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Oct 21, 2023

Infection uropathogène à Escherichia coli

Nature Microbiologie volume 8,

Nature Microbiology volume 8, pages 875–888 (2023)Citer cet article

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Les infections des voies urinaires (IVU) antérieures peuvent prédisposer à de futures infections ; cependant, les mécanismes sous-jacents affectant la récidive sont mal compris. Nous avons précédemment découvert que les infections urinaires chez la souris provoquent un remodelage épithélial (urothélial) différentiel de la vessie, en fonction de l'issue de la maladie, qui a un impact sur la sensibilité aux infections urinaires récurrentes. Ici, nous avons comparé des lignées de cellules souches urothéliales (USC) isolées de souris ayant des antécédents d'infection à Escherichia coli uropathogène résolue ou chronique (UPEC), élucidant les preuves d'une empreinte moléculaire impliquant des changements épigénétiques, notamment des différences d'accessibilité à la chromatine, de méthylation de l'ADN et de modification des histones. Les marques épigénétiques dans les USC de souris infectées de manière chronique ont amélioré la mort cellulaire médiée par la caspase-1 lors de l'infection par l'UPEC, favorisant la clairance bactérienne. Une expression accrue de Ptgs2os2 s'est également produite, contribuant potentiellement à l'expression soutenue de la cyclooxygénase-2, à l'inflammation de la vessie et aux lésions muqueuses, réponses associées à une cystite récurrente sévère. Ainsi, l'infection UPEC agit comme un épi-mutagène reprogrammant l'épigénome urothélial, conduisant à un remodelage urothélial-intrinsèque et à la formation de la réponse innée à une infection ultérieure.

Les infections des voies urinaires (IVU) sont l'une des infections bactériennes les plus courantes dans le monde et sont une cause importante de morbidité chez les femmes par ailleurs en bonne santé1,2. Le taux de récidive élevé chez les personnes sensibles rend le traitement difficile3, l'un des facteurs de risque les plus importants de développer une infection urinaire étant une infection urinaire antérieure2. La base biologique des infections urinaires récurrentes (rUTI) est mal comprise.

Sans traitement antibiotique, les infections urinaires aiguës chez l'homme se résolvent d'elles-mêmes ou se transforment en infections chroniques de longue durée4. L'infection de souris C3H/HeN par Escherichia coli uropathogène (UPEC) récapitule ces deux résultats. La cystite chronique chez ces souris est définie comme une bactériurie persistante à titre élevé (bactéries dans l'urine) accompagnée d'une inflammation chronique (souris sensibilisées), tandis que la résolution de l'infection définit les souris résolues5. L'analyse des vessies de souris résolues et sensibilisées révèle que l'infection entraîne un remodelage différentiel de la vessie qui a un impact sur la sensibilité au rUTI. Les souris résolues sont résistantes au rUTI, en partie parce qu'elles ont une réponse TNFα/cyclooxygénase-2 (Cox-2) accélérée et transitoire de la vessie, qui favorise l'élimination rapide de l'infection et la cicatrisation des muqueuses6,7,8. Les souris sensibilisées sont très sensibles aux rUTI lors de la provocation, avec une expression robuste et soutenue du TNFα et de la Cox-2 dans la vessie provoquant une transmigration des neutrophiles à travers l'épithélium de la vessie (urothélium) et des lésions muqueuses qui favorisent de graves infections bactériennes récurrentes6,7,8. Ainsi, selon l'histoire de la maladie, le tissu vésical est remodelé de manière différentielle d'une manière qui augmente ou diminue la sensibilité aux rUTI.

Ces phénotypes ont conduit à notre hypothèse selon laquelle le remodelage de la muqueuse vésicale est médié en partie par des changements épigénétiques dans les cellules souches urothéliales (USC) qui ont un impact sur la défense de la muqueuse vésicale contre les infections ultérieures6,7. Ainsi, nous avons isolé des cellules épithéliales de la vessie de souris présentant différents antécédents de maladie, établi des lignées USC primaires, les avons propagées en culture cellulaire et formé in vitro un urothélium polarisé et entièrement différencié, qui présentait des phénotypes morphologiques ressemblant aux phénotypes de remodelage urothélial observés in vivo6. Nous avons identifié des différences dans l'accessibilité de la chromatine, la méthylation de l'ADN et les modifications des histones dans les lignées USC, qui correspondaient à des différences dans les réponses transcriptionnelles affectant la mort cellulaire programmée et les réponses inflammatoires régulées par la cyclooxygénase-2 (Cox-2) qui ont un impact sur la sensibilité au rUTI. Dans l'ensemble, notre étude fournit des preuves épigénétiques de l'immunité entraînée épithéliale-intrinsèque causée par une infection bactérienne de la muqueuse, qui modifie la réponse de la muqueuse de la vessie aux infections ultérieures, en fonction de l'issue initiale de la maladie. Cette découverte peut expliquer la prévalence élevée de rUTI et avoir des implications thérapeutiques importantes pour les infections bactériennes chroniques/récurrentes en général.

Pour étudier les changements urothéliaux-intrinsèques résultant d'une infection antérieure, nous avons adapté une méthode de propagation in vitro de cellules souches épithéliales intestinales primaires en culture tridimensionnelle (3D)9,10 pour cultiver des USC primaires isolées à partir de souris C3H/HeN naïves âgées de 8 semaines (Fig. 1a et Extended Data Fig. 1a). L'expression génique de p63, qui code pour la protéine 63 liée à la transformation (p63), a été mesurée car elle est essentielle à la capacité proliférative des cellules souches11, tandis que l'expression d'Axin2, qui est un gène cible Wnt10, a été mesurée pour évaluer l'activité de signalisation Wnt dans la culture 3D. Ensemble, nous pouvons évaluer le statut de pluripotence des cellules souches en surveillant l'expression de ces gènes avec RT – qPCR (données étendues Fig. 1b, c). L'expression des gènes p63 et Axin2 est restée élevée pendant les 3 premiers jours de culture 3D dans un milieu conditionné à 50 % (CM), ce qui est nécessaire pour maintenir la pluripotence. L'expression de p63 et d'Axin2 a ensuite diminué de 5 à 7 jours après l'infection, que les cellules aient été incubées dans 50 % ou 5 % de CM au jour 3 après l'infection, ce qui montre qu'une culture prolongée ou un pourcentage de CM inférieur peut réduire la signalisation Wnt. Cependant, l'uroplakine 3a (Upk3a), une protéine de surface exprimée par les cellules urothéliales différenciées, n'a augmenté de manière significative que dans les cellules cultivées dans 5% de CM mais pas dans 50% de CM, comme déterminé 7 jours après l'infection (Extended Data Fig. 1d). Après propagation des USC dans 50% de CM sur plusieurs passages et culture supplémentaire dans 50% de CM sur 5 jours, toutes les cellules se sont colorées positivement pour le marqueur de cellule épithéliale E-cadhérine et le marqueur de cellule urothéliale basale kératine 5 (K5), mais manquaient d'expression de Upk3a (Extended Data Fig. 1e). En revanche, la culture dans 0% de CM en culture 3D pendant 5 jours après la propagation initiale a entraîné le développement d'une polarité épithéliale avec la formation d'une cavité centrale (Extended Data Fig. 1e). Dans les kystes résultants, les cellules faisant face à la cavité se sont différenciées en cellules superficielles de type facette (Upk3a +, K5−), tandis que les cellules périmétriques en contact avec la matrice de matrigel étaient de type cellule basale (Upk3a–, K5+).

a, les USC isolées de souris C3H / HeN âgées de 8 semaines ont été développées par culture sphéroïdale dans du matrigel avec 50% de milieu conditionné L-WRN (CM) comprenant Y-27632, un inhibiteur de ROCK, et SB431542, un inhibiteur de TGF β de type 1. Après 3 jours de culture sphéroïde, les cellules ont été dissociées en une suspension unicellulaire et 3 à 4 × 105 cellules ont été ensemencées sur des membranes transwell. Les cellules ont été cultivées dans 50 % de CM pendant 3 à 5 jours, puis cultivées dans 5 % de CM pendant 2 à 3 semaines jusqu'à différenciation complète. b, les cultures cellulaires avec une valeur TER> 4 000 ohm × cm2 ont ensuite été analysées (5 transpuits cultivés à partir d'une lignée cellulaire juvénile C3H / HeN). Par souci de cohérence, le TER a été mesuré 1 jour après le changement de support. c, d, L'urothélie différenciée sur les transwells a été fixée et imagée via (c) microscopie confocale et (d) SEM pour montrer une vue de haut en bas de l'urothélium à un grossissement de 500 × (panneau supérieur) et 10 000 × (panneau inférieur). En c, les échantillons ont été colorés pour la F-actine, le marqueur de différenciation terminal K20 et les noyaux (DAPI). e–h, Les urothéliums ont également été inclus dans la paraffine, sectionnés et colorés à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) (e) et immunocolorés pour K20, Ecad et DAPI (f), Upk3a, p63 et DAPI (g) ou K5, K14 et DAPI (h). Des images représentatives sont affichées. Les données proviennent de 2 à 3 expériences indépendantes utilisant des USC de 5 souris juvéniles C3H/HeN différentes.

Données source

Nous avons ensuite établi un système de culture transwell pour différencier les USC de souris juvéniles C3H / HeN en barrières urothéliales polarisées et stratifiées (Fig. 1a). La lignée cellulaire de carcinome de la vessie humaine 5637 (ATCC HTB-9), qui a été largement utilisée pour l'étude in vitro des interactions de l'UPEC avec les cellules de la vessie et qui provient de cellules cancéreuses basales de la vessie12, a été utilisée comme témoin. Comme les cellules 5637 et nos USC primaires sont d'origine cellulaire basale, nous les avons ensemencées et cultivées sur des transpuits pendant 2 à 3 semaines pour comparer les phénotypes de différenciation cellulaire. La formation d'urothélium différencié intact, appelé ici urothélium différencié (ou urothélie), par les USC primaires a été confirmée par une résistance électrique transépithéliale robuste (TER) (Fig. 1b), une forte coloration confocale de grandes cellules facettaires superficielles hexagonales pour le marqueur de différenciation terminal K20 (Fig. 1c), et la présence de jonctions cellulaires et de plaques d'uroplakine à la surface du tissu (Fig. 1d), similaires à la façon dont les cellules facettaires superficielles apparaissent à la surface de tissus vésicaux intacts6. L'analyse microscopique de coupes urothéliales différenciées a révélé une couche de tissu épithélial polarisé multicouche (Ecad +) (Fig. 1e – h), avec une expression de p63, K5 et K14 dans les cellules de la couche basale au-dessus de la membrane matrigel (principalement K5 + / K14 +, quelques K5 + / K14-), p63 et une faible expression de Upk3a dans certaines cellules de la couche intermédiaire, indiquant des cellules intermédiaires, et une forte coloration de K20 et Upk3a à la surface de les cellules de la couche apicale, indiquant des cellules facettaires superficielles différenciées en phase terminale. Dans l'ensemble, la distribution de ces caractéristiques de différenciation dans les couches urothéliales basales, intermédiaires et superficielles est cohérente avec celle observée dans les tissus vésicaux de souris et humains13. En revanche, aucune de ces caractéristiques n'a été observée dans 5637 cultures de transpuits cellulaires, dans lesquelles les cellules étaient lâchement regroupées en couches de 4 à 6 cellules de profondeur, mais manquaient de preuves de polarisation ou de formation de jonction cellulaire (Extended Data Fig. 2a – d). Ainsi, les USC primaires offrent des avantages importants par rapport à une lignée cellulaire tumorale pour l'étude de l'urothélium.

En utilisant notre modèle murin de rUTI5,6, nous avons montré qu'un événement UTI initial entraîne un remodelage durable de la vessie, y compris des modifications structurelles et protéomiques de l'urothélium, qui ont un impact sur la sensibilité au rUTI14. Pour étudier le rôle des USC dans le remodelage de la vessie, nous avons isolé les USC de la vessie de souris convalescentes (4 semaines après le début des antibiotiques), de celles présentant une infection auto-résolue (résolue) et de celles ayant développé une infection chronique (sensibilisée), ainsi que de souris naïves du même âge comme témoins et lignées USC établies (n = 4 par historique d'infection) (Fig. 2a, b). Nous avons propagé chacune de ces lignées USC pendant 15 à 30 passages, puis les avons différenciées sur des transpuits et caractérisé chaque lignée cellulaire par microscopie après 2 à 3 semaines de culture. De manière frappante, nous avons constaté que l'urothélium dérivé d'USC sensibilisés récapitulait bon nombre des différences morphologiques observées précédemment in vivo6 même après de nombreux passages, y compris des cellules de surface plus petites et une expression réduite des marqueurs de différenciation terminaux Upk3a et K20 par rapport à l'urothélium différencié dérivé d'USC naïfs et résolus (Fig. 2c – e). La mesure automatisée de la taille des cellules de surface a montré que les cellules apicales de l'urothélie différenciée sensibilisée sont significativement plus petites que celles de l'urothélie différenciée naïve, alors que l'urothélie résolue a un phénotype intermédiaire, cohérent avec les données in vivo (Fig. 2f – g)6. Collectivement, ces données indiquent que la culture transwell des USC peut récapituler les phénotypes morphologiques de remodelage épithélial de la vessie observés in vivo.

a, Évolution dans le temps de l'infection initiale avec 108 ufc UTI89 KanR et période de convalescence chez les souris C3H/HeN. b, Évolution représentative du titre bactérien dans l'urine sur 4 wpi. La ligne horizontale représente le seuil de bactériurie notable : 104 ufc ml-1. Les souris naïves, résolues et sensibilisées ont été nommées N1-4, R1-4 et S1-4. c, d, les USC isolées de ces souris ont été cultivées dans de l'urothélie différenciée sur des transpuits, fixées et imagées par microscopie confocale (c) et SEM (d). En c, les urothéliums ont été colorés pour K20, F-actine (Phalloïdine) et les noyaux (DAPI). e, les Transwells ont été inclus dans la paraffine, sectionnés et immunocolorés pour Upk3a, la E-cadhérine et les noyaux. Les flèches blanches montrent les jonctions cellulaires indiquant la taille des cellules de surface. f, g, Des lames fixes traitées à partir de 44 transwells de souris naïves, résolues et sensibilisées (n = 16, 12 et 16 transwells de n = 4, 3, 4 souris, respectivement) ont été colorées pour K20, E-cadhérine et noyaux, marqués et imagés en double aveugle. Ensuite, les tailles de cellules superficielles ont été automatiquement mesurées à l'aide du programme macro Fiji ImageJ et tracées pour la taille moyenne des cellules par transpuits (f) et la taille des cellules individuelles (g), représentées sous forme de médiane avec un IC à 95 %. Le test t de Student bilatéral a été utilisé pour déterminer la signification et les valeurs P sont indiquées lorsqu'elles sont significatives.

Données source

Nos données indiquent qu'une infection antérieure entraîne des changements intrinsèques à l'USC qui sont héréditaires sur plusieurs générations de culture cellulaire. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que ces changements sont médiés par une modification épigénétique différentielle dans les USC qui s'associent à : (1) des antécédents de maladie et (2) des différences à l'échelle du génome dans l'accessibilité de la chromatine. L'accessibilité de la chromatine a été mesurée par Omni-ATAC-seq, une technique de séquençage des régions de la chromatine nucléaire accessibles à une transposase par séquençage15. Nous avons identifié un total de 59 801, 63 195 et 82 030 régions de chromatine accessibles hautement reproductibles dans deux répliques biologiques de chacune des lignées USC naïves, résolues et sensibilisées, respectivement. L'analyse en composantes principales (ACP) de ces lignées USC sépare les USC sensibilisées des autres groupes (Fig. 3a). Parmi les 2 880 régions différentiellement accessibles (DAR) de la chromatine identifiées entre les USC sensibilisés et résolus, 925 régions sont des DAR accessibles aux sensibilisés (plus accessibles en sensibilisé qu'en résolu) et 1 955 régions sont des DAR accessibles en résolu (plus accessibles en résolu que en sensibilisé) (Fig. 3b).

Omni-ATAC-seq a été réalisé à l'aide d'USC de souris naïves, résolues et sensibilisées (lignées cellulaires N1, N3, R1, R4, S1 et S2, chacune d'une souris individuelle). a, graphique PCA des DAR à travers les lignes USC. b, Carte thermique des pics significativement différentiels (FDR < 0,05) comparant les USC sensibilisés et résolus. Sur l'ensemble des 2 880 DAR, 925 régions sont des DAR accessibles aux personnes sensibilisées et 1 955 régions sont des DAR accessibles à la résolution. c, Les 15 principaux termes GO enrichis pour les DAR accessibles aux personnes sensibilisées (n = 747, changement de facteur > 1,5, FDR < 0,05) ont été analysés à l'aide de GREAT. La signification a été déterminée à l'aide du test binomial. d, e, Les différences d'accessibilité de la chromatine, de méthylation de l'ADN et de modifications actives des histones, H3K27Ac et H3K4Me3, dans différents USC ont été évaluées par ATAC-seq, séquençage au bisulfite du génome entier (WGBS) et CUT&RUN. d, les DMR spécifiques sensibilisés (n = 189) parmi les USC naïfs, résolus et sensibilisés sont visualisés sous la forme d'une série de cartes thermiques affichant le paysage épigénétique chevauchant chaque DMR pour la méthylation de l'ADN, l'ATAC et les modifications actives des histones H3K27Ac et H3K4Me3. e, Signaux moyens 5 kb en amont et 5 kb en aval des hypo-DMR spécifiques sensibilisés (n = 183) pour WGBS, ATAC, H3K27Ac et H3K4Me3 sont visualisés pour chaque lignée cellulaire. La longueur moyenne des DMR est de 362 paires de bases. Les DMR sont mis à l'échelle en fonction de la taille avec le « début » et la « fin » des DMR, qui sont indiqués par des barres grises. f, les hypo-DMR spécifiques aux sensibilisés ont été annotés en fonction de leurs emplacements prédits dans le génome (n = 183). g, Un tracé PCA de toutes les comparaisons DMR montrant le regroupement des différentes lignées cellulaires. h, Les 15 principaux termes GO enrichis pour les hypo-DMR sensibilisés ont été analysés à l'aide de GREAT (n = 183).

Données source

L'analyse de la voie Gene Ontology (GO) sur les DAR à l'aide de GREAT16 a révélé que les gènes associés aux DAR accessibles aux personnes sensibilisées sont fortement enrichis pour de nombreux processus biologiques, y compris ceux impliquant la mort cellulaire programmée (PCD), le stress oxydatif et la réponse immunitaire (Fig. 3c). Bon nombre de ces DAR se trouvaient à proximité de gènes associés à la voie PCD, notamment Casp1 et Gsdmc2 / 3 (tableau supplémentaire 1), qui se sont précédemment avérés enrichis à la fois en ARN-seq de la vessie entière et en comparaisons protéomiques urothéliales ex vivo de souris sensibilisées vs résolues6,8. En effectuant une analyse de découverte de motifs à l'aide de HOMER17, nous avons constaté que les DAR accessibles résolus sont hautement enrichis en motifs de liaison au facteur de transcription (TF) des membres de la famille AP-1, qui sont des médiateurs connus des réponses au stress, souvent en aval de la signalisation des cytokines (Extended Data Fig. 3a). En revanche, les DAR accessibles aux personnes sensibilisées sont enrichis non seulement pour les motifs de liaison TF de la famille AP-1, mais également pour ceux qui régulent le destin des cellules souches et la différenciation et le développement des tissus, y compris les membres de la famille SOX EHF, Klf5 et RUNX2 (Extended Data Fig. 3b).

Le remodelage de la chromatine est accompli par deux mécanismes principaux : la méthylation de l'ADN et les modifications des histones. Nous avons effectué un profilage à l'échelle du génome de la méthylation de l'ADN et de la modification des histones dans nos lignées USC en utilisant respectivement WGBS18 et CUT&RUN19. Pour CUT&RUN, nous avons sélectionné des anticorps contre les marques de modification des histones : H3 lysine 4 trimethylation (H3K4Me3), H3 lysine 27 acetylation (H3K27Ac) et H3 lysine 27 trimethylation (H3K27Me3), qui sont respectivement associés à des promoteurs actifs, à des promoteurs/enhancers actifs et à la répression polycomb20. La plupart des régions différentiellement méthylées (DMR) ont été identifiées dans les comparaisons d'USC sensibilisées avec des USC (1) naïfs ou (2) résolus. Nous n'avons observé aucune différence globale dans la méthylation de l'ADN entre les groupes naïfs, résolus et sensibilisés (données étendues Fig. 4a, b). Les DMR spécifiques sensibilisés sont affichés sous forme de carte thermique avec les pics ATAC-seq et CUT & RUN pour visualiser le paysage épigénétique à travers ces DMR (Fig. 3d). Nous avons constaté que les DMR spécifiques sensibilisés ont tendance à être hypo-méthylés (hypo-DMR) par rapport aux USC naïfs et résolus (Fig. 3d). La méthylation de l'ADN peut réduire l'expression des gènes en inhibant la liaison du facteur de transcription et en affectant potentiellement l'occupation des nucléosomes, ce qui entraîne une chromatine moins accessible21. De manière concordante, nous avons constaté que les hypo-DMR dans les USC sensibilisés ont une augmentation correspondante des signaux ATAC-seq, H3K4Me3 et H3K27Ac (Fig. 3d), ce qui suggère que ces régions sont enrichies en marques pour les promoteurs et les amplificateurs actifs. En examinant les signaux moyens dans les régions génomiques (+/- 5 kb) entourant les hypo-DMR spécifiques sensibilisés, nous avons observé des schémas similaires d'hypo-méthylation, une accessibilité accrue à la chromatine et une augmentation des marques d'histones actives par rapport aux USC naïfs et résolus (Fig. 3e). Cependant, la modification de l'histone répressive, H3K27Me3, n'était pas corrélée avec les DMR spécifiques sensibilisés (Extended Data Fig. 5a, b). Les hypo-DMR sensibilisés spécifiques sont davantage associés à des caractéristiques géniques telles que des promoteurs, des exons et des introns (Fig. 3f). Un tracé PCA de tous les DMR a séparé les USC sensibilisés des USC naïfs et résolus (Fig. 3g). L'analyse de la voie GO des hypo-DMR spécifiques sensibilisés a montré un enrichissement de la réponse immunitaire et des voies liées à l'adhésion cellule-cellule (Fig. 3h). Ainsi, les USC conservent des souvenirs épigénétiques d'une infection UPEC précédente qui diffèrent sur la base du résultat initial de l'infection et sont médiés par la méthylation différentielle de l'ADN et les modifications actives des histones.

Nous avons ensuite effectué l'ARN-seq d'USC naïfs, résolus et sensibilisés pour déterminer si leurs épigénomes altérés entraînent une expression différentielle des gènes. Nous avons inclus les USC juvéniles naïfs (Fig. 1) comme comparateurs pour les différences d'âge. Encore une fois, le PCA de tous les DEG sépare les USC sensibilisés des autres groupes le long du composant principal (PC) 1 (Fig. 4a). Les USC sensibilisés avaient respectivement 108 et 73 gènes exprimés de manière différentielle (DEG) par rapport aux USC naïfs et résolus (données étendues Fig. 6a, b), dont 40 gènes étaient communs aux deux comparaisons (Fig. 4b). Les 15 premiers DEG comprenaient les gènes de la glutathion transférase Mgst1 et Mgst3 (Fig. 4b). Les voies enrichies dans les USC sensibilisées par rapport aux USC naïves et résolues comprennent celles liées à la protection contre les espèces oxydatives réactives (ROS), la signalisation des récepteurs nucléaires et la pluripotence des cellules souches (données étendues Fig. 6c, d). En revanche, aucun gène n'a été exprimé de manière différentielle entre les USC résolus et naïfs. Les USC juvéniles naïfs se sont séparés des USC naïfs adultes principalement le long de PC2 (Fig. 4a), mais cette comparaison n'a révélé que 8 DEG significatifs (Extended Data Fig. 7a). Un biplot PCA montre que des gènes comprenant Znfx1 et Ly6e ont fortement influencé PC1, tandis que des gènes comprenant Kank1 et Krt1 ont fortement influencé PC2 (Extended Data Fig. 7b).

Les ARN ont été isolés de (a,b) juvéniles indifférenciés naïfs, adultes naïfs, résolus et sensibilisés (lignées cellulaires de n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 de 14 souris), ou (c–f) urothélie différenciée de cellules naïves, résolues et sensibilisées (différentes cultures de N3, R3 et S3) avec ou sans infection par UPEC, puis analysés par ARN-seq et par analyse différentielle. a, Une PCA de l'ARN-seq de l'USC par des gènes exprimés de manière significativement différentielle montre que les échantillons sont regroupés par lignées cellulaires (résultat de l'infection précédente). b, Quarante gènes différentiellement exprimés (DEG) se chevauchaient entre les USC sensibilisés vs naïfs et sensibilisés vs résolus. Les 15 principaux DEG qui se chevauchent sont répertoriés dans le tableau. c, une PCA d'ARN-seq urothélial différencié montre un regroupement par lignées cellulaires (résultat de l'infection précédente) et une condition d'infection secondaire. d, Un diagramme de volcan comparant les urothélies différenciées sensibilisées infectées fictives et résolues. Les DEG avec FC > 0,5, Padj < 0,05 sont indiqués par des points rouges. e, l'analyse des voies a été utilisée pour évaluer les voies biologiques enrichies en gènes exprimés de manière différentielle dans l'urothélie infectée simulée sensibilisée par rapport à l'urothélie différenciée résolue. La signification a été déterminée à l'aide d'un test exact de Fisher unilatéral à droite, avec Padj < 0, 05 étant considéré comme des voies significativement enrichies. Les voies sélectionnées avec z-score> 2 et -log (valeur P)> 4, 2 sont présentées parmi les voies spécifiques enrichies par IPA. Les voies qui se chevauchent entre l'urothélie différenciée infectée par un faux et infectée par l'UPEC (données étendues Fig. 8d) sont soulignées. f, une carte thermique montrant les gènes associés à la mort cellulaire programmée qui sont exprimés de manière différentielle dans l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée infectée par un faux. L'importance des DEG a été déterminée à l'aide du test de Wald, suivi d'une correction de tests multiples à l'aide de Benjamini-Hochberg FDR pour la valeur P ajustée.

Données source

Malgré le grand nombre de changements épigénétiques trouvés dans les USC sensibilisés, seuls quelques DEG ont été observés lorsque les USC étaient cultivés dans des conditions favorisant les cellules souches, ce qui suggère que les changements épigénétiques que nous avons trouvés pourraient avoir un impact plus important sur l'expression génique lors de la différenciation cellulaire. Par conséquent, nous avons effectué l'ARN-seq de l'urothélie différenciée avec ou sans infection UPEC. L'ACP de tous les DEG a montré que les profils transcriptionnels de l'urothélie différenciée infectée par un faux étaient séparés par l'historique de l'infection (Fig. 4c), indiquant des différences intrinsèques dans l'urothélie différenciée dues à l'historique de l'infection antérieure. L'infection a largement provoqué un décalage uniforme dans le tracé PCA pour chaque lignée cellulaire (Fig. 4c), reflétant probablement une réponse transcriptionnelle conservée à l'infection par UPEC dans chaque état de convalescence (Extended Data Fig. 8a). Notamment, l'expression du gène codant pour Cox-2, Ptgs2, était plus fortement induite lors de l'infection d'urothélie sensibilisée et résolue par rapport à naïf (Extended Data Fig. 8b), en accord avec une récente étude in vivo7. L'expression génique différentielle entre les urothélies différenciées sensibilisées et résolues infectées par un faux a été visualisée dans un diagramme de volcan (Fig. 4d) et une analyse des voies des DEG a été effectuée (Fig. 4e). L'urothélie différenciée sensibilisée a affiché l'activation des voies de signalisation PTEN, PPARɑ / RXRɑ et de détoxification médiée par le glutathion par rapport à l'urothélie différenciée résolue, indépendamment de l'infection UPEC (Fig. 4e et données étendues Fig. 8c, d). Plusieurs des DEG étaient des gènes TF, notamment Klf4 et Klf5 (Extended Data Fig. 9), ce qui suggère qu'ils pourraient jouer un rôle dans la conduite et le maintien de changements épigénétiques uniques dans les cellules urothéliales sensibilisées par rapport aux autres types de cellules.

Sur la base de nos données d'analyse de la voie GO impliquant les voies PCD dans les DAR accessibles aux personnes sensibilisées (Fig. 3c) et de nos observations in vivo selon lesquelles l'urothélium sensibilisé remodelé est caractérisé par une exfoliation sévère et des lésions muqueuses dépendantes de l'inflammation Cox-2 au cours de l'infection UPEC6, nous avons spécifiquement interrogé les DEG impliqués dans les voies PCD. Une carte thermique de l'expression génique montre que de nombreux gènes associés aux voies de la PCD étaient exprimés de manière différentielle dans l'urothélie différenciée sensibilisée et résolue les unes par rapport aux autres et à l'urothélie différenciée naïve adulte (Fig. 4f). Alors que Casp1 (qui était le gène le plus fortement régulé à la hausse lors de la comparaison de l'urothélie sensibilisée infectée par un faux à résolu (tableau supplémentaire 2)) et d'autres gènes liés à la pyroptose (y compris Aim2, Gsdmc2 et Gsdmc3) étaient régulés à la hausse dans l'urothélie différenciée sensibilisée, d'autres gènes liés à la pyroptose (tels que les Naips) ainsi que les gènes liés à l'apoptose et à la nécroptose étaient régulés à la hausse dans l'uro différencié résolu thelia, suggérant que les cellules résolues et sensibilisées sont prédisposées à différents mécanismes PCD lors de l'infection par UPEC.

Nous avons ensuite examiné si les différences de méthylation de l'ADN dans les USC étaient corrélées aux changements de pli de l'ARN-seq dans l'urothélie différenciée entre les USC sensibilisés et résolus, en nous concentrant sur les DMR au niveau des sites promoteurs (Fig. 5a). La plupart des gènes, y compris Casp1 et Ptgs2os2 (un régulateur positif de l'expression de Cox-2 en cis et un régulateur de la réponse pro-inflammatoire en trans), ont montré une corrélation négative entre l'expression relative du gène et le niveau de méthylation de l'ADN au niveau du site promoteur de ce gène (Fig. 5a). À l'aide du navigateur WashU Epigenome, l'accessibilité de la chromatine, la méthylation de l'ADN et les marques de modification des histones ont été visualisées aux loci Casp1 et Ptgs2os2 (Fig. 5b, c). Les locus promoteurs Casp1 et Ptgs2os2 des USC sensibilisés sont chacun relativement hypo-méthylés tout en étant également enrichis en marques d'histones actives, H3K4Me3 et H3K27Ac, ​​par rapport aux USC naïfs et résolus (Fig. 5b, c et Extended Data Fig. 10a). Plusieurs TF enrichis en DAR accessibles aux personnes sensibilisées (Extended Data Fig. 3a), tels que les membres des familles Sox et AP-1 (Klf5, ETS et RUNX2), ont prédit des sites de liaison près du promoteur Casp1, comme indiqué sur la carte Epigenome Browser (Extended Data Fig. 10b). L'expression de Casp1 par RT – qPCR était environ 1 000 fois plus élevée dans les urothélies différenciées sensibilisées par rapport aux USC résolues ou naïves, indépendamment de l'infection par UPEC (Fig. 5d). De manière concordante, la coloration par immunoblot a montré une caspase-1 détectable uniquement dans l'urothélium différencié sensibilisé (Fig. 5e), en accord avec notre précédente protéomique ex vivo de l'urothélium de souris sensibilisée convalescente8.

a, Pour les DMR trouvés à moins de 1 kb des régions promotrices, les changements de pli de l'ARN-seq comparant l'urothélie différenciée sensibilisée à résolue avec (axe y, points violet foncé) ou sans infection (axe y, points gris) ont été tracés par rapport aux différences de méthylation de l'ADN (axe x) entre les USC sensibilisés et résolus. b, c, les différences d'accessibilité de la chromatine (ATAC-seq), la méthylation de l'ADN (WGBS) et les modifications actives des histones (H3K4me3 et H3K27ac) aux locus Casp1 (b) et Ptgs2os2 (c) dans différentes lignées USC ont été visualisées sous forme de pistes combinées à l'aide de la carte WashU Epigenome Browser. Dans les données WGBS, le pourcentage moyen de méthylation sur les sites promoteurs Casp1 et Ptgs2os2 (boîte rouge) est indiqué ; les barres de couleur représentent le % de méthylation, les arrière-plans gris représentent les CpG et les lignes noires indiquent la profondeur de séquençage. Les CpG dans les régions promotrices Casp1 et Ptgs2os2 ont respectivement une couverture de lecture de 8 à 25x et de 18 à 23x. d, L'expression génique de Casp1 dans l'urothélie différenciée a été mesurée par RT – qPCR (les données de n = 4, 4, 4, 5, 4, 4 échantillons générés à partir d'urothélies différenciées adultes naïves, résolues et sensibilisées qui sont ensuite infectées par du PBS ou UTI89, respectivement, sont représentés par la moyenne ± sd). e, L'expression protéique de la caspase-1 à l'aide de deux lignées cellulaires différentes (N2, R2, S2 et N3, R3, S3) a été évaluée par western blot, et N3, R3 et S3 sont représentés. f, la mort cellulaire de l'urothélie différenciée 4 h après l'infection par UTI89 a été mesurée par dosage de la LDH. Les données sont moyennes ± sd, obtenues à partir de n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6 échantillons provenant d'urothélies différenciées adultes naïves, résolues et sensibilisées, 2 à 3 lignées cellulaires biologiquement indépendantes, par condition, qui sont ensuite infectées avec du PBS ou de l'UTI89, respectivement ; la signification a été déterminée par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA). Les souris g, h, naïves, résolues et sensibilisées ont été provoquées avec 107 cfu de WT UTI89 (HlyA+) ou UTI89ΔhlyA. Les données sont combinées à partir de 2 à 3 expériences indépendantes. g, charges bactériennes de la vessie à 6 hpi (n = 10, 7, 19, 8, 14, 11 souris adultes naïves, résolues et sensibilisées, défiées avec 107 ufc de UTI89 ou UTI89ΔhlyA, respectivement) examinées sur 2 à 3 expériences indépendantes. Les barres indiquent les valeurs médianes et le test U bilatéral de Mann-Whitney a été utilisé pour déterminer la signification. h, Incidence de cystite chronique à 28 dpi. Test exact de Fisher bilatéral ; Les valeurs P sont indiquées lorsqu'elles sont significatives.

Données source

Dans nos études précédentes, nous avons constaté que la toxine bactérienne porogène sécrétée α-hémolysine (HlyA), couramment produite par l'UPEC, induit une pyroptose dépendante de la caspase-1 et de la caspase-11 (caspase-4 chez l'homme) dans les cellules urothéliales humaines et de souris - une réponse protectrice qui conduit à l'exfoliation des cellules infectées22. Nous avons émis l'hypothèse qu'une expression accrue de la caspase-1 dans l'urothélium différencié sensibilisé conduirait à une réponse de mort cellulaire pyroptotique plus robuste lors d'une infection UPEC de type sauvage (WT) (HlyA +) in vitro. Un test de cytotoxicité de la lactate déshydrogénase (LDH) a démontré que l'infection par l'UPEC induisait la mort cellulaire dans l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée (Fig. 5f), mais que la mort cellulaire était significativement plus élevée dans l'urothélie différenciée sensibilisée. Dans les infections de provocation utilisant les souches WT UTI89 et UTI89ΔhlyA chez des souris naïves, résolues et sensibilisées, nous avons observé que l'infection ΔhlyA, qui n'active pas la mort cellulaire pyroptotique médiée par la caspase-1, présentait une charge bactérienne significativement accrue chez les souris sensibilisées par rapport aux souris WT, alors qu'aucune différence n'a été observée chez les souris naïves et résolues (Fig. 5g). De plus, l'incidence de la cystite chronique récurrente 28 jours après l'infection était significativement augmentée chez les souris sensibilisées lorsqu'elles étaient infectées par ΔhlyA par rapport à WT (Fig. 5h), indiquant que la surexpression de la caspase-1 dans les cellules urothéliales sensibilisées est une réponse protectrice qui aide à résoudre l'infection par UPEC.

Des études antérieures ont montré qu'un remodelage durable des tissus vésicaux se produit en réponse à une infection par UPEC, et ce remodelage s'accompagne de modifications de la sensibilité à une infection ultérieure, en fonction des résultats d'une infection antérieure5,6,7. Nous avons émis l'hypothèse que cette susceptibilité altérée est médiée, au moins en partie, par le développement d'une immunité entraînée au niveau de la muqueuse épithéliale de la vessie. Contrairement à l'immunité adaptative, qui englobe les réponses spécifiques à l'antigène des lymphocytes T et B, «l'immunité entraînée» se caractérise par une adaptation tissulaire non spécifique de l'antigène à l'inflammation aiguë et chronique, parfois en réponse à une infection, et a été principalement étudiée dans les cellules immunitaires innées professionnelles telles que les macrophages, les monocytes, les cellules dendritiques et les cellules tueuses naturelles23,24,25. Ici, nous avons utilisé un système de culture de cellules épithéliales primaires pour élucider la contribution urothéliale intrinsèque au remodelage de la muqueuse vésicale à la suite d'une infection antérieure, en découvrant des preuves de la reprogrammation épigénétique des cellules souches urothéliales en tant que mécanisme d'immunité entraînée à l'infection ultérieure des voies urinaires.

L'urothélium de la vessie de souris précédemment infectées est connu pour être résistant à la colonisation intracellulaire par rapport aux souris naïves du même âge6,7. Cependant, le mécanisme de cette résistance à la colonisation intracellulaire diffère entre les souris résolues et sensibilisées. Chez les souris résolues, les UPEC forment initialement des communautés bactériennes intracellulaires dans les cellules facettaires superficielles, similaires à celles des souris adultes naïves, mais elles sont rapidement éliminées dans les 6 premières heures de l'infection via une inflammation renforcée par le TNFα7. En revanche, les communautés bactériennes intracellulaires ne se forment pas du tout dans l'urothélium sensibilisé in vivo, probablement en raison de la petite taille des cellules et de l'activation de l'actine des cellules superficielles incomplètement différenciées6,26. Dans ce travail, nous avons élucidé une autre facette de la résistance à la colonisation de la vessie dans l'urothélium sensibilisé, où la mort et l'exfoliation des cellules urothéliales médiées par HlyA réduisent encore la colonisation précoce de la vessie. Cet effet est probablement une conséquence de l'augmentation de l'expression de base de la caspase-1 et peut-être d'autres facteurs associés à l'inflammasome, tels que les gasdermines C2 et C3 qui peuvent agir comme effecteurs terminaux de la lyse cellulaire inflammatoire27, qui ont été observés ici in vitro et ont été précédemment décrits dans des études de protéomique ex vivo sur l'urothélie de souris8. Aim2, qui code pour un capteur immunitaire inné cytosolique qui peut activer l'inflammasome de la caspase-1, était également plus fortement exprimé dans l'urothélie différenciée sensibilisée. Dans la peau des souris, l'imiquimod et l'inflammation qui en résulte permettent à la peau d'avoir une réponse médiée par Aim2 plus rapide à une insulte inflammatoire secondaire, ce qui suggère que la reprogrammation épigénétique des composants de l'inflammasome peut être un mécanisme commun pour amorcer les capteurs d'inflammation pour se préparer à une exposition secondaire au niveau des sites de tissu barrière. De plus, chez la souris, l'interleukine-6 ​​(IL-6) maternelle produite en réponse à l'infection peut induire des changements épigénétiques dans les cellules souches épithéliales intestinales fœtales in utero29. Contrairement à ces études précédentes, notre travail démontre un rôle direct d'une infection bactérienne muqueuse dans l'obtention de changements épigénétiques spécifiques aux cellules souches épithéliales muqueuses qui modifient l'issue des infections ultérieures.

L'immunité entraînée protectrice médiée par la caspase-1 dans la vessie sensibilisée est souvent surmontée par une inflammation dépendante de Cox-2 qui survient en réponse à des charges bactériennes élevées au cours des 24 premières heures de rUTI aiguë6,8. L'expression de Cox-2 se produit principalement au niveau des cellules urothéliales basales, mais son activité peut provoquer des lésions muqueuses par recrutement excessif de neutrophiles, transformant ainsi le paysage de colonisation en faveur de la colonisation extracellulaire et de la croissance des bactéries. Ainsi, les souris sensibilisées ont des réponses protectrices et sensibilisantes concurrentes pour défier l'infection, qui se manifestent généralement par une distribution bimodale extrême des charges d'infection 24 h après l'infection5. Bien que les vessies résolues et sensibilisées aient amélioré les réponses précoces de Cox-2 in vivo, 24 h après l'infection, la réponse inflammatoire de la vessie n'est maintenue que chez les souris sensibilisées7 et l'inhibition de Cox-2 protège les souris sensibilisées contre la cystite récurrente sévère6,8. De même, l'expression du gène Ptgs2 induite par l'infection (codant pour Cox-2) a été améliorée dans les urothélies différenciées sensibilisées et résolues par rapport aux naïfs. Cependant, l'expression du gène Ptgs2os2, qui code pour LincRNA-Cox-2, un régulateur positif de l'expression de Ptgs2 et de l'inflammation générale30, différait entre ces lignées cellulaires, étant augmentée dans l'urothélie différenciée sensibilisée par rapport à résolue. De manière concordante, nous avons trouvé des marques épigénomiques différentielles associées à une accessibilité accrue du locus Ptgs2os2 dans les USC sensibilisés, suggérant que l'expression de Ptgs2os2 dans l'urothélie différenciée est altérée par des changements épigénétiques dans les USC. Ainsi, les modifications épigénétiques du locus Ptgs2os2 peuvent jouer un rôle dans la promotion des réponses pro-inflammatoires soutenues de la vessie sensibilisée, surmontant ainsi la fonction protectrice de l'expression accrue de Casp1.

Des changements dans l'expression des ADN méthyltransférases, qui méthylent les sites CpG de l'ADN, ont été impliqués comme mécanisme de remodelage de l'épigénome en réponse à une infection aiguë à l'UPEC31, expliquant potentiellement comment une infection antérieure, qu'elle soit autorésolue ou chronique, pourrait altérer l'épigénome USC. Cependant, l'inflammation chronique elle-même est également un puissant inducteur de la mémoire épigénétique qui pourrait expliquer les différences de marquage épigénétique entre les USC résolues et sensibilisées. Un modèle pour cette réécriture de l'épigénome est la présence de soi-disant «domaines de mémoire» où la liaison «pionnière» du TF aux nucléosomes en réponse à des stimuli ouvre la chromatine dans les locus sensibles au stress et permet aux auteurs épigénétiques de remodeler la chromatine pour lui permettre de rester ouvert après la suppression des stimuli32. Klf4, qui était régulé positivement dans l'urothélie différenciée sensibilisée par rapport à l'urothélie résolue, est un pionnier connu de TF33. De plus, nos analyses de découverte de motifs soutiennent l'hypothèse que le remodelage épigénétique dans l'USCS se produit principalement dans les DAR associés à AP-1 en réponse à une infection aiguë auto-limitante (DARS résolus accessibles à la résolution), mais une infection aiguë sévère conduisant à une infection chronique et à une infection non plus sensible à l'assive, à AP-ASSO) DARS associés F, tels que ceux avec des sites de motifs de la famille KLF et SOX.

Notre découverte de la reprogrammation épigénétique des cellules souches épithéliales lors d'une infection par UPEC a des implications pour la compréhension du mécanisme de l'immunité entraînée épithéliale-intrinsèque contre non seulement les infections urinaires, mais également d'autres types d'infection ou de maladie inflammatoire. D'autres études mécanistes pourraient conduire à de nouvelles thérapies pour une gamme d'infections récurrentes et de maladies inflammatoires. Par exemple, l'utilisation thérapeutique d'un inhibiteur de l'histone déméthylase LSD1, qui est surexprimée dans le cancer de l'épithélium cutané, entraîne des augmentations notables de la méthylation de H3K4 dans les cellules, entraînant ainsi à la fois une différenciation épidermique prématurée et la répression du carcinome épidermoïde34. Par conséquent, une enquête plus approfondie pour identifier les facteurs épigénétiques, les TF ou les médiateurs inflammatoires qui sont directement responsables de l'établissement et du maintien de ces mémoires épigénétiques spécifiques in vivo fournirait des informations mécanistes plus approfondies et éclairerait les cibles thérapeutiques potentielles pour prévenir les rUTI et/ou inverser l'empreinte épigénétique qui conduit à une susceptibilité accrue à la maladie récurrente.

Toutes les expérimentations animales ont été menées conformément aux directives des National Institutes of Health pour le logement et les soins des animaux de laboratoire. Toutes les expériences ont été réalisées conformément aux réglementations institutionnelles après examen et approbation par le comité des études animales de la Washington University School of Medicine à St Louis, Missouri.

Les souches UPEC utilisées dans cette étude étaient l'isolat de cystite humaine UTI89 et ses dérivés : UTI89 attHK022::COM-GFP (UTI89-KanR)35, UTI89 pANT4 et UTI89 hlyA::KD13 (UTI89 ΔhlyA-KanR)22. Pour les infections de souris et in vitro, les souches UTI89 ont été cultivées en statique dans un bouillon de lysogénie (LB) à 37 ° C pendant la nuit, sous-cultivées à 1: 1 000 dans du milieu frais et cultivées en statique à 37 ° C pendant 18 h.

Les souris femelles C3H/HeN (Envigo) étaient âgées de 7 à 8 semaines (« juvéniles ») au moment de l'infection initiale. Un total de 108 ufc d'UTI89 ont été inoculés dans la vessie de souris C3H/HeN par cathétérisme transurétral5,36. Les souris C3H/HeN développent une cystite chronique d'une manière dépendante de la dose d'infection et cet inoculum entraîne une cystite chronique chez environ 50 % des souris6. Pour surveiller les résultats de l'infection, l'urine a été recueillie. La bactériurie persistante (104 cfu ml−1) est définie comme un seuil spécifique et sensible pour détecter la cystite chronique5. La cystite chronique au cours de l'infection initiale a été définie comme une bactériurie élevée persistante (> 104 ufc ml-1 d'urine) à chaque moment où l'urine a été recueillie (1, 3, 7, 10, 14, 21 et 28 jours après l'infection), tandis que la résolution de la cystite a été définie comme une chute du titre bactérien dans l'urine en dessous de ce seuil à au moins un moment.

Quatre semaines après l'infection, toutes les souris ont été traitées avec du triméthoprime et du sulfaméthoxazole dans l'eau de boisson pendant 10 jours (54 et 270 μg ml-1 d'eau, respectivement)6. L'urine a été recueillie chaque semaine pour confirmer l'élimination de la bactériurie. Quatre semaines après le début des antibiotiques, des souris naïves, résolues et sensibilisées ont été utilisées pour isoler les USC primaires ou utilisées pour le test d'infection secondaire. Pour l'infection secondaire, les souris ont été provoquées avec 107 ufc de bactéries inoculées dans les vessies, puis euthanasiées sans cruauté 6 h après l'infection, et les charges bactériennes ont été déterminées pour évaluer les résultats aigus.

Des cellules épithéliales de carcinome de la vessie humaine, appelées cellules 5637 (ATCC HTB-9), ont été cultivées dans un milieu RPMI-1640 contenant 10 % de FBS à 37 °C en présence de 5 % de CO2.

Des tissus vésicaux de souris juvéniles, convalescentes naïves, résolues et sensibilisées ont été isolés, coupés en deux et incubés dans une solution de décapage à 4 ° C pendant la nuit. Les cellules urothéliales ont été grattées du tissu de la vessie, centrifugées à 4 ° C à 300 g pendant 5 min, remises en suspension dans une solution fraîche de collagénase IV et incubées avec bascule à 37 ° C pendant 20 min. Les cellules ont été désagrégées par pipetage doux, filtrées avec un tamis de 100 μm, puis lavées avec des milieux de lavage. Les cellules ont été cultivées dans du matrigel (BD Biosciences) avec 50 % de L-WRN CM contenant 10 mM de Y-27632 et 10 mM de SB431542 (R&D System)9. Les milieux ont été changés tous les 2 jours et les cellules ont été passées tous les 3 jours (division 1: 2–3). Les USC ont été utilisées pour des expériences après 10 passages pour éliminer toutes les cellules urothéliales non souches restantes.

Les USC ont été lavées dans du PBS avec 0, 5 mM d'EDTA, trypsinisées dans 0, 05% de trypsine et 0, 5 mM d'EDTA pendant 1 min à 37 ° C, dissociées par pipetage vigoureux, filtrées à travers un tamis cellulaire de 40 μm et remises en suspension dans un milieu de lavage. Les Transwells (Corning Costar, 3413) ont été recouverts de PBS avec du Matrigel 1:40 pendant 30 min à 37 °C. Ensuite, 3 à 4 × 104 USC ont été ensemencées sur l'insert transwell, et 100 μl et 600 μl de CM à 50% contenant 10 mM de Y-27632 ont été ajoutés aux compartiments apical et basolatéral du transwell, respectivement.

La résistance des multicouches urothéliales a été évaluée par mesure TER à l'aide d'un volt-ohmmètre épithélial (World Precision Instruments). La valeur moyenne des mesures en triple a été multipliée par la surface de la membrane transwell (0,33 cm2) pour obtenir une valeur finale en ohm × cm2 (réf. 37).

Lorsque l'urothélium était complètement différencié (valeur TER> 4 000 ohm × cm2), les cultures ont été lavées 3 fois dans un milieu DMEM / F12 chaud et infectées avec des souches UPEC à la multiplicité d'infection 10. Les transwells ont ensuite été incubés à 37 ° C pendant 30 min, remplacé par un milieu contenant 100 μg ml-1 de gentamicine pour éliminer les bactéries extracellulaires et cultivé pendant une période prolongée. Après infection, les milieux apical et basolatéral ont été centrifugés à 2 000 g à 4 ° C pendant 5 min et utilisés pour le dosage de la LDH (TaKaRa, MK401). Les transwells ont été lavés avec du PBS stérile, puis utilisés pour diverses analyses.

Les urothéliums différenciés sur transpuits ont été lavés et fixés dans du PBS avec du paraformaldéhyde à 4 % pendant 15 min et rincés 3 fois avec du PBS. Par la suite, 100 µl de Triton X à 0,2 % ont été ajoutés pendant 10 min puis jetés et les cellules ont été incubées dans 100 µl de BSA à 2 % pour blocage pendant 30 min. Les échantillons ont été colorés avec un anticorps primaire, l'anti-kératine monoclonal de souris 20 (Abcam, ab854, 1:200) et un anticorps secondaire, l'IgG anti-souris d'âne Alexa Fluor 647 (Invitrogen, A-31571, 1:1 000), puis encore plus colorés avec Alexa Fluor 555 Phalloidin (ThermoFisher, A34055, 1:200) et 4 ′,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (ThermoFisher, D1306, 1:1 000). Pour la microscopie confocale, un microscope à balayage laser va ZEISS LSM880 avec Airyscan a été utilisé. Fiji ImageJ et le programme macro ont été utilisés pour calculer automatiquement la surface des cellules urothéliales dans les images confocales empilées en z.

Les USC ou les urothélies différenciées ont été fixées pendant une nuit dans du formaldéhyde à 10 % à 4 °C. Après lavage dans du PBS, les échantillons fixés ont été pré-inclus dans de la gélose à 2%, coupés verticalement, placés dans des transpuits face vers le haut, inclus à nouveau dans des blocs de paraffine et sectionnés. Les lames ont été colorées pour H&E et immunocolorées pour les anticorps sélectionnés. Pour la coloration par immunofluorescence, les lames ont été déparaffinées, hydratées, bloquées avec 10 % de sérum de cheval inactivé à la chaleur (HIHS) et 0,3 % de Triton X-100 dans du PBS, incubées avec un anticorps primaire dans 1 % de HIHS et PBS pendant une nuit à 4 °C et un anticorps secondaire dans du PBS pendant 30 à 60 min à température ambiante6. Les principaux anticorps utilisés étaient l'anti-kératine monoclonal de souris 20 (Abcam, ab854, 1:200), l'anti-E-cadhérine polyclonale de chèvre (R&D Systems, AF748, 1:500), l'anti-uroplakine polyclonale de chèvre 3a (Santa Cruz, sc-15186, 1:500), l'anti-uroplakine monoclonale de souris 3a (Fitzgerald, 10R-U103a , 1:50), anti-p63 polyclonal de lapin (GeneTex, GTX102425, 1:1 000), anti-K5 monoclonal de lapin (Abcam, ab150074, 1:100) et anti-kératine monoclonal de souris 14 (Santa Cruz, sc-53253, 1:50). Les anticorps secondaires Alexa Fluor et le DAPI ont été utilisés à une dilution de 1:1 000. Des informations supplémentaires sur les anticorps sont fournies dans le tableau supplémentaire 3. Les échantillons ont été visualisés sur un microscope à fluorescence à champ large Zeiss Axio Imager M2 Plus.

Les urothéliums différenciés ont été lavés 3 fois dans du PBS, fixés dans un fixateur EM (paraformaldéhyde à 2%, glutaraldéhyde à 2, 5% dans du PBS 1 ×) pendant 1 h sur de la glace et lavés 3 fois dans du PBS. Les échantillons ont ensuite été post-fixés dans du tétroxyde d'osmium à 1,0 %, déshydratés dans des concentrations croissantes d'éthanol, puis déshydratés à 31,1 °C et 1 072 psi pendant 16 min dans un sécheur à point critique6. Les échantillons ont été montés sur des talons recouverts de ruban de carbone et recouverts d'or/palladium sous argon6, puis imagés sur un Zeiss Crossbeam 540 FIB-SEM.

Les ARN ont été extraits des USC ou de l'urothélie différenciée à l'aide du mini kit RNAeasy Plus (Qiagen) et transcrits à l'envers avec iScript Reverse Transcription Supermix (BioRad). Nous avons utilisé 1 μl 12,5 ng μl-1 d'ADN complémentaire avec des amorces couvrant les introns spécifiques à chaque gène, et iQ SYBR Green Supermix a été utilisé conformément aux instructions du fabricant (BioRad). Les séquences des amorces que nous avons utilisées dans cette étude sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 4. Les valeurs d'expression ont été normalisées à 18S et l'expression relative par rapport au contrôle a été déterminée par la méthode du seuil de cycle (ΔΔCt)38. Chaque échantillon a été analysé en triple et les valeurs moyennes de Ct ont été calculées.

Les bibliothèques d'ADNc Illumina ont été générées à l'aide d'une version modifiée du protocole RNAtag-seq39. En bref, 1 μg d'ARN total a été fragmenté, appauvri en ADN génomique, déphosphorylé et ligaturé à des adaptateurs d'ADN portant des codes-barres 5'-AN8-3' de séquence connue avec un phosphate en 5' et un groupe de blocage en 3'. Les ARN à code-barres ont été regroupés et appauvris en ARN ribosomal à l'aide du kit de déplétion d'ARNr Ribo-Zero (Illumina). Les bibliothèques d'ADNc ont été générées en ajoutant un deuxième adaptateur par changement de modèle et amplification par PCR avec des amorces portant des séquences Illumina P5 ou P7, puis les bibliothèques ont été séquencées sur l'Illumina HiSeq 2500. Les lectures de séquençage apparié dans un pool ont été démultiplexées sur la base de leur séquence de code-barres associée à l'aide de scripts personnalisés (https://github.com/broadinstitute/split_merge_pl). Les lectures ont ensuite été coupées à l'aide de cutadapt v1.6 et les lectures coupées ont été alignées sur le génome de Mus musculus mm10 à l'aide de tophat2 v2.0.11 et bowtie2 v2.2.2. Les comptages de gènes ont été effectués par HTSeq v0.6.0 et les comptages de lecture ont été attribués aux transcrits annotés à l'aide de Salmon v0.8.27.

La normalisation de la lecture et l'expression différentielle ont été réalisées avec DESeq2 v1.14.040. Les transformations rlog des lectures normalisées DESeq ont été utilisées pour les tracés PCA. La normalisation des fragments par kilobase de transcription par million de lectures mappées (FPKM) des lectures DEseq2 a été utilisée pour les cartes thermiques z-score. L'expression de TF a été déterminée à l'aide de valeurs normalisées par DESeq2 FPKM et d'une liste de TF de souris (n = 453) de HOCOMOCO v1141, une base de données TF de motifs TF validés. Un seuil de valeur P ajusté de 0, 05 a été utilisé et l'expression du candidat TF a été visualisée à l'aide de cartes thermiques z-score. Les différences statistiquement significatives dans l'expression des gènes ont été évaluées par le test de Wald, suivi d'une correction de tests multiples à l'aide du taux de fausses découvertes de Benjamini-Hochberg (FDR), le P ajusté <0, 05 étant considéré comme significatif. Les analyses des voies ont été effectuées avec l'analyse des voies de l'ingéniosité (IPA). La signification a été déterminée par un test exact de Fisher unilatéral à droite, avec Padj < 0,05 étant considéré comme des voies significativement enrichies.

Des cellules individuelles (1–2 × 105) d'USC naïves, résolues et sensibilisées ont été utilisées pour la préparation des noyaux, et 50 000 noyaux ont été comptés et transférés dans 25 μl de tampon 2 × TD. Un mélange réactionnel Omni-ATAC-seq (25 μl) comprenant l'enzyme TDE1 a été ajouté à 25 μl de 50 000 noyaux dans un tampon 2 × TD, puis les échantillons ont été incubés à 37 ° C pendant 30 min (tapotés toutes les 10 min pendant l'incubation dans un bloc chauffant). Les fragments d'ADN transposés ont été immédiatement purifiés à l'aide d'un kit de purification MinElute PCR (Qiagen). Les bibliothèques ATAC-seq ont été amplifiées par amplification PCR (10 à 12 cycles) avec une extension initiale de 5 min à 72 ° C et purifiées à l'aide de billes AMPure XP (Beckman Coulter). Les bibliothèques purifiées ont été éluées avec 20 μl d'eau sans nucléase, quantifiées à l'aide du kit de test Qubit dsDNA HS (ThermoFisher) et leur distribution de taille a été vérifiée avec une 4200 TapeStation (High Sensitivity D1000 ScreenTape and Reagents). Les bibliothèques ATAC-seq appariées ont été séquencées sur un Illumina NextSeq 500 (~ 350 millions de lectures).

L'analyse ATAC-seq42 a utilisé les outils et versions suivants : Fastqc v0.11.5, Cutadapt v1.11, Samtools v1.5, Bowtie2 v2.3.0, picard v2.10.0, Macs2 v2.1.1.20160309 et bedtools v2.26.0. Les lectures de séquençage ont été démultiplexées à l'aide de séquences d'index spécifiques à l'échantillon, la qualité vérifiée avec fastqc, coupée à l'aide de cutadapt et alignée sur un génome de souris de référence (mm10) à l'aide de bowtie243. Picard a ensuite été utilisé pour supprimer l'alignement secondaire, multiplier les lectures mappées et les lectures dupliquées par PCR, et l'appel de pointe a été effectué avec MACS244. L'analyse du taux de découverte irréproductible (IDR) avec deux répétitions a été effectuée conformément aux directives d'ENCODE45, et les pics ATAC avec IDR <0,05 ont été choisis comme régions de chromatine accessibles hautement reproductibles pour une analyse plus approfondie. Les signaux ATAC-seq ont été visualisés sur le WashU Epigenome Browser46 sous forme de changement de pli (FC) sur fond à l'aide de pistes bedGraph générées à l'aide de la fonction MACS2 bdgcmp.

Pour identifier les DAR, Diffbind v2.10.0 a été utilisé sur les pics IDR < 0,05 ATAC, et Benjamini-Hochberg FDR avec un seuil <0,05 a été utilisé pour la signification statistique. Des DAR significatifs (FDR < 0,05) ont été utilisés pour générer des tracés de volcan et des cartes thermiques. GREAT16 (paramètre basal plus extension) a été utilisé pour l'analyse de la voie GO. GREAT classe les résultats par valeur P binomiale à l'aide d'un test binomial. Les DAR sensibilisés (FC> 1, 5) et spécifiques résolus (FC <-1, 5) ont été analysés séparément et les 15 principales voies enrichies sont présentées sur les figures 3e – f.

Des cellules individuelles (1–2 × 105) d'USC ont été traitées avec de la DNase I pour éliminer les traces de contamination par l'ADN du Matrigel. L'ADN génomique (ADNg) a été préparé à partir des cellules à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen, 69504). En utilisant 200 ng d'ADNg et 0,4 ng de lambda, l'ADN a été traité au bisulfite à l'aide du kit EZ DNA Methylation-Direct (Zymo, D5020) et traité avec le kit xGen Methyl-Seq Library Prep (IDT, 10009824) pour générer des bibliothèques WGBS compatibles avec Illumina. Les bibliothèques ont été séquencées sur un NovaSeq S4 300XP (~300 millions de lectures) par l'institut MGI.

Les commandes d'analyse WGBS avec des paramètres spécifiques sont détaillées dans la section Disponibilité du code. En bref, fastqQC v0.11.8 a été utilisé pour évaluer la qualité des lectures brutes. Par la suite, les lectures appariées ont été coupées pour supprimer les séquences d'adaptateur et les lectures de mauvaise qualité avec Cutadapt v1.18 et réévaluées à l'aide de FastqQC. Le génome de référence de la souris mm10 a d'abord été converti au bisulfite à l'aide de Bismark v0.20.0. Les lectures appariées ont été alignées sur le génome converti au bisulfite mm10 et dédupliquées à l'aide de «deduplicate_bismark». Les niveaux de méthylation de l'ADN ont été calculés à l'aide de "bismark_methylation_extractor" et affichés au format methylC sur le WashU Epigenome Browser46. La conversion du bisulfite a été estimée en utilisant le taux de conversion de la cytosine en thymine dans le génome de référence lambda.

Les DMR ont été identifiés avec DSS v2.43.247 à l'aide d'une comparaison en deux groupes pour les réplicats biologiques et appelés à l'aide de « DMLtest » et « callDMR ». Un tracé PCA de la méthylation CpG dans les DMR a été généré à l'aide de Deeptools v3.3.0. Les répliques biologiques ont été combinées en fusionnant les fichiers fastq entre les répliques et en les retraiteant en utilisant les étapes décrites précédemment. La densité de CpG a été visualisée à l'aide d'un seuil de couverture 5x et de ggplot2 v3.3.6.

Les DMR spécifiques sensibilisés ont été définis comme les régions qui se chevauchent entre les DMR naïfs vs sensibilisés et résolus vs sensibilisés. Le pourcentage de méthylation pour les DMR spécifiques sensibilisés a été visualisé à l'aide du package R « ComplexHeatmap ». La méthylation de l'ADN sur des hypo-DMR spécifiques sensibilisés a été tracée à l'aide de Deeptools et visualisée à l'aide de ggplot2. Les régions qui se chevauchent entre les DMR ont été identifiées et visualisées à l'aide d'Intervene48 'Venn' avec des paramètres par défaut. L'analyse GREAT16 sur les hypo-DMR sensibilisés a été réalisée comme décrit dans l'analyse ATAC. Les hypo-DMR sensibilisés ont également été analysés pour l'annotation génomique à l'aide de l'UCSC (https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgTables) pour télécharger GENCODE M25 (https://www.gencodegenes.org/mouse/release_M25.html). Le promoteur a été défini comme 1 kb en amont du site de début de transcription. La priorité d'annotation génomique a été attribuée dans l'ordre suivant : promoteur, exon codant, 5' UTR, 3' UTR, intron et intergénique. Les DMR ont été attribués à l'annotation si le DMR chevauchait 20 % de l'annotation à l'aide de BEDTools v2.27.1 se croisent et ont été tracés à l'aide du changement de pourcentage de méthylation de l'ADN entre sensibilisé et résolu par rapport au log2 (FC) des gènes associés entre l'urothélie différenciée sensibilisée et résolue avec ou sans infection.

Des cellules individuelles (0, 2 × 106) d'USC ont été légèrement réticulées dans du formaldéhyde à 0, 1% et des culots de cellules fixes ont été stockés à -80 ° C avant utilisation. H3K4Me3, H3K27Ac et H3K27Me3 CUT&RUN ont été réalisés à l'aide du kit de test CUT&RUN (Cell Signaling, 86652), avec quelques modifications. En bref, les cellules ont été attachées à des billes de concanavaline A pour chaque expérience. Les cellules ont été perméabilisées avec de la digitonine dans le tampon de liaison d'anticorps contenant de la spermidine et des inhibiteurs de protéase, puis incubées avec des anticorps primaires contre H3K4Me3 (Cell Signaling, 9751, 1:50), H3K27Ac (Cell Signaling, 8173, 1:100) ou H3K27Me3 (Cell Signaling, 9733, 1:50) à 4 ° C pendant la nuit sur un rotateur. Le mélange billes-cellules a été lavé 3 fois avec du tampon digitonine, remis en suspension dans 50 µl de pAG-MNase et incubé à 4 ° C pendant 1 h sur un rotateur. Les échantillons ont été digérés dans des tubes PCR contenant 150 µl de tampon digitonine froid et 3 µl de CaCl2 à 4 °C pendant 30 min dans un thermocycleur. Ensuite, les billes ont été transférées dans les tubes de microcentrifugeuse, 150 µl de tampon 1X STOP ont été ajoutés et les tubes ont été incubés à 37 ° C pendant 10 min. En plaçant les tubes sur un portoir magnétique, les surnageants ont été collectés dans un nouveau tube. Les liaisons croisées ont été inversées en ajoutant 3 µl de solution de SDS à 10 % et 2 µl de 20 mg ml-1 de protéinase K, puis les échantillons ont été incubés à 65 °C pendant 2 h. L'ADN d'échantillons de chromatine enrichis a été purifié à l'aide de colonnes de centrifugation d'ADN (Zymo, D4013). La bibliothèque de séquençage a été préparée avec le kit de préparation de bibliothèque d'ADN Ultra II (NEB, E7645) en suivant les instructions du fabricant, mais en réduisant le temps de recuit et d'extension à 10 s pendant l'enrichissement par PCR de l'ADN ligaturé à l'adaptateur.

Une liste détaillée des commandes et des paramètres se trouve sous Disponibilité du code. En bref, fastqQC v0.11.9 a été utilisé pour évaluer la qualité de lecture. Par la suite, les lectures appariées ont été coupées avec Cutadapt v1.9 et réévaluées à l'aide de fastqQC. Les lectures ont ensuite été alignées à l'aide de bowtie2 v2.3.4.149. Les lectures mitochondriales ont été supprimées à l'aide de samtools v1.9 et dédupliquées à l'aide de Picard v2.8.1 MarkDuplicates. Les lectures mappées de manière unique ont été extraites à l'aide de la vue samtools. Les pics ont été appelés en utilisant MACS2 v2.1.1.20160309 'callpeak' : '-q 0.01' pour les pics étroits H3K4Me3 et H3K27Ac, ​​et '-q 0.05 --broad' pour H3K27Me3. Les régions de la liste noire définies par l'encodage ont été supprimées. Pour chaque modification d'histone, une liste de pics consensus a été utilisée pour calculer la fraction de lectures dans les pics (FRIP). Les lectures ont ensuite été converties au format bigWig à l'aide de Deeptools et normalisées à l'aide de la couverture de lecture et du score FRIP. Les répliques biologiques normalisées ont été combinées à l'aide de ucsc-bigwigmerge v377 et converties de bedGraph en bigWigs à l'aide de kentUCS v334 et des tailles de chromosome mm10 de l'UCSC (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/goldenPath/mm10/bigZips/mm10.chrom.sizes). Pour profiler les régions DMR spécifiques sensibilisées pour d'autres modifications épigénétiques, les hypo-DMR sensibilisés ont été superposés avec des pics étroits MASC2 pour ATAC, H3K4Me3 et H3K27Ac, ​​et des pics larges pour H3K27Me3. Le score maximal correspondant a été normalisé à l'aide des scores FRIP et tracé à l'aide du package R « ComplexHeatmap ». À l'aide des pistes bigWig normalisées, les signaux ATAC, H3K4Me3, H3K27Ac et H3K27Me3 ont été tracés sur les hypo-DMR spécifiques sensibilisés à l'aide de Deeptools. Les signaux bigWig normalisés ont été utilisés pour la carte thermique casp1.

Les cellules ont été lysées avec un tampon de lyse cellulaire (Cell Signaling, 9803S) selon les instructions du fabricant. Le kit Rapid Gold BCA Protein Assay a été utilisé pour déterminer les concentrations de protéines dans le lysat cellulaire, et des quantités égales de protéines ont été séparées par SDS-PAGE et transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été incubées pendant une nuit avec des anticorps primaires contre la caspase-1 (AdipoGen, AG-20B-0042-C100, 1: 5 000) et la β-actine (MA5-15739, Invitrogen, 1: 10 000). Un anticorps secondaire lié à HRP (Cell Signaling, 7076S, 1: 3 000) et un réactif ECL (Amersham, RPN2209) ont été utilisés pour visualiser les bandes de protéines.

Pour représenter des images de coloration confocale, immunofluorescence et SEM, 3 à 4 lignées cellulaires différentes (parmi J1-5, N1-4, R1-4 et S1-4) ont été colorées et imagées. Pour les images de western blot, deux lignées cellulaires différentes ont été testées. Les statistiques des tracés/graphiques ont été analysées dans GraphPad Prism v8.4.3. Les valeurs P exactes sont indiquées lorsqu'elles sont significatives (P < 0,05) (GraphPad Prism n'a pas fourni de valeur P exacte lorsque P < 0,0001).

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles dans le document, ses informations supplémentaires ou ses données sources. Les données RNA-seq, ATAC-seq, WGBS et CUT&RUN ont été déposées au NCBI sous le BioProject ID no. PRJNA705407. La carte WashU Epigenome Browser visualisant les données ATAC-seq, WGBS-seq et CUT&RUN, et RNA-seq (brin avant : vert et brin inverse : orange) est accessible aux liens suivants :

Répétitions combinées :

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_combined.json

Répétitions combinées et individuelles :

https://epigenomegateway.wustl.edu/browser/?genome=mm10&noDefaultTracks=1&hub=https://wangftp.wustl.edu/~jharrison/PUBLISHED_DATAHUBS/Hultgren/Russell_Bacterial_infection_all.jsonLes données source sont fournies avec cet article.

Pipeline général ATAC-seq :

https://www.encodeproject.org/documents/c008d7bd-5d60-4a23-a833-67c5dfab006a/@@download/attachment/ATACSeqPipeline.pdf

Canalisation générale CUT&RUN :

https://github.com/Yonghao-Holden/tricks/blob/main/cuttag_pipe_v1.sh

Canalisation générale WGBS :

https://github.com/hyungjoo-lee/wgbs

Le code personnalisé pour ATAC-seq, GUT&RUN, WGBS et chiffres :

https://github.com/jharrison0123/Uropathogenic-Escherichia-coli-infection-induced-trained-immunity-affects-urinary-tract-disease

Le code pour les parcelles de volcan : https://github.com/bsolson/Volcano_plot

Code EnhancedVolcano : https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano

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Nous remercions le Washington University Center for Cellular Imaging (WUCCI), qui est soutenu par la Washington University School of Medicine, le Children's Discovery Institute of Washington University et le St Louis Children's Hospital (CDI-CORE-2015-505), et la Foundation for Barnes-Jewish Hospital (3770), pour la préparation et l'imagerie des échantillons de microscopie électronique à balayage. Nous remercions M. Shih pour le développement du code macro Fidji ImageJ pour la mesure automatique de la taille des cellules des images confocales et K. Dodson pour l'assistance éditoriale. Ce travail a été soutenu par les National Institutes of Health (U01 AI095542 à SJH et MC ; U19AI110818 à JL) ; un prix du jeune chercheur du consortium National Institutes of Health Mucosal Immunology Studies Team (U01 AI095776 à TJH); le Centre basé sur les ressources de recherche sur les maladies rhumatismales de l'Université de Washington (P30 AR073752, EDOR); une bourse McDonnell International Scholars Academy à l'Université de Washington à St Louis (à SKR); et une bourse de recherche supérieure de la National Science Foundation (#DGE -114395 à VPO). Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Département de microbiologie moléculaire et Centre de recherche sur les maladies infectieuses des femmes, École de médecine de l'Université de Washington, St Louis, MO, États-Unis

Seongmi K. Russell, Benjamin S. Olson, Valerie P. O'Brien, Lu Yu, Rajdeep Bomjan, Thomas J. Hannan et Scott J. Hultgren

Département de génétique, École de médecine de l'Université de Washington, St Louis, MO, États-Unis

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Elisha DO Roberson, Changxu Fan, Marina Sha et Ting Wang

Edison Family Center for Genome Sciences and Systems Biology, Washington University School of Medicine, St Louis, MO, États-Unis

Jessica K. Harrison, Hyung Joo Lee, Xiaoyun Xing, Changxu Fan, Marina Sha et Ting Wang

Fred Hutchinson Cancer Center, Division de la biologie humaine, Seattle, WA, États-Unis

Valérie P. O'Brien

Programme sur les maladies infectieuses et le microbiome, The Broad Institute of Massachusetts Institute of Technology et Harvard, Cambridge, MA, États-Unis

Jonathan Livny

Département de médecine, Division de rhumatologie, École de médecine de l'Université de Washington, St Louis, MO, États-Unis

Elisha DO Roberson

Department of Microbial Infection and Immunity, Infectious Diseases Institute, Ohio State University, Columbus, OH, États-Unis

Shady Estfanous & Amal O. Amer

Département de biochimie et de biologie moléculaire, Faculté de pharmacie Université Helwan, Le Caire, Égypte

Shady Estfanous

Département de pathologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Washington, St Louis, MO, États-Unis

Marco Colonna & Thomas J. Hannan

Département de l'inflammation et de l'immunité, Institut de recherche Lerner, Cleveland Clinic, Cleveland, OH, États-Unis

Thaddeus S. Stappenbeck

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SKR, MC, TJH et SJH ont conceptualisé le projet. SKR, TSS, TW, TJH et SJH ont développé la méthodologie. SKR,. HJL, VPO, XX, JL, RB et TJH ont mené les enquêtes. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, LY, EDOR et MS ont effectué une analyse formelle. SKR a écrit le brouillon original. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO, RB, SE, AOA, TW, TJH et SJH ont révisé et édité le manuscrit. SKR, JKH, HJL, BSO, VPO et CF ont effectué la visualisation. TW, TJH, MC et SJH ont acquis un financement. TW, TJH et SJH ont supervisé le projet.

Correspondance avec Ting Wang, Thomas J. Hannan ou Scott J. Hultgren.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail.̈

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

(A) Pour l'expansion cellulaire, des agrégats de cellules dissociées ont été intégrés dans du matrigel frais puis développés en nouveaux sphéroïdes. Les sphéroïdes urothéliaux peuvent être passés tous les 3 jours à l'aide de dilutions 1: 2–1: 3 en fonction de la densité cellulaire. (BD) Les USC primaires provenant de souris C3H/HeN âgées de 8 semaines ont été cultivées dans du matrigel avec 50 % de CM. Après 3 jours de culture dans 50 % de CM, les supports ont été changés en 50 % de CM frais ou à 5 % de CM à 3, 5 et 7 jours, puis les ARN ont été isolés à 1, 2, 3 (jaune), 5 (vert) et 7 jours (orange) (culture USC n = 12, 9, 13, 12, 12, 11, 11 respectivement). (B) L'expression génique de p63, (C) Axin2, un marqueur de signalisation Wnt, et (D) Upk3a, un marqueur de différenciation des cellules urothéliales, a été mesurée par qRT-PCR et les données sont représentées par la moyenne ± SD. La signification a été déterminée par un test t non apparié (bilatéral). (E) Pour cultiver des organoïdes de la vessie dans du matrigel, les USC ont été pré-cultivés dans 50 % de CM pendant 3 jours, doucement dissociés, puis passés dans du matrigel frais pour la culture dans 50 % de CM ou 0 % de CM pendant 5 jours, tandis que les supports ont été changés tous les 2 jours. Après 5 jours de culture, les sphéroïdes USC ont été fixés avec 10 % de formaldéhyde tamponné neutre (NBF) et préparés pour l'inclusion de paraffine. La lame avec des sections de paraffine a été colorée avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) et immunocolorée pour Upk3a (rouge), E-cadhérine (jaune) et DAPI (bleu) ou K20 (rouge), K5 (jaune) et DAPI (bleu).

Données source

(A) Des cellules urothéliales C3H/HeN primaires et 5637 cellules ont été cultivées dans Transwells pendant 2 à 3 semaines et la résistance électrique transépithéliale (TER) de Transwells a été mesurée tous les 2 jours avant le changement de support. Les données recueillies à partir de chaque lignées cellulaires (n = 3 pour chacune) représentées par la moyenne ± SD. (B) L'urothélium de montage entier des deux types de cellules a été fixé et coloré pour l'analyse par microscopie confocale ; F-actine (vert) et DAPI (bleu). (C) La taille des cellules de surface des cellules urothéliales primaires C3H/HeN et des cellules 5637 a été mesurée à l'aide d'images confocales (n = 10 chacune). Les données sont représentées sous forme de moyenne ± SD et la signification a été déterminée par un test t non apparié (bilatéral) (valeur de p <0,001). (D) Les cultures Transwell des cellules C3H/HeN et 5637 ont été fixées, coupées en tranches, puis traitées pour l'inclusion de paraffine. Les coupes histologiques ont été coupées et colorées avec H&E ou immunocolorées pour Upk3a, K20, Ecad, K5, p63 et DAPI.

Données source

(AB) L'analyse du motif HOMER à l'aide des données USC ATAC-seq (Fig. 4a) a généré des listes de motifs de liaison TF enrichis dans les DAR accessibles sensibilisés (A) et les DAR accessibles résolus (B) avec leurs valeurs p. HOMER a scanné les séquences de DAR à la recherche de motifs connus et calculé la valeur p du score d'enrichissement à l'aide du test binomial. HOMER a également découvert des motifs de novo avec leurs meilleures correspondances avec un motif connu dans les DAR. Chaque top 10 des motifs connus et de novo enrichis en USC sensibilisés (A) et résolus (B) sont affichés avec leur logo de séquence et leur valeur p.

(A) Diagramme de Venn de toutes les comparaisons DMR avec les numéros de chacune des comparaisons. Les DMR spécifiques aux sensibilisés sont indiqués dans le chevauchement entre les comparaisons de DMR naïf vs sensibilisé et sensibilisé vs résolu. (B) La densité de méthylation CpG montre une distribution bimodale sans différences globales dans la méthylation de l'ADN entre les trois groupes (USC naïfs, résolus et sensibilisés), où la méthylation CpG représente la fraction de lectures totales qui sont méthylées par site CpG.

Données source

(A) Les DMR spécifiques sensibilisés parmi les USC naïfs, résolus et sensibilisés sont visualisés sous la forme d'une série de cartes thermiques affichant la méthylation de l'ADN, l'ATAC et les modifications d'histones : H3K27Ac (promoteur/amplificateur actif), HeK4Me3 (promoteur) et H3K27Me3 (répression polycomb). (B) Signaux moyens 5 kb en amont et 5 kb en aval des hypo-DMR spécifiques sensibilisés pour H3K27Me3 (répression polycomb) sont visualisés pour chaque lignée cellulaire.

Les ARN ont été isolés des USC naïfs, résolus et sensibilisés, puis analysés par ARN-seq et effectué une analyse différentielle. La signification a été déterminée par le test de Wald suivi d'une correction de tests multiples à l'aide de Benjamini-Hochberg FDR pour la valeur de p ajustée. Les voies enrichies dans les USC sensibilisés par rapport aux USC (C) naïfs et (D) résolus sont répertoriées ici. Les voies qui se chevauchent dans les deux analyses sont soulignées. L'IPA détermine la signification à l'aide d'un test exact de Fisher à queue droite, avec P ajusté <0, 05 considéré comme des voies significativement enrichies.

Données source

L'ARN a été isolé à partir d'USC juvéniles naïfs, adultes naïfs, résolus et sensibilisés (lignées cellulaires de n = 3, n = 4, n = 4, n = 3 de 14 souris). Ensuite, une analyse ARN-seq a été effectuée comme décrit sur la figure 4a. La signification a été déterminée par le test de Wald suivi d'une correction de plusieurs tests à l'aide de Benjamini-Hochberg FDR pour la valeur de p ajustée. (A) Une parcelle de volcan de gènes différentiellement exprimés (DEG) comparant les USC naïfs juvéniles et adultes naïfs identifie 8 DEG significativement (seuil FDR 0,1). (B) Le biplot PCA pour le PCA illustré à la Fig. 4a indique à quel point chaque gène influence les composants principaux (PC). Les gènes comprenant Znfx1 et Ly6e influencent fortement PC1 (Dim1) tandis que les gènes comprenant Kank1 et Krt1 influencent fortement PC2 (Dim2).

Données source

Les données d'ARN-seq de l'urothélie différenciée infectée par UTI89 et infectée par un faux (Fig. 4c) ont été utilisées pour effectuer une analyse différentielle. (A) Parcelles volcaniques comparant l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée infectée par l'UPEC à l'urothélie différenciée infectée par l'UPEC (réponse à l'infection UPEC). (B) L'expression génique différentielle de Ptgs2 entre l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée avec ou sans infection UTI89 est visualisée sous forme de carte thermique. (C) Un diagramme de volcan comparant l'urothélie différenciée sensibilisée et résolue infectée par UTI89 a été réalisée. (D) L'analyse des voies a été utilisée pour évaluer les voies biologiques enrichies en gènes exprimés de manière différentielle dans l'urothélie différenciée sensibilisée infectée par l'UPEC par rapport à l'urothélie différenciée résolue, et la signification a été déterminée par un test exact de Fisher à queue droite, avec P ajusté <0, 05 considéré voies significativement enrichies. Les voies sélectionnées avec z-score > 2 et –log(p-value) > 2 sont présentées parmi les voies spécifiques enrichies par IPA.

Données source

(AB) L'analyse du motif HOMER des données ATAC-seq de la Fig. 4 a été réalisée pour montrer l'enrichissement différentiel du motif de liaison TF dans les DAR trouvés dans les USC sensibilisés et résolus. En utilisant une liste de chacun des 10 principaux motifs connus et de novo des DAR accessibles aux sensibilisés (A) et des DAR accessibles aux résolus (B) (données étendues Fig. 3a, b), les expressions géniques différentielles de ces TF de liaison au motif dans les urothélies différenciées naïves, résolues et sensibilisées sont visualisées sous forme de cartes thermiques. Les gènes qui ne se trouvent pas dans les données RNA-seq sont exclus de la carte thermique. (C) Les 10 principaux TF exprimés de manière différentielle entre l'urothélie différenciée sensibilisée et résolue sont visualisés sous forme de carte thermique avec Log2 (FC) et P-adj indiqués. La signification des DEG a été déterminée par le test de Wald suivi d'une correction de tests multiples à l'aide de Benjamini-Hochberg FDR pour la valeur p ajustée.

(A) Les différences d'accessibilité à la chromatine, de méthylation de l'ADN et de modifications des histones, H3K4Me3 et H3K27Ac, ​​dans différents USC ont été évaluées par ATAC-seq, séquençage du bisulfite du génome entier (WGBS) et CUT&RUN. La méthylation relative de l'ADN, l'accessibilité de la chromatine et les modifications des histones au site du promoteur Casp1 comparant les USC naïfs, résolus et sensibilisés sont présentées sous forme de carte thermique en affichant le signal normalisé à l'aide de la couverture de lecture et de la fraction de lectures sous les pics de consensus. (B) Les sites de liaison TF potentiels près du promoteur Casp1 sont visualisés sur la carte du navigateur épigénome.

Tableau 1. Liste de 2 880 régions significativement différentiellement accessibles (DAR) entre les USC sensibilisés et résolus et leurs noms de gènes proximaux, à l'appui des Fig. 3a, b. Tableau 2. Principaux gènes exprimés de manière différentielle (DEG) de l'IPA comparant les urothélies différenciées sensibilisées et résolues infectées par un faux. 'Exp log ratio' indique le changement de pli log2 de l'expression. Tableau 3. Informations sur les anticorps. Tableau 4. Liste des amorces qRT–PCR.

Onglet 1 (Fig. 1b). Mesure du TER aux jours indiqués pendant 21 jours de culture/différenciation de C3H/HeN juvénile indépendant n° 1 à 5 dans des transpuits.

Onglet 1 (Fig. 2b). Évolution du titre bactérien dans l'urine sur 4 wpi lors de l'infection initiale avec 108 ufc UTI89 KanR en 8 semaines de souris femelles C3H/HeN. Onglet 2 (Fig. 2f). Taille moyenne des cellules par transpuits représentée comme médiane avec un IC à 95 %. Onglet 3 (Fig. 3g). Taille de cellule individuelle représentée comme médiane avec un IC à 95 %.

Onglet 1(Fig. 3c). DAR accessibles aux personnes sensibilisées (comparaison entre les DAR sensibilisés et résolus, n = 747 DAR, changement de facteur > 1,5, FDR < 0,05) utilisés pour l'analyse des termes GREAT GO. Languette 2 (Fig. 3d–h). Liste de 189 régions méthylées différentiellement (DMR) spécifiques aux personnes sensibilisées à partir de comparaisons naïves vs sensibilisées et résolues vs sensibilisées.

Onglet 1 (Fig. 4b-1). Comparaison DEG entre les USC sensibilisés et résolus, prenant également en charge l'ED Fig. 6b. Onglet 2 (Fig. 4b-2). Comparaison DEG entre les USC sensibilisés et naïfs, prenant également en charge l'ED Fig. 6a. Onglet 3 (Fig. 4d). Comparaison DEG entre l'urothélie différenciée sensibilisée infectée fictive et résolue utilisée pour le tracé du volcan. Onglet 4 (Fig. 4e). Analyse de la voie IPA des urothélies différenciées sensibilisées et résolues infectées par un faux. Onglet 5 (Fig. 4f). Une visualisation par carte thermique de l'expression génique différentielle dans l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée avec ou sans infection, prenant également en charge les données étendues Figs. 8b et 9.

Onglet 1 (Fig. 5d). L'expression génique de Casp1 dans l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée avec ou sans infection UTI89 a été mesurée par qRT-PCR (n = 4, 4, 4, 5, 4, 4). Onglet 2 (Fig. 5f). Mesure de la LDH de l'urothélie différenciée naïve, résolue et sensibilisée lors d'une infection UTI89 à 4 hpi. Données obtenues à partir de n = 7, 10, 14, 8, 10, 4, 6. Tab 3 (Fig. 5g). Des souris naïves, résolues et sensibilisées ont été provoquées avec 107 c f u de WT UTI89 (HlyA +) ou UTI89ΔhlyA. Les données ont été combinées à partir de deux à trois expériences indépendantes. Les charges bactériennes de la vessie à 6 hpi, mesurées à partir de n = 10, 7, 19, 8, 14, 11 souris, respectivement, ont été examinées au cours de 2 à 3 expériences indépendantes. Onglet 4 (Fig. 5h). Incidence de la cystite chronique par rapport à la résolution à 28 dpi pour les souris naïves, résolues et sensibilisées lors d'une infection de provocation.

Figure 5e. Images de gel et de transfert non recadrées d'urothélies différenciées N3, R3 et S3. a, Gel entier chargé de deux séries de 6 échantillons (cellules urothéliales N3, R3 et S3 infectées par un faux PBS et cellules urothéliales N3, R3 et S3 infectées par UTI89) avec du colorant de chargement Tris-glycine 4–20 %. Les cellules urothéliales sensibilisées non infectées et infectées avaient une coloration à la caspase-1. Seules les données N3, R3 et S3 faussement infectées ont été utilisées pour l'article, car les cellules sensibilisées exprimaient la caspase-1, quelle que soit la condition d'infection. b, image de la membrane (une coupe de 1 à 6 voies a été utilisée pour la coloration de la β-actine et une coupe de 7 à 14 voies a été utilisée pour la coloration de la caspase-1). c, le développement du film a été effectué séparément car la coloration de la β-actine et de la caspase-1 nécessitait des temps d'exposition différents (1 min et 3 min, respectivement). L'expression de la β-actine (~ 48 kDa) était similaire dans tous les échantillons, tandis que seules les cellules sensibilisées présentaient une coloration aux emplacements P45 pro-caspase-1 (~ 45 kDa) et P35 caspase-1 (~ 35 kDa). Pour la figure 5e du manuscrit, (d) une image d'exposition de 20 s a été utilisée au lieu d'une exposition de 1 min pour la β-actine pour une séparation plus nette des bandes.

Onglet 1 (ED Fig. 1b). Expression de p63 mesurée par qRT – PCR à partir de cellules primaires C3H / HeN cultivées dans les conditions indiquées dans ED Fig. 1b – d. Chaque condition aux points de temps de mesure est n = 12, 9, 13, 12, 12, 11, 11, respectivement. Onglet 2 (ED Fig. 1c). Mesure de l'expression d'Axin2 en utilisant le même ensemble d'échantillons. Onglet 3 (ED Fig. 1d). Mesure de l'expression Upk3a en utilisant le même ensemble d'échantillons.

Onglet 1 (ED Fig. 2a). Comparaison de la résistance électrique transépithéliale (TER) entre les C3H/HeN USC primaires et les cellules 5637 pendant 2 à 3 semaines de culture en condition de différenciation. Onglet 2 (ED Fig. 2b). Comparaison de la taille des cellules de surface entre les cellules urothéliales C3H/HeN primaires et 5637 cellules (n = 10 chacune).

Onglet 1 (ED Fig. 4a-1). DMR naïfs vs sensibilisés. Onglet 2 (ED Fig. 4a-2). DMR naïfs vs résolus. Onglet 3 (ED Fig. 4a-3). DMR résolus vs sensibilisés.

Onglet 1 (ED Fig. 6c). Analyse de la voie IPA des USC sensibilisés vs naïfs. Onglet 2 (ED Fig. 6d). Analyse de la voie IPA des USC sensibilisés vs résolus.

Onglet 1 (ED Fig. 7a). DEG comparant les USC naïfs juvéniles et adultes naïfs utilisés pour le tracé du volcan.

Onglet 1 (ED Fig. 8a-1). Comparaison DEG entre l'urothélie différenciée naïve infectée par l'UTI89 et l'infection fictive, utilisée pour le tracé du volcan. Onglet 2 (ED Fig. 8a-2). Comparaison DEG entre l'urothélie différenciée résolue infectée par UTI89 et infectée par une simulation, utilisée pour le tracé du volcan. Onglet 3 (ED Fig. 8a-3). Comparaison DEG entre l'urothélie différenciée sensibilisée infectée par UTI89 et simulée, utilisée pour le tracé du volcan. Onglet 4 (ED Fig. 8b). Comparaison DEG entre l'urothélie différenciée sensibilisée infectée par UTI89 et résolue, utilisée pour le tracé du volcan. Onglet 5 (ED Fig. 8c). Analyse de la voie IPA des urothélies différenciées sensibilisées et résolues infectées par UTI89.

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Réimpressions et autorisations

Russell, SK, Harrison, JK, Olson, BS et al. L'immunité formée épithéliale induite par l'infection à Escherichia coli uropathogène a un impact sur l'issue de la maladie des voies urinaires. Nat Microbiol 8, 875–888 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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Reçu : 23 décembre 2022

Accepté : 20 février 2023

Publié: 10 avril 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01346-6

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