, (g) Immunofluorescence avec un anticorps anti-Lamine B1 (vert) marquant l'enveloppe nucléaire (barre d'échelle : 50 μm, insert : 15 μm et en (h) quantification fournie par le pourcentage de cellules avec un noyau déformé, n = 5 à 9 souris dans chaque groupe, comptant respectivement en ctrl = 4 757 noyaux et Cbx3 KO = 29 753 noyaux. Les données sont présenté comme la moyenne ± SEM, test t de Student bilatéral Les données sources sont fournies sous forme de fichier Source Data.

Nous avons ensuite utilisé la PCR de gouttelettes numériques (ddPCR) pour évaluer dans chaque condition le score de pourcentage d'épissage (PSI) de l'événement d'épissage spécifique à la progérine, correspondant à la quantité d'isoforme de progérine divisée par la quantité totale d'isoformes canoniques (lamine A) et de progérine. Dans les cryptes et les villosités Ctrl, nous avons détecté une moyenne de 415 ± 166 copies/ul et 0,16 ± 0,15 copies/ul de produits d'épissage canoniques et spécifiques à la progérine respectivement, tandis que dans le KO Cbx3, ces chiffres s'élevaient à 1566 ± 725 copies/ul pour la lamine A et 2,8 ± 0,42 copies/ul pour la progérine (Fig. 12c supplémentaire). Comme prévu, la détection de la progérine dans l'ADNc dérivé de cellules épithéliales de crypte purifiées de souris HGPS était plus élevée avec 33,86 copies/ul et 11,8 copies/ul de lamin A. Fig. 12d et données supplémentaires 11). Nous avons ensuite recherché si le niveau de transcrit de progérine détecté dans l'intestin grêle des souris Cbx3 KO produisait de la progérine. En utilisant un anticorps monoclonal anti-progérine bien caractérisé (Fig. 13 supplémentaire), nous avons facilement détecté la protéine progérine au niveau des épithéliums des villosités et des cryptes, tel que visualisé par immunoblot (Fig. 4d). Il convient de noter que l'absence de signal de progérine dans Cbx3 fl / fl ne contenant pas de Cre-recombinase inductible a permis d'exclure un effet de l'induction du tamoxifène sur la production de progérine (Fig. 4d). L'accumulation de protéine progérine dans les cryptes et les villosités a été documentée par immunocytochimie (Fig. 14 supplémentaire). Cette approche a révélé que la progérine était principalement détectée au niveau de la descendance immédiate de l'ISC (au-dessus de la position + 4, Fig. 4e, f), témoignant ainsi d'un gradient d'expression de la progérine le long de l'axe crypte-villus chez les souris Cbx3 KO. L'inactivation in vitro de Cbx3 médiée par crispr / Cas9 dans les cellules entérocytaires TC7 a confirmé la production de transcrits de progérine et l'accumulation de protéine progérine nucléocytoplasmique (Fig. 15a, b supplémentaires).

L'accumulation de progérine perturbe principalement la structure de la lame nucléaire38. Nous avons donc examiné si la toxicité de la lamine nucléaire A était détectée lors de l'inactivation de Cbx3. L'observation de l'intestin grêle de souris Cbx3 KO a révélé une déformation de l'enveloppe nucléaire dans une fraction des cellules épithéliales lors de l'immunocoloration de laminB1 (Fig. 4g, h). Des défauts similaires ont également été observés in vitro lors de l'inactivation de Cbx3 (KO) médiée par crispr/Cas9 dans la lignée cellulaire entérocytaire TC7, entraînant des invaginations profondes de la membrane nucléaire détectables par microcopie électronique, reflétant un phénotype de laminopathie (Fig. 15c, d supplémentaires). Dans l'ensemble, ces données ont montré que le défaut HP1γ augmentait la gamme d'opportunités des variants d'épissage de l'ARNm de la lamine A, conduisant ainsi à la production de progérine en l'absence de mutation HGPS dans l'épithélium intestinal.

Les niveaux réduits de HP1γ associés à la RCH (Fig. 1a, b) nous ont conduit à rechercher un bruit d'épissage accru chez les patients RCH. Pour étudier cela, nous avons extrait les données ARN-seq de 206 jeunes patients atteints de CU et de 20 donneurs sains appariés de la grande cohorte multicentrique de CU naïve de traitement PROTECT39. Cet ensemble de données a été sélectionné car il était bien contrôlé et avait une profondeur de séquençage suffisante pour l'analyse d'épissage. La quantification des jonctions de novo a révélé une augmentation hautement significative (valeur P = 10−59) du bruit d'épissage chez les patients atteints de CU, par rapport aux donneurs sains (Fig. 5a). La comparaison des patients UC présentant des niveaux de jonction de novo dans le quartile supérieur à ceux présentant des niveaux dans le quartile inférieur (voir schéma de la Fig. 5b) a en outre révélé qu'un bruit d'épissage élevé était corrélé à une activité accrue des gènes associés à la réponse inflammatoire et à une expression réduite des gènes mitochondriaux, tous deux liés à la gravité de la maladie dans l'étude initiale39 (Fig. 5b, c et données supplémentaires 12, y compris la description des patients UC et les analyses d'enrichissement des annotations fonctionnelles). Conformément à cela, le score de gravité histologique était plus élevé (calculé, valeur p = 0,03). Le bruit d'épissage semblait également avoir une valeur prédictive pour la cicatrisation muqueuse après 4 semaines (4H) de traitement (définie comme calprotectine fécale <250 mcg/gm), car des niveaux élevés de calprotectine fécale 4H étaient plus fréquents dans le quartile supérieur (80 % contre 57 % dans le quartile inférieur) et les patients en rémission étaient moins nombreux (43 % contre 67 % dans le quartile inférieur - Fig. 16a, b supplémentaires). Nous examinons plus en détail le bruit d'épissage par gène, comme chez les souris Cbx3 KO. Sur 2743 gènes examinés, sélectionnés comme étant exprimés dans les biopsies (minimum 10 lectures d'ARN-seq par gène) et non affectés par la RCH (changement d'expression inférieur au double entre donneurs sains et patients RCH), 415 gènes (15 %) ont présenté une augmentation des jonctions de novo > 1,5 fois (p Val < 0,01) chez les patients RCH, tandis que seuls 11 gènes (0,4 %) ont montré des niveaux réduits de ces jonctions. s (Fig. 5d et données supplémentaires 13). Ces gènes comprenaient LMNA (Fig. 5e), nous incitant à examiner la production de progérine dans une cohorte de biopsies coliques. Les ARN totaux ont été extraits de biopsies du côlon de patients atteints de CU (n = 19) et comparés à des individus en bonne santé (n = 17) ou à des patients atteints de la maladie de Crohn (MC) (n = 16) avec atteinte du côlon (Données supplémentaires 14 pour une description détaillée de la population). Les niveaux d'expression de l'ARNm de lamin A et de la progérine ont ensuite été déterminés par des tests taqman, y compris la vérification des produits finaux de PCR par séquençage. Chez les patients atteints de RCH, les niveaux d'événements d'épissage spécifiques à la progérine étaient significativement régulés à la hausse (p Val = 0, 0002) (Fig. 5f, g), alors que la production du produit d'épissage de la lamine A ne l'était pas (Fig. 5h). Aucune corrélation n'a été détectée entre l'expression de l'ARNm de la progérine et l'âge du patient (Fig. 16c supplémentaire). Inversement, chez les patients CD, l'épissage spécifique de la progérine n'était pas affecté (Fig. 5f), tandis que le produit d'épissage spécifique de la lamine A était régulé à la hausse (p Val = 0, 016) (Fig. 5h), cette augmentation concernant principalement les plus jeunes patients CD < 45 ans, comme le montre l'analyse de régression linéaire (Fig. 16d, e supplémentaire).

(a) Quantification des jonctions de novo chez des donneurs sains (Cont, n = 20) et chez des patients atteints de CU (n = 206) à partir des données RNA-seq de la cohorte PROTECT UC (GSE109142). Les jonctions de novo ont été définies comme des jonctions non annotées dans la version hg19 du génome humain et non présentes à la fois chez les donneurs sains et les patients atteints de CU. Les valeurs indiquées ont été normalisées par le nombre total de lectures dans chaque expérience RNA-seq pour tenir compte des variations éventuelles de la profondeur du séquençage. La valeur P a été calculée avec un test t de Student bilatéral non apparié. Le centre de la boîte à moustaches indique la médiane, le (x) indique la moyenne, les limites de la boîte indiquent les 1er et 3e quartiles, les moustaches inférieures et supérieures définissent les minima et les maxima. Lorsque des valeurs aberrantes sont présentes, les moustaches s'étendent à la place de 1,5 fois l'intervalle interquartile. Les valeurs aberrantes sont représentées par des points. (b) Graphique à cordes représentant le nombre de jonctions de novo normalisées pour chaque donneur (en bonne santé en bleu, patients UC en rouge). Les zones encadrées représentent approximativement les patients inclus dans les quartiles indiqués. ( c ) Les gènes exprimés de manière différentielle (> 1, 5 fois, P Val <0, 01) entre les patients des quartiles inférieur et supérieur ont été comparés aux annotations Gene Ontology. Les voies significativement (P val < 0,01) enrichies dans la catégorie des "processus biologiques" sont indiquées. ( d ) Les jonctions de novo ont été quantifiées au niveau des gènes qui, sur le plan transcriptionnel, étaient affectés <1, 5 fois entre les donneurs sains et les patients atteints de CU. Pour chaque condition indiquée, nous avons compté les gènes gagnant une jonction de novo 1,5 fois ou plus (p Val < 0,01). ( e ) Les jonctions d'épissage chez un donneur sain représentatif et un patient UC représentatif ont été visualisées avec un navigateur génomique au voisinage du gène LMNA (indiqué en rouge). Chaque barre représente un couple donneur/accepteur, allant du site d'épissage 5' au site d'épissage 3'. Les histogrammes dans les pistes supérieures représentent la densité de lecture locale dans les données RNA-seq. Le patient atteint de CU a été choisi dans le quartile supérieur mais ne présente pas le nombre de jonctions de novo le plus élevé (f–h) Tests Taqman lamin A et progérine dans les populations témoins (n = 17), maladie de Crohn (MC, n = 16) et colite ulcéreuse (CU, n = 19), l'ADNc a été extrait de biopsies du côlon. Test U de Mann-Witney. (h) exemple de données de séquençage des produits finaux de PCR Taqman chez un patient UC, un fibroblaste humain provenant d'un patient HGPS a été utilisé comme contrôle positif, UC = colite ulcéreuse. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Ainsi, ces observations identifient une dérégulation étendue de la précision d'épissage dans l'UC. Le transcrit de la progérine apparaît comme un marqueur potentiel de la CU et de ce bruit d'épissage accru. Enfin, nos observations soulignent la valeur prédictive de la souris Cbx3 KO dans la modélisation de cette maladie.

Alors que le rôle du métabolisme de l'ARN a été largement décrit dans les maladies neurodégénératives, cardiaques et du vieillissement prématuré40, il était largement inexploré dans les troubles intestinaux. Le présent travail définit HP1γ comme une protéine préservant la précision de l'épissage de l'ARN dans l'épithélium intestinal, limitant l'impact des événements d'épissage non canonique survenant naturellement. L'activité d'épissage non canonique est souvent appelée "bruit d'épissage"23. Alors que dans les modèles animaux non mammifères, l'épissage bruyant peut favoriser la diversité des variants d'épissage d'ARNm, avec des fonctions physiologiques possibles41,42, sa signification chez les mammifères reste insaisissable. Dans ce dernier cas, l'activité d'épissage erronée omniprésente peut être un moteur de l'évolution du génome43, mais elle a également été liée à la pathologie humaine, y compris le cancer et les maladies neurogénératives impliquant l'activation globale de sites d'épissage non canoniques25,26,27,44. Il a été démontré que seules quelques protéines de liaison à l'ARN, notamment Rbm17, hnRNP et TP4326,27, atténuaient l'épissage cryptique à l'échelle mondiale. Sur la base de la présente étude, HP1 peut maintenant être ajouté à cette liste, avec un rôle fondamental dans l'épithélium intestinal. L'effet du déficit en HP1γ sur l'épissage était suffisant pour induire la production de progérine, une variante d'épissage normalement réprimée du gène Lmna en l'absence de mutation HGPS. Plus généralement, les effets de l'inactivation de HP1γ sur l'épissage s'expliquent par une diminution apparemment générale de la précision de l'épissage. Cela a été documenté par les données RNA-seq, dans lesquelles les lectures de jonction étaient de plus en plus détectées au niveau des jonctions d'épissage non annotées et sur les sites avec de très mauvaises séquences consensus de donneur ou d'accepteur. L'effet était également observable par PCR semi-quantitative, produisant un ensemble complexe de produits chez les souris mutantes avec des amorces produisant une seule espèce à partir des tissus de type sauvage. Bien que cette diminution de la rigueur dans la sélection des sites d'épissage puisse avoir plusieurs causes, y compris un découplage possible entre la transcription et l'épissage, nous notons que notre approche protéomique des partenaires moléculaires HP1γ a détecté de nombreux facteurs d'épissage garantissant l'utilisation de sites d'épissage authentiques uniquement. Ceux-ci comprenaient des composants du spliceosome majeur (dépendant de U2) ainsi que des facteurs d'épissage auxiliaires essentiels à la reconnaissance par le spliceosome des séquences consensus. En examinant les données d'inactivation disponibles pour certains de ces facteurs d'épissage, nous avons constaté que leur inactivation entraînait un bruit d'épissage similaire à celui observé lors de l'inactivation de Cbx3. Les facteurs d'épissage examinés comprenaient le SRSF5 riche en Ser / Arg précédemment montré pour réduire la production de progérine en redirigeant l'épissage vers l'utilisation de la lamine A 5'SS37,45, PPL1, un composant de spliceosome de type peptidyl prolyl isomérase dont l'inactivation conduit à des altérations d'épissage avec une utilisation aberrante de sites d'épissage faibles28, ainsi que ZC3H13, une protéine à doigt de zinc régulant les niveaux d'ARN N6-méthyl l'adénosine29, une modification impliquée dans divers aspects du métabolisme de l'ARN, y compris l'épissage de l'ARN46,47,48. Nous proposons ainsi un modèle dans lequel HP1γ réduit le bruit d'épissage en favorisant le recrutement dans la matrice de la chromatine de protéines impliquées dans la précision des décisions d'épissage. La dépendance de HP1γ aux régulateurs auxiliaires de l'épissage peut également être illustrée par son impact régional sur l'épissage, éventuellement en fonction des régulateurs d'épissage disponibles dans chaque type de tissu ou de cellule. En particulier, nous avons noté un gradient d'expression de la progérine le long de l'axe crypte-villus, laissant de côté le compartiment ISC. Ce dernier suggère une modulation de l'épissage possiblement liée à l'état de développement cellulaire, une notion encore soutenue par le modèle HGPS-iPSCs, dans lequel la progérine n'a été observée qu'au moment de l'engagement cellulaire49. Alors que nos données indiquent principalement un impact de HP1γ via le recrutement des spliceosomes, une implication de HP1γ dans la dégradation des produits d'épissage défectueux peut également être envisagée, comme le suggère l'implication de l'homologue HP1 de la levure dans l'escorte des transcrits péricentromériques vers la machinerie de désintégration de l'ARN50.

Avant que le rôle de HP1 ne soit associé à l'épissage, cette protéine était principalement connue comme médiateur du silençage dépendant de l'hétérochromatine, réprimant la transcription au niveau de séquences d'ADN répétées, y compris les loci d'ADNr, et au niveau d'un sous-ensemble de promoteurs de gènes2,17,51,52,53. Notre inactivation de HP1γ dans l'intestin de souris a clairement démontré que la répression transcriptionnelle dépendante de HP1 est essentielle pour la biologie de l'intestin, participant au silence des gènes contrôlant la prolifération et l'inflammation. Ces expériences révèlent également un rôle pour HP1γ au niveau des locus d'ADNr, réprimant les gènes ribosomiques lors de la maturation des cellules épithéliales. Cependant, contrairement à ce qui avait été observé précédemment lors de l'inactivation de la méthyltransférase H3K9 Setdb1 dans l'intestin20,21, ou du triple knock-out de HP1α, HP1β et HP1γ dans le foie54 (Fig. 7 supplémentaire), l'inactivation de HP1γ n'a pas affecté le silence des rétrovirus endogènes (ERV), normalement contrôlés par des structures hétérochromatiques intercalées. De même, l'organisation globale des chromocentres a été préservée lors de l'inactivation de HP1γ. Cependant, la possibilité d'un impact du déficit en HP1γ sur l'intégrité des structures de l'hétérochromatine sans perte globale de l'état de l'hétérochromatine ne peut être exclue à ce stade.

En conclusion, nos observations illustrent les fonctions homéostatiques de HP1γ impliquées dans des activités essentielles à la fois dans l'euchromatine et l'hétérochromatine. Le rôle précédemment décrit de HP1 dans la longévité des tissus à travers les espèces53,55 peut être largement enraciné dans cette polyvalence. Bien qu'aucune maladie humaine n'ait été clairement liée aux mutations du gène HP1, une diminution de l'expression de HP1 a été signalée dans les syndromes de vieillissement accéléré, notamment le syndrome de Werner et le HGPS56,57,58. De même, nous avons identifié une puissante réduction de l'expression de HP1 chez les patients atteints de RCH ainsi que dans des modèles murins pertinents pour cette maladie. À partir de notre modèle de souris Cbx3 KO, nous avons conclu que le déficit en HP1γ peut favoriser des voies aberrantes favorisant à la fois l'inflammation et les défauts d'épissage au niveau des principaux gènes homéostatiques. De même, la détection accrue de progérine dans le tissu du côlon UC nous incite à supposer que, comme ce que nous avons observé chez les souris Cbx3 KO, la variante d'épissage de la lamine A n'est que la "pointe de l'iceberg", indiquant une perturbation plus importante de la précision d'épissage de l'ARN subie par les patients UC, et clairement illustrée par la cohorte de patients PROTECT UC. Encore à ses balbutiements en ce qui concerne les maladies intestinales59,60,61, l'identification de mécanismes reposant sur des dysfonctionnements de l'épissage de l'ARN dans l'intestin chroniquement enflammé devrait transformer notre compréhension du déclin fonctionnel de l'épithélium intestinal des patients atteints de MII.

Des souris C57BL/6 Cbx3fl/fl (fournies par le Dr Florence Cammas, IRCM, Montpellier, France) ont été croisées avec des souris Villin-CreERT2 (fournies par le Dr Cohen-Tannoudji, Institut Pasteur, Paris, France) pour produire le modèle de souris C57BL/6 Villin-creERT2:Cbx3-/- (cette étude). Les souris C57BL/6 hétérozygotes LmnaG609G/G609G (appelées ici souris HGPS) ont été fournies par le Dr Maria Eriksson (Karolinska Institutet, Suède). Des souris mâles et femelles ont été nourries avec un régime alimentaire standard (SD) pour rongeurs (2018 Teklad Global 18% Protein Rodent Diet, Harlan) composé de 60% de glucides nourris ad libitum. Les animaux ont été maintenus sous un cycle de lumière allumé/éteint de 12 h/12 h (8 h/20 h), une température de 22 °C ± 2 et une humidité comprise entre 50 et 70 %. Le tamoxifène (0,5 mg/g) dilué dans de l'acide clinoléique à 20 % a été administré par gavage oral, à raison de 3 doses tous les 5 jours comme décrit62. Les souris témoins ont reçu 20 % d'acide clinoléique seul par gavage oral. Des témoins supplémentaires utilisant des souris Cbx3fl/fl qui n'expriment pas la recombinase Cre ont été traités de manière identique avec du tamoxifène. Toutes les expériences utilisant le modèle de souris Villin-creERT2:Cbx3-/- ont été réalisées avec des souris mâles ou femelles âgées de 2 à 3 mois. BrdU (Sigma) a été injecté par voie intrapéritonéale (ip) à 100 μg/g de poids corporel animal, 1 h avant le sacrifice. Les études animales ont été approuvées par le comité d'éthique de l'Université Paris Descartes (numéro d'autorisation 17-022).

Tous les patients ont été suivis dans le service de gastro-entérologie (hôpital Beaujon, Paris). Le protocole a été approuvé par le comité d'éthique local (CPP-Ile de France IV n°2009/17 et n°2014-A01545-42) et un consentement éclairé écrit a été obtenu de tous les patients avant l'inscription. Une biopsie par pincement colique permettant l'extraction de la couche épithéliale a été obtenue lors d'un examen endoscopique dans des zones non enflammées pour permettre une comparaison avec les tissus sains de la population témoin. Les biopsies ont été réalisées dans le côlon droit ou gauche ou en cas de cancer à au moins 10 cm du site cancéreux. Pour l'étude immuno-histologique, 26 patients ont été inclus, dont 10 témoins sains et 16 patients RCH (détaillé de la population fournie dans les Données supplémentaires 1). Pour l'étude transcriptionnelle, 56 patients ont été inclus, dont 17 témoins sains, 19 patients atteints de CU et 16 patients CD avec atteinte colique (détaillé de la population fournie dans les données supplémentaires 12). L'ARN total a été extrait de biopsies humaines avec RNAble (Eurobio) et quantifié à l'aide d'un spectrophotomètre ND-1000 NanoDrop (NanoDrop Technologies). La transcription inverse de l'ARNm total a été réalisée à l'aide de M-MLV RT (Invitrogen) selon les recommandations du fabricant.

Des patients atteints de fibroblastes dermiques humains porteurs de la mutation HGPS p.Gly608Gly ont été obtenus auprès du Coriell Cell Repository. Caco2 (cellules TC7, authentifiées par ECACC) ont été utilisées pour générer la lignée cellulaire Cbx3 médiée par CRISPR/Cas9. Le vecteur pSpCas9(BB)-2A-GFP (PX458) exprimant l'endonucléase Cas9 (cadeau de Feng Zhang, plasmide Addgene # 48138) a été lié à un ARN à guide unique (ARNsg) conçu spécifiquement pour le gène Cbx3. Deux guides de séquence (GAAGAAAATTTAGATTGTCC et GAATATTTCCTGAAGTGGAA) ont été définis par le logiciel ZiFiT Targeter Version 4.2. L'insertion du guide de séquence a été réalisée dans le site de restriction BbsI du vecteur PX458 et le contrôle par séquençage. La transfection dans les cellules TC7 a été réalisée par lipofectamine 2000 et des clones simples pour chaque guide de séquence ont été sélectionnés par FACS en fonction du signal GFP. Les transfections dans HEK293T ont été réalisées par des précipités d'ADN-phosphate de calcium en utilisant 5 µg de vecteur d'expression pLVX pour Flag-V5 tagged Tomato, SRp20, RBM39 ou TRA2β63 et avec 5 µg de pSG5-HA64.

L'intestin (iléon ou côlon) a été recueilli et lavé avec du PBS à 4 ° C et coupé en morceaux d'environ 5 mm. Les fragments intestinaux ont été fixés avec du formol pendant une nuit à 4 °C. Une fois fixés, les fragments intestinaux ont été inclus dans des blocs de paraffine. Les coupes en paraffine ont été réalisées au microtome Leica RM2125 RTS, d'une épaisseur de 4 μm. Par la suite, le déparaffinage et la réhydratation des échantillons ont été effectués par immersion dans du xylène (2 × 10 min), de l'éthanol absolu 5 min, de l'éthanol à 90 % 5 min, de l'éthanol à 70 % 5 min et de l'eau distillée (2 × 5 min), le tout à température ambiante. .1 M de glycine dans du PBS pendant 15 min, 3 % de BSA dans du PBS pendant 30 min et 0,5 % de Triton X-100 dans du PBS pendant 2 h (tissu de souris). En cas de coloration à la nucléoline, les coupes de tissu ont été incubées pendant 1 min à TA avec de la protéinase K 0,05 mg/ml, suivies d'un lavage avec de la glycine 2 mg/ml pendant 15 min à TA. Ils ont ensuite été incubés avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 °C, lavés avec du Tween-20 à 0,05 % dans du PBS, incubés pendant 1 h dans l'anticorps secondaire spécifique conjugué à Alexa 488 ou Cy3 (Jackson, USA), 15 min avec du DAPI (1μg/ml), lavés dans du PBS et montés avec le milieu antifading VECTASHIELD® (Laboratoires Vector). Anti-HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific), HP1α (2H4E9, Novus Biologicals), Ki67 (ab16667, Abcam), Olmf4 (D6Y5A, Signalisation cellulaire), BrdU (MA3-071, Thermo Scientific), laminB1 (ab65986, Abcam), Progérine (13A4DA, sc-81 611, Santa Cruz), γTubulin (4D11, Thermo Scientific) et Nucleolin (ab22758, Abcam) ont été utilisés comme anticorps primaires. Les noyaux ont été colorés à l'aide de 4, 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI, 62248, Thermo Scientific).

Les images de microscopie ont été obtenues avec un microscope à éclairage structuré ZEISS Apotome.2 (Zeiss, Allemagne), en utilisant un objectif à huile 63 × (1, 4 NA). Pour éviter le chevauchement des signaux, les images ont été obtenues par excitation séquentielle à 488 et 543 nm afin de détecter A488 et Cy3, respectivement. Les images ont été traitées à l'aide du logiciel ZEISS ZEN lite. L'analyse quantitative du signal d'immunofluorescence a été réalisée sur ImageJ. Les valeurs sont représentées par l'intensité de fluorescence moyenne, par rapport aux échantillons de contrôle.

La technique a été adaptée de Nigro et al., 201965. L'intestin grêle ou le côlon ont été prélevés et lavés avec du PBS à 4 ° C et coupés en morceaux d'environ 5 mm de longueur. Pour l'isolement épithélial, les fragments intestinaux ont été incubés 30 min à 4 ° C dans 10 mM d'EDTA, après quoi ils ont été transférés dans du BSA 0,1% dans du PBS et vortexés 30 à 60 s. Les surnageants (contenant les cellules épithéliales) ont été filtrés avec un tamis cellulaire de 70 µm. A cette étape, les cryptes ont traversé la passoire cellulaire et les villosités y ont été retenues. Les fractions de crypte et de villosités ont ensuite été centrifugées séparément et les culots ont été congelés dans de l'azote liquide jusqu'à leur traitement. La qualité de la séparation a été accessible par l'expression de l'expression sélective des marqueurs de souche dans les cryptes mais pas dans les villosités, comme le confirme le séquençage de l'ARN. Pour la production d'organoïdes, le culot de crypte a été désagrégé et cultivé dans du Matrigel comme décrit65. La coloration EdU a été réalisée à l'aide du kit de prolifération cellulaire Click-iT™ EdU pour l'imagerie (Thermo fisher), conformément aux indications du fabricant.

Dans les cellules TC7, la microscopie électronique à transmission (MET) a été réalisée par la méthode de cryofixation/congélation. Les cellules ont été fixées pendant une nuit à 4 ° C avec 3, 7% de paraformaldéhyde, 1% de glutaraldéhyde, dans un tampon cacodylate 0, 1 M. Après fixation, les cellules ont été culottées et contrastées avec du tétroxyde d'osmium (OsO4) et de l'acétate d'uranyle. Ensuite, les cellules ont été incluses dans un milieu de congélation-substitution pendant au moins 3 jours à -80 ° C, déshydratées dans des concentrations croissantes de méthanol à - 20 ° C, incluses dans du Lowicryl K4 M à - 20 ° C et polymérisées sous irradiation ultraviolette. Des coupes ultrafines ont été montées sur des grilles de nickel, colorées avec du citrate de plomb et de l'acétate d'uranyle et examinées avec un microscope électronique JEOL 1011.

Des fragments de tissu intestinal d'environ 500 mm ont été fixés pendant une nuit à 4 ° C avec 3, 7% de paraformaldéhyde, 1% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0, 1 M pendant une nuit à 4 °. De petits fragments de tissu ont été lavés dans un tampon cacodylate 0, 1 M, déshydratés dans des concentrations croissantes de méthanol à -20 ° C, inclus dans du Lowicryl K4 M à -20 ° C et polymérisés sous irradiation ultraviolette. Des sections ultrafines ont été montées.

L'ARN total a été extrait à l'aide de Trizol (TR-118, Molecular Research Center, Inc.) en suivant les instructions du fabricant et le traitement à l'ADNase. Les échantillons d'ARN ont été quantifiés à l'aide d'un spectrophotomètre (Nanodrop Technologies ND-1000). L'ADNc premier brin a été synthétisé par RT-PCR en utilisant un kit de synthèse d'ADNc RevertAIT H Minus First Strand (Thermo Scientific). La qPCR a été réalisée à l'aide du système Mx3005P (Stratagene) avec pièce jointe d'automatisation. Pour la progérine de souris et la PCR semi-quantitative de la lamine A, des amorces imbriquées sur les exons 9 et 12 ont été utilisées (F : GTGGAAGGCGCAGAACACCT R : GTGAGGGGGGAGCAGGTG), comme indiqué66. Pour l'amplification par PCR en temps réel, le test TaqMan a été utilisé avec des amorces préconçues pour la GAPDH de souris (Mm99999915_g1), la lamine A de souris qui ne reconnaît pas la progérine ou l'ADN (ID de test : APGZJEM), la progérine de souris (F : ACTGCAGCGGCTCGGGG R : GTTCTGGGACTCTGGGCT et la sonde : CGCTGAGTACAACCT). Ces paires amorce-sonde ont ensuite été utilisées pour le test TaqMan ddPCR sur des échantillons d'ADNc. Une PCR numérique de gouttelettes (ddPCR) a été réalisée sur des échantillons d'ADNc à l'aide du test basé sur la sonde TaqMan décrit précédemment pour l'amna de souris et la progérine avec ddPCR Supermix pour les sondes (Bio-Rad). Des gouttelettes ont été générées à partir du mélange réactionnel à l'aide d'un générateur de gouttelettes (Bio-Rad QX200). L'amplification par PCR a été réalisée comme suit : après activation enzymatique à 95 °C pendant 10 min (1 cycle), 50 cycles de deux étapes pendant 20 s à 95 °C, 40 s à 60 °C, suivis d'une désactivation enzymatique de 10 min à 98 °C. Les gouttelettes de PCR ont été mesurées dans le lecteur de gouttelettes automatisé (Bio-Rad QX200). Le nombre de transcrits bruts par μl a été calculé par le logiciel Quantasoft (Bio-Rad). Pour chaque échantillon et transcriptions, au moins deux expériences répétées ont été réalisées.

Pour détecter la lamine A et la progérine dans les ADNc humains, les paires amorce-sonde étaient les suivantes : lamine A humaine (F : TCTTCTGCCTCCAGTGTCACG R : AGTTCTGGGGGCTCTGGGT et sonde ACTCGCAGCTACCG), progérine humaine (F : ACTGCAGCAGCTCGGGG R : TCTGGGGCTCTGGGCTCCT et sonde CGCTGAGTACAACCT), GAPDH humain (Hs0026670 5_g1). Pour la qPCR basée sur SYBRGreen (Takara), les amorces suivantes ont été utilisées : souris Ascl2 (F : GGT GAC TCC TGG TGG ACC TA ; R : TCC GGA AGA TGG AAG ATG TC) souris Olfm4 (F : ATC AGC GCT CCT TCT GTG AT R : AGG GTT CTC TCT GGA TGC TG) souris TNF-α (F : GATCTCAAAGACAACCAACATGTG R : CTCCAGCTGGAAGACTCCTCCCAG) souris IL1-β (F:TACAGGCTCCGAGATGAACAAC R: TGCCGTCTTTCATTACACAGGA) souris IL6 (F: ACTTCCATCCAGTTGCCTTCTT R: CAGGTCTGTTGGGAGTGGTATC) souris Sucrase isomaltase (F: CGTGCAAATGGTGCCGAATA R: TCCTGGCCA TACCTCTCCAA) GAPDH (F: TG ACCACAGTCCATGCATC ; R : GACGGACACATTGGGGGTAG) souris 45 S (F : GAACGGTGGTGTGTCGTT ; R : GCGTCTCGTCTCGTCTCACT). Souris 18 S : (F : GATGGTAGTCGCCGTGCC ; R : CCAAGGAAGGCAGCAGGC).

Pour la validation de l'épissage dans les tissus intestinaux de souris, le package MAJIQ a été utilisé pour détecter les gènes épissés de manière différentielle entre Cbx3 KO et les souris Ctrl. Pour chaque échantillon, le nombre de lectures couvrant les jonctions indiquées a été utilisé pour calculer la proportion de chaque jonction impliquant la source et les exons cibles, et représenté sous forme d'histogrammes de pourcentage de la variante indiquée. L'indice d'épissage (Δψ) a été calculé à l'aide de la formule Δψ = variant1/(variant1 + variant2) et a été représenté sous la forme d'un rapport ou d'un pourcentage, comme indiqué sur les Fig.s. Les 6 échantillons RNA-seq ont été utilisés pour calculer les moyennes (± écart) et la valeur p avec le test t de Student (bilatéral) : P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***). Les amorces utilisées pour les validations d'épissage sont décrites dans le tableau supplémentaire 1 dans les informations supplémentaires.

L'ARN total a été extrait des cellules épithéliales témoins et Cbx3 KO de l'intestin grêle (cryptes et villosités) et de l'épithélium du côlon (n = 3 pour chaque groupe de souris, donc au total 6 × 3 = 18 échantillons d'ARN) par extraction au thiocyanate de guanidinium-phénol-chloroforme et traitement à la DNAse, conformément aux spécifications du fabricant. La préparation et le séquençage de la bibliothèque d'ARN total ont été effectués par Novogene Co., Ltd, en tant que service de séquençage d'ARNlnc, y compris la préparation de bibliothèque directionnelle d'ARNlnc avec déplétion d'ARNr (kit magnétique Ribo-Zero), la quantification, la mise en commun et le séquençage PE 150 (données brutes 30 G) sur la plate-forme Illumina HiSeq 2500. Le filtrage et le découpage des données de séquençage de l'ARN ont laissé environ 230 à 300 millions de paires de lectures/échantillon.

L'analyse de l'expression génique et l'analyse de l'épissage différentiel ont été réalisées par Novogene Co., Ltd, en utilisant le package DESeq2 (v1.18.1)67 et rMATS (v4.1.0)68 (paramètres : --libType fr-firststrand –novelSS), respectivement, sur le génome de référence de la souris mm10. Pour l'évaluation des sites d'épissage cryptique, les données internes d'ARN-seq et les données d'ARN-seq Rbm17 KO accessibles au public (GEO GSE79020) ont été réalignées sur le fichier d'annotation mm9 de souris d'Ensembl (version 67). Les données RNA-seq de la cohorte PROTECT ont été alignées sur le fichier d'annotation GRCh37/hg19 humain d'Ensembl. Les fichiers BAM résultants ont été utilisés pour générer des fichiers bigwig, en utilisant bamCoverage (paramètre : --normalizeUsing CPM) de Deeptools (v3.1.3)69. Les coordonnées des jonctions annotées et non annotées ont ensuite été extraites des fichiers BAM à l'aide de regtools (https://github.com/griffithlab/regtools). Pour chacune des 6 conditions, les jonctions non annotées des 3 répétitions ont été regroupées, avant d'éliminer les jonctions présentes à la fois dans les conditions WT et KO. Enfin, les jonctions s'étendant sur plus de 20 kb ont été filtrées en tant qu'artefacts possibles de l'alignement. Les jonctions restantes, jamais partagées entre les échantillons WT et mutants, ont été considérées comme de novo. Pour quantifier la force des sites d'épissage, des séquences d'ADN comprenant les 3 derniers nucléotides de l'exon et les 6 premiers nucléotides de l'intron ont été récupérées pour l'extrémité 5' de la jonction. Pour l'extrémité 3' de la jonction, les séquences des 20 derniers nucléotides de l'intron et des 3 premiers nucléotides de l'exon ont été récupérées. Ensuite, la force des sites d'épissage a été calculée pour chaque jonction à l'aide de l'algorithme MaxEnt69. L'algorithme MaxEnt a également été appliqué aux jonctions aléatoires générées en appliquant la fonction "shuffle" de la suite bedtools (v.2.25.0)70 aux fichiers de lit contenant des jonctions de novo.

Pour la quantification des éléments LTR, les données RNA-seq internes et les données HP1 triple KO RNA-seq (GEO GSE119224) ont été cartographiées sur le génome de la souris mm10 avec l'annotation Ensembl (version 95) à l'aide de STAR (v2.6.0b)71 (paramètres : --outFilterMismatchNmax 1 --outSAMmultNmax 1 --outFilterMultimapNmax 30). La quantification des lectures dans les différentes familles LTR a été réalisée avec featureCounts (v1.6.1)72 de la suite Subread (paramètres : -s 2 pour GSE119244 et paramètres : -p -B -C -s 2 pour Colon, Crypt et Villi). Les familles LTR (ERK, ERV1, ERVL et ERL-MaLR) ont été extraites du UCSC mm10 RepeatMasker.

L'analyse GSEA a été effectuée (avec -nperm 1000 -permute gene_set -collapse false parameters) en utilisant la même matrice d'expression (v2.2.2), en comparant les échantillons ctrl et Cbx3 KO au niveau de la crypte, des villosités et du côlon. Les signatures transcriptionnelles utilisées pour l'analyse ont été extraites de la littérature pour la signature lgr5 ISC73, les signatures des cellules entérocytes et Paneth74 et les bases de données GSEA (ensemble de gènes MSigDB).

L'ADN génomique a été obtenu à partir d'échantillons fécaux à l'aide du kit d'ADN fécal QIAamp power (Qiagen) et la quantité d'ADN a été déterminée à l'aide d'un fluoromètre TECAN (kit de dosage Qubit® dsDNA HS, Invitrogen). La région hypervariable V3-V4 du gène de l'ARNr 16S a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces suivantes : une amorce de fusion directe de 43 nucléotides 5′CTT TCC CTA CAC GAC GCT CTT CCG ATC TAC GGR AGG CAG CAG3 consistant en l'adaptateur illumina de 28 nt (police en gras) et l'amorce bactérienne à large gamme de 14 nt 343 F et une amorce de nucléotide inverse de 47 fusion 5′GGA GTT CAG ACG TGT GCT CTT CCG ATC TTA CCA GGG TAT CTA ATC CT3′ consistant en l'adaptateur illumina de 28 nt (police en gras) et l'amorce bactérienne à large spectre de 19 nt 784 R. polymérase, MolTaq 16S ADN polymérase (Molzym). Les amplifications ont été réalisées selon le profil suivant : 1 cycle à 94 °C pendant 60 s, suivi de 30 cycles à 94 °C pendant 60 s, 65 °C pendant 60 s, 72 °C pendant 60 s, et se terminant par une étape à 72 °C pendant 10 min. Les réactions PCR ont été envoyées sur la plateforme @Bridge (INRAe, Jouy-en-Josas) pour séquençage à l'aide de la technologie Illumina Miseq. Un multiplexage unique a été effectué en utilisant un indice de 6 pb fait maison, qui a été ajouté au R784 lors d'une deuxième PCR avec 12 cycles en utilisant une amorce directe (AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGAC) et une amorce inverse (CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-index GTGACTGGAGGTTCAGACGTGT). Les produits PCR résultants ont été purifiés et chargés sur la cartouche Illumina MiSeq conformément aux instructions du fabricant. La qualité de l'exécution a été vérifiée en interne à l'aide de PhiX, puis des séquences ont été attribuées à son échantillon à l'aide de l'index précédemment intégré. Des lectures filtrées de haute qualité ont ensuite été assemblées et traitées à l'aide du pipeline FROGS (Find Rapidly OTU with Galaxy Solution) pour obtenir les OTU et leur affectation taxonomique respective grâce à l'instance Galaxy (https://migale.inra.fr/galaxy). Dans chaque ensemble de données, plus de 97 % des séquences appariées ont été assemblées en utilisant au moins un chevauchement de 10 pb entre les séquences directes et inverses. Les étapes successives suivantes impliquaient le débruitage et le regroupement des séquences en OTU à l'aide de SWARM, l'élimination des chimères à l'aide de VSEARCh. Ensuite, les abondances de grappes ont été filtrées à 0,005 %. Cent pour cent des clusters ont été affiliés à l'OTU en utilisant une base de données de référence silva138 16 S et la procédure d'attribution taxonomique du classificateur RDP (Ribosomal Database Project). Les indices de richesse et de diversité de la communauté bactérienne, ainsi que le regroupement et les ordinations, ont été calculés à l'aide du package Phyloseq (v 1.19.1) dans le logiciel RStudio75. La divergence dans la composition de la communauté entre les échantillons a été évaluée quantitativement en calculant l'indice de diversité β (UniFrac et matrices de distance UniFrac pondérées). Pour la carte thermique, un modèle binomial négatif a été ajusté à chaque OTU, en utilisant DESeq267 avec des paramètres par défaut, pour estimer les changements logarithmiques d'abondance (FC). Les valeurs de P ont été corrigées pour les tests multiples en utilisant la procédure de Benjamini-Hochberg pour contrôler le taux de fausse découverte et les OTU significatives ont été sélectionnées en fonction de la taille de l'effet (FC> | 2 |, valeur P ajustée < 0,05).

Les éluats d'immunoprécipitation ont été digérés selon un protocole FASP76 légèrement modifié. En bref, les protéines ont été réduites en utilisant 100 mM de DTT (dithiothréitol) pendant 1 h à 60 °C. Les protéines ont été alkylées pendant 30 min par incubation dans l'obscurité à température ambiante avec 100 µL d'iodoacétamide 50 mM. Les échantillons ont été digérés avec 2 µL de trypsine modifiée de qualité séquençage (Promega, WI, USA) pendant 16 h à 37 °C. Les peptides ont été recueillis par centrifugation à 15 000 × g pendant 10 min suivi d'un lavage avec du bicarbonate d'ammonium 50 mM et séchés sous vide.

Les peptides ont été remis en suspension dans 21 µL d'ACN à 10 %, TFA à 0,1 % dans de l'eau de qualité HPLC avant l'analyse MS. Pour chaque cycle, 5 µL ont été injectés dans un nanoRSLC-Q Exactive PLUS (RSLC Ultimate 3000) (Thermo Scientific, Waltham MA, USA). Les peptides ont été chargés sur une précolonne µ (Acclaim PepMap 100 C18, cartouche, 300 µm id × 5 mm, 5 µm) (Thermo Scientific) et ont été séparés sur une colonne de chromatographie liquide en phase inversée de 50 cm (0,075 mm ID, Acclaim PepMap 100, C18, 2 µm) (Thermo Scientific). Les solvants de chromatographie étaient (A) 0,1 % d'acide formique dans l'eau et (B) 80 % d'acétonitrile, 0,08 % d'acide formique. Les peptides ont été élués de la colonne avec le gradient suivant 5–40 % B (38 min), 40–80 % (1 min). A 39 min, le gradient reste à 80% pendant 4 min et, à 43 min, il revient à 5% pour rééquilibrer la colonne pendant 16 min avant l'injection suivante. Deux blancs ont été exécutés entre chaque série pour éviter le report d'échantillon. Les peptides élués de la colonne ont été analysés par MS/MS dépendant des données, en utilisant la méthode d'acquisition top-10. Les peptides ont été fragmentés en utilisant une dissociation collisionnelle à plus haute énergie (HCD). En bref, les paramètres de l'instrument étaient les suivants : la résolution a été réglée sur 70 000 pour les scans MS et 17 500 pour les scans MS/MS dépendants des données afin d'augmenter la vitesse. La cible MS AGC a été fixée à 3,106 coups avec un temps d'injection maximal fixé à 200 ms, tandis que la cible MS/MS AGC a été fixée à 1,105 avec un temps d'injection maximal fixé à 120 ms. La plage de balayage MS était de 400 à 2000 m/z.

Les fichiers bruts correspondant aux protéines immunoprécipitées ont été analysés à l'aide du logiciel MaxQuant 1.5.5.1 par rapport à la base de données Human Uniprot KB/Swiss-Prot 2016-0177. Pour rechercher la masse mère et les ions fragmentés, nous avons défini un écart de masse de 3 ppm et 20 ppm respectivement, aucune correspondance entre les exécutions n'est autorisée. La carbamidométhylation (Cys) a été définie comme une modification fixe, tandis que l'oxydation (Met) et l'acétylation N-terme ont été définies comme des modifications variables. Les taux de fausses découvertes (FDR) au niveau des protéines et des peptides ont été fixés à 1 %. Les scores ont été calculés à l'aide de MaxQuant comme décrit précédemment77. Les peptides ont été quantifiés en fonction des intensités de signal MaxQuant MS1. Des analyses statistiques et bioinformatiques, y compris un tracé de volcan, ont été réalisées avec la version 1.6.7.0 du logiciel Perseus (disponible gratuitement sur www.perseus-framework.org). Pour la comparaison statistique, nous avons défini deux groupes, IP et contrôle négatif, contenant chacun 3 répétitions biologiques. Nous n'avons alors retenu que les protéines quantifiées 3 fois dans au moins un groupe. Ensuite, les données ont été imputées pour combler les points de données manquants en créant une distribution gaussienne de nombres aléatoires avec un écart type de 33 % par rapport à l'écart type des valeurs mesurées et 3 écart type vers le bas de la moyenne pour simuler la distribution des valeurs de signal faibles. Nous avons effectué un test T et représenté les données sur un volcan (FDR < 0,05, S0 = 1).

Les cellules HEK293T (CRL-1573, ATCC) ou HeLa (CCL-2, ATCC) ont été extraites dans du tampon TNEN300 : 0,1 (Tris 50 mM pH 8, NaCl 300 mM, NP40 0,1 %, RNasin 1 U/µl (Promega), inhibiteur de protéase 1X (Roche)) pendant 30 min sur de la glace avec remise en suspension à travers le manomètre de la seringue. La chromatine dénaturée a été éliminée par pipetage. Les extraits ont été dilués à 150 mM de NaCl et la moitié a été complétée par 0,2 µg/mL de RNaseA (sans DNase, Roche) ou par 0,1 U/µL de RNasine. Un quart de la boîte de 10 cm a été immunoprécipité pendant une nuit à 4 ° C sur roue par 3 µg d'anticorps anti-V5 pour les cellules HEK293 transfectées et par 1,5 µg d'anticorps anti-SRSF1 pour les cellules HeLa. Les complexes ont été récupérés par des dynabeads de protéine G (Dynal) pendant 2 h à 4 ° C sur roue. Les billes ont été lavées 5 fois dans 1 mL de TNEN150 : 0,1 pendant 7 min à 4 °C sur roue avant dénaturation dans un tampon de chargement à 100 °C pendant 10 min. Les protéines ont été résolues sur SDS-PAGE critère 4–12 % (Bio-Rad).

Des cellules épithéliales intestinales purifiées de souris (au moins n = 3 expériences distinctes) ont été lysées à 4 °C dans un tampon contenant 25 mM de Tris pH 7,5, 1 mM d'EDTA, 0,1 mM d'EGTA, 5 mM de MgCl2, 1 % de NP-40, 10 % de glycérol, 150 mM de NaCl, puis éliminées par centrifugation à 14 000 tr/min pour 30 min à 4 °C. Les protéines ont été séparées sur des gels SDS-PAGE et transférées sur des membranes de nitrocellulose par des procédures standard. Les anticorps suivants ont été utilisés : anticorps monoclonal anti-progérine de souris (13A4DA, sc-81611, Santa Cruz, dilution 1/50), anti-HP1α (2H4E9, Novus Biologicals, dilution 1/100), HP1β (1MOD-1A9, Thermo Scientific, dilution 1/100) et HP1γ (2MOD-IG6, Thermo Scientific, dilution 1/100) et γ Tub anticorps anti-uline (4D11, Thermo Scientific, dilution 1/2000). anti-HA (12CA5, Sigma, Dilution 1/1000), anti-Flag M2 (Sigma, dilution 1/1000), anti-V5 (Bethyl A190-120A, dilution 1/1000), anti-SRSF1 (Santa Cruz sc-33652, dilution 1/250), anti-Rabbit IgG Bright700 (BioRad, dilution 1/5000), anti-souris IgG Bright700 (BioRad, dilution 1/5000). Le signal Western blot a été acquis avec Chemidoc Imaging (Bio Rad).

Les analyses statistiques ont été réalisées avec le logiciel GraphPad Prism. Les différences entre les groupes ont été analysées à l'aide d'un test t de Student bilatéral à l'aide de GraphPad Prism. Dans tous les cas, les données expérimentales ont été supposées satisfaire aux exigences du test t (distribution normale et variance similaire) ; dans les cas où l'hypothèse du test t n'était pas valide, une méthode statistique non paramétrique a été utilisée (test de Mann-Whitney). Les différences entre trois groupes ou plus ont été testées par ANOVA unidirectionnelle. Une valeur de p < 0,05 était considérée comme significative. Les barres d'erreur indiquent l'erreur standard de la moyenne.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données RNA-seq, les fichiers mm9.bigwig dérivés et les fichiers de novo junction.bed générés dans cette étude ont été déposés dans la base de données NCBI Gene Expression Omnibus et sont accessibles via le numéro d'accession GEO Series GSE192800. Les données de protéomique ont été déposées auprès du Consortium ProteomeXchange via le référentiel partenaire PRIDE avec l'identifiant d'ensemble de données PXD031580. Les données de séquençage du gène de l'ARNr 16 S générées dans cette étude sont disponibles via les numéros d'accès BioProject PRJNA803986.

Les fichiers fastq bruts RNA-seq de GSE109142 (cohorte UC PROTECT), GSE145309 (souris ES Crispr KO Zc3h13) et GSE119244 (triple knock-out du foie de souris HP1α, HP1β et HP1γ) ont été obtenus à partir de la base de données GEO du NCBI. PRJNA669300 (cerveaux Ppil1A99T/A99T KI E14.5) et PRJNA708182 (cœur de souris SRSF5 KO) ont été obtenus à partir de la base de données de BioProject. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions Florence Cammas pour la fourniture des souris Cbx3fl/fl. Nous remercions le Dr Zhou Zhongjun (Département de biochimie, Faculté de médecine Li Ka Shing de l'université de Hong Kong) de nous avoir fourni le MEF de souris HGPS. Nous remercions le Dr Cohen-Tannoudji d'avoir fourni les souris Villin-CreERT2 (Institut Pasteur, Paris, France). Ce travail a été soutenu par la bourse de l'Agence Nationale de la Recherche (ANR) (EPI-CURE, R16154KK par LA) et REVIVE (par CM), un programme ANR "Laboratoire d'Excellence" (2011-2021).

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Jorge Mata-Garrido, Yao Xiang, Yunhua Chang-Marchand, Caroline Reisacher, Elisabeth Ageron & Laurence Arbibe

Proteomics platform Necker, Université Paris Cité-Structure Fédérative de Recherche Necker, INSERM US24/CNRS UAR3633, 75015, Paris, France

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Groupe Nanomédecine, Institut Valdecilla-IDIVAL, 39011, Santander, Espagne

Iñigo Casafont

Département d'anatomie et de biologie cellulaire, Faculté de médecine, Université de Cantabrie, 39011, Santander, Espagne

Iñigo Casafont

Micalis Institute, Institut National de Recherche pour L’agriculture, L’alimentation et L’environnement (INRAE), AgroParisTech, Université Paris-Saclay, UMR1319, F-78350, Jouy-en-Josas, France

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Aurelia Bruneau & Claire Cherbuy

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Xavier Treton, Anne Dumay & Eric Ogier-Denis

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Xavier Tréton

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Sorbonne Université, Institut de Biologie Paris-Seine (IBPS), Unité CNRS Adaptation Biologique et Vieillissement (B2A), Épigénétique et métabolisme des ARN dans les maladies humaines, 75005, Paris, France

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Département des biosciences et de la nutrition, Centre de médecine innovante, Karolinska Institutet, SE-141 57, Huddinge, Suède

Gwladys Revêchon & Maria Eriksson

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JM-G. conçu et réalisé la plupart des expériences et participé à la rédaction de l'article ; YX a réalisé des expériences sur l'épissage et YC-M. sur des souris HGPS ; CR a réalisé des expériences QPCR sur des souris Cbx3 KO et des patients IBD ; EA a réalisé des études d'immunofluorescence ; ICG a effectué une analyse protéomique ; IC a produit des données EM, AB a effectué une extraction d'ADN et une PCR pour l'analyse du microbiote ; CC a effectué une analyse du microbiote à partir du séquençage 16 S ; XT, EOD a fourni des rapports médicaux et des échantillons cliniques et AD a fourni aux patients des données d'ADNc et de QPCR ; EB a conçu, réalisé et interprété des expériences d'épissage, ddPCR et a participé à la rédaction de l'article ; MC a effectué la plupart de la bioinformatique sur les données ARN-seq du modèle de souris et des patients UC ; GR et ME ont fourni des souris HGPS ; CM a conçu et participé à la bioinformatique explorant l'épissage, et à la rédaction de l'article. LA a conçu le projet, supervisé l'étude, rédigé et édité l'article.

Correspondance à Laurence Arbibe.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

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Reçu : 24 janvier 2022

Accepté : 27 octobre 2022

Publié: 18 novembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-022-34556-3

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