Nouvelles

Mar 16, 2023

La fixation du méthanol est la méthode de choix pour les gouttelettes

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 522 (2023) Citer cet article

1185 accès

24 Altmétrique

Détails des métriques

La principale étape critique de la transcriptomique unicellulaire est la préparation des échantillons. Plusieurs méthodes ont été développées pour préserver les cellules après dissociation afin de dissocier la manipulation des échantillons de la préparation de la bibliothèque. Pourtant, l'adéquation de ces méthodes dépend des types de cellules à traiter. Dans ce projet, nous effectuons une comparaison systématique des méthodes de préservation de l'ARN-seq unicellulaire à base de gouttelettes sur des cellules neurales et gliales dérivées de cellules souches pluripotentes induites. Nos résultats montrent que si le DMSO fournit la meilleure qualité cellulaire en termes de molécules d'ARN et de gènes détectés par cellule, il affecte fortement la composition cellulaire et induit l'expression de gènes de stress et d'apoptose. En revanche, les échantillons fixés au méthanol affichent une composition cellulaire similaire aux échantillons frais et fournissent une bonne qualité cellulaire et peu de biais d'expression. Pris ensemble, nos résultats montrent que la fixation du méthanol est la méthode de choix pour effectuer des expériences de transcriptomique unicellulaire à base de gouttelettes sur des populations de cellules neurales.

Les méthodes de transcriptomique unicellulaire (scRNA-seq) ont révolutionné la façon dont nous étudions à haut débit l'expression des gènes à travers les individus, les tissus et même dans la maladie1,2,3. Auparavant, les études se limitaient à identifier les changements dans les niveaux d'expression des gènes en vrac, c'est-à-dire dans la population de cellules qui composaient un échantillon particulier. Ainsi, ces approches ont mélangé deux effets différents : des changements dans la composition cellulaire de l'échantillon d'intérêt et des changements dans l'expression des gènes au sein des cellules individuelles. Maintenant, scRNA-seq permet d'évaluer ces deux effets indépendamment et peut détecter à la fois les changements dans la composition cellulaire4,5 et l'expression de gènes dans des types cellulaires spécifiques6,7.

Malgré la popularité des méthodes scRNA-seq, il reste encore plusieurs défis techniques non résolus. Par exemple, la dissociation des cellules d'un tissu et l'obtention d'une bonne suspension cellulaire, nécessaire pour le scRNA-seq, est hautement spécifique au tissu et peut nécessiter l'utilisation de différentes stratégies, notamment la digestion enzymatique, la désagrégation mécanique, le tri cellulaire activé par fluorescence et d'autres technologies8,9,10,11,12. En conséquence, la préparation d'échantillons pour scRNA-seq peut prendre plusieurs heures, ce qui rend plus pratique leur traitement ultérieur. Outre les difficultés techniques, la préservation des cellules est également importante si nous devons découpler la dissociation et le traitement des échantillons pour d'autres raisons telles que l'envoi d'échantillons à une installation externe, ou si nous voulons collecter plusieurs échantillons et les traiter ensemble ultérieurement pour gagner du temps ou de l'argent. Dans tous ces cas, les chercheurs souhaitent conserver ces échantillons de manière à minimiser les différences de composition cellulaire et d'expression génique des cellules individuelles par rapport à l'échantillon d'origine. Autrement dit, la meilleure méthode de conservation sera celle qui a le moins d'impact sur la composition cellulaire de l'échantillon et le profil transcriptomique des cellules individuelles.

Plusieurs méthodes de conservation des cellules ont déjà été développées pour surmonter ce problème et dissocier la manipulation des échantillons de la préparation de la bibliothèque. Parmi eux, nous trouvons des solutions artisanales et commerciales, notamment la fixation au méthanol13,14, le propionate de dithio-bis succinimidyle15, la cryoconservation du diméthylsulfoxyde (DMSO)16,17, l'acétique-méthanol (ACME)10, le paraformaldéhyde18, CellCover17 et vivoPHIX19. Ces méthodes visent à maintenir la composition de l'échantillon et la qualité de l'ARN des cellules. Pourtant, étant donné que la préparation des échantillons est spécifique au tissu, nous nous attendons à ce que différentes méthodes de conservation puissent être optimales pour différents échantillons. Beaucoup de ces protocoles n'ont été testés que dans des lignées cellulaires ou des cellules faciles à obtenir telles que les cellules du sang périphérique et, par conséquent, on ne sait pas exactement quelle est leur performance dans des cellules difficiles à dissocier ou potentiellement endommagées lors de la dissociation. En particulier, aucune des méthodes précédentes n'a été testée sur des neurones matures ou sur des neurones dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l'homme (hiPSC), qui sont la principale source de cellules neurales pour l'étude des mécanismes moléculaires à l'origine des maladies neurologiques20.

Dans ce travail, nous avons comparé les performances de cinq méthodes de fixation ou de préservation populaires dans les cellules neurales et gliales dérivées des hiPSC. Les résultats de nos travaux montrent que les différentes méthodes de conservation/fixation affectent les échantillons de différentes manières, y compris des biais dans le profil transcriptomique, la composition cellulaire et la complexité de la bibliothèque. La cryoconservation DMSO fournit la plus haute qualité cellulaire en termes de complexité de la bibliothèque. Pourtant, les ensembles de données obtenus sont fortement appauvris en neurones et affichent une signature de stress plus forte. En revanche, ACME et vivoPHIX n'affectent pas de manière significative la composition cellulaire des suspensions unicellulaires mais endommagent l'ARN, ce qui réduit la complexité de la bibliothèque et donc le nombre de gènes et de molécules d'ARN détectés dans les cellules individuelles. Pris ensemble, nos résultats montrent que la fixation du méthanol est la méthode de choix pour effectuer des expériences de transcriptomique unicellulaire à base de gouttelettes sur des populations de cellules neurales, car elle fournit une grande complexité de bibliothèque sans affecter la composition cellulaire ni l'expression des gènes par rapport aux échantillons frais.

Des lignées cellulaires hiPSC individuelles ou regroupées ont été différenciées en neurones corticaux en utilisant un protocole décrit précédemment avec des modifications mineures. En bref, les colonies de hiPSC ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits recouvertes de matrigel et, après avoir atteint la confluence, la différenciation neurale a été induite à l'aide d'une combinaison d'inhibiteurs de BMP (noggin, dorsomorphine et SB431542) (Fig. 1a). Après 29 à 50 jours de différenciation, les cellules ont été dissociées avec une solution de papaïne-accutase pour obtenir une suspension unicellulaire (Données supplémentaires 1). À ce stade, certains des échantillons ont été directement encapsulés à l'aide de la configuration automatique Drop-seq de Dolomite Bio NADIA (frais), cryoconservés avec du DMSO17 ou conservés à l'aide de méthanol14,22, ACME10 ou de composants chimiques qui stabilisent les molécules d'ARN telles que vivoPHIX19 et CellCover17, qui ont déjà été utilisés dans la transcriptomique unicellulaire (Fig. 1b).

a Représentation schématique du protocole de différenciation des hiPSC en cellules progénitrices neurales. b Comparaison systématique des méthodes de conservation. Après la différenciation des hiPSC, toutes les cellules ont été dissociées à l'aide de papaïne-accutase et soit directement encapsulées, soit conservées à l'aide de l'un des différents réactifs testés. Après avoir été conservées, les cellules ont été décongelées ou réhydratées et encapsulées à l'aide d'une configuration Drop-seq commerciale utilisant les mêmes protocoles.

Avant d'effectuer une analyse transcriptomique unicellulaire, nous avons étudié si la conservation des suspensions unicellulaires affecte la qualité de l'ARN obtenu. À cette fin, nous avons extrait l'ARN total de cellules précurseurs neurales (NPC) fraîches et conservées stockées à -80 ° C ou 4 ° C pendant 15 jours maximum. Pour chacun des échantillons, nous avons quantifié la quantité totale d'ARN et évalué sa qualité à l'aide du système Agilent TapeStation. Nos résultats ont montré que la qualité de l'ARN extrait dépendait de la méthode de conservation utilisée. Les échantillons de DMSO, de méthanol et d'ACME avaient des valeurs de nombre d'intégrité de l'ARN (RIN) très élevées (~ 9), similaires à celles des échantillons frais. En revanche, l'échantillon vivoPHIX présentait une certaine dégradation de l'ARN (RIN ~ 7) et les échantillons traités avec CellCover présentaient des niveaux de dégradation plus forts, avec des valeurs de RIN ~ 2 à 4 ° C et ~ 6 à -80 ° C (Fig. 1 supplémentaire). Ces résultats démontrent que CellCover n'est pas adapté au stockage à long terme des cellules pour la transcriptomique unicellulaire. Compte tenu de cela, nous avons décidé de rejeter CellCover pour la comparaison systématique des méthodes de conservation.

Pour comparer l'impact des différentes méthodes de conservation, les hiPSC ont été différenciés des PNJ et soit conservés à l'aide de l'une des différentes méthodes de conservation/fixation, soit directement encapsulés avec l'équipement NADIA, une configuration commerciale Drop-seq (Fig. 1b). L'encapsulation cellulaire et la préparation de la bibliothèque ont été effectuées selon le même protocole pour tous les échantillons. Les ensembles de données obtenus ont ensuite été évalués à l'aide de différentes mesures pour évaluer leur qualité.

L'inspection des profils d'ADNc a montré que les échantillons ACME et vivoPHIX avaient moins d'ADNc et des fragments plus petits que le reste des bibliothèques (Fig. 2a), ce qui est cohérent avec la dégradation de l'ARN. Cela était attendu dans les échantillons vivoPHIX, qui présentaient déjà une qualité d'ARN inférieure après avoir été conservés pendant 2 semaines, mais pas pour les échantillons ACME, qui avaient des valeurs RIN similaires à celles des échantillons frais (Fig. 1 supplémentaire). Ensuite, nous avons évalué l'impact des méthodes de préservation sur la complexité de la bibliothèque. Nous avons utilisé samtools23 pour sous-échantillonner chacun des fichiers BAM non alignés afin de produire des fichiers contenant 10 %, 20 %, 30 %, etc. de l'ensemble de données d'origine. Chacun de ces sous-échantillons a ensuite été traité à l'aide du même pipeline de calcul pour générer des matrices d'expression génique numérique (DGE) sous-échantillonnées. Nos résultats montrent qu'à la même profondeur de séquençage, les cellules cryoconservées au DMSO et les cellules fixées au méthanol produisent un nombre comparable ou supérieur de gènes et d'identificateurs moléculaires uniques (UMI) par cellule que les cellules fraîches. En comparaison, à 7 500 lectures par cellule, les échantillons ACME et vivoPHIX contiennent environ 40 % des gènes et UMI obtenus dans des cellules fraîches (Fig. 2b) (Données supplémentaires 2). Le nombre plus élevé de gènes et d'UMI dans les échantillons de DMSO D1 et D2 et les échantillons fixés au méthanol M3 et M4 est dû aux différences d'efficacité de capture des billes utilisées pour l'encapsulation et non à une efficacité de capture intrinsèque plus élevée dans ces conditions expérimentales (Fig. 2 supplémentaire et données supplémentaires 1).

a Trace des bibliothèques obtenues après encapsulation, y compris des échantillons frais (F1 et F2), méthanol (M1, M2, M3 et M4), DMSO (D1, D2 et D3), ACME (A1 et A2) et vivoPHIX (V1 et V2). Les bibliothèques des échantillons fixés avec vivoPHIX et ACME ont des tailles de fragments plus petites et moins d'ARN, ce qui est cohérent avec la dégradation de l'ARN. b Parcelles de sous-échantillonnage montrant le nombre de gènes et d'UMI en fonction de la profondeur de séquençage (lectures moyennes par cellule). Dans les deux cas, les bibliothèques de DMSO (bleu) et de méthanol (vert) ont une profondeur équivalente ou supérieure à celle des échantillons frais (rouge). c Parcelles de violon montrant le nombre de gènes, les UMI, le pourcentage de contenu mitochondrial (% MT) et le contenu ribosomal (% Ribo) des cellules pour chaque échantillon après avoir jeté les cellules et les doublets de mauvaise qualité. Les boîtes à moustaches incluses dans les diagrammes en violon résument la distribution des données. Les côtés supérieur et inférieur de la boîte représentent les 1er et 3e quartiles. La ligne du milieu correspond à la médiane. Les lignes ne dépassent pas 1,5 l'intervalle interquartile. d Barplots montrant le pourcentage d'UMI introniques et exoniques attribués aux cellules pour chacune des bibliothèques. Le nombre de lectures introniques varie d'environ 10 % dans l'échantillon de DMSO D1 à environ 30 % dans l'échantillon de méthanol M4. Des fractions UMI introniques élevées indiquent une fuite d'ARN cellulaire ou un enrichissement en ARN nucléaire.

La plus faible complexité des bibliothèques vivoPHIX et ACME se reflète également dans la proportion de cellules de mauvaise qualité dans les échantillons, qui ont peu d'UMI et de gènes détectés par cellule (Fig. 2c et Tableau 1), et peuvent correspondre à des gouttelettes vides ou des gouttelettes contenant des cellules brisées24. Alors que le nombre de cellules de mauvaise qualité rejetées est d'environ 10 % des cellules dans les cellules fraîches, DMSO et fixées au méthanol, ce nombre augmente jusqu'à 29 % et 49 % dans les échantillons ACME et vivoPHIX, respectivement (tableau 1 et données supplémentaires 3).

Après avoir jeté les cellules de mauvaise qualité, les cellules vivoPHIX et ACME restantes présentent encore de nettes différences de qualité (Fig. 2c et Tableau 1). Fait intéressant, le pourcentage d'UMI cartographiés sur les gènes mitochondriaux était également faible dans tous les échantillons, ce qui suggère que le nombre inférieur d'ARN capturés dans ces échantillons n'est peut-être pas dû à une fuite d'ARN ou à des dommages cellulaires24, mais plutôt à une efficacité de capture d'ARN ou à une dégradation de l'ARN. De plus, les échantillons d'ACME ont montré une fraction beaucoup plus élevée d'UMI cartographiés sur des protéines ribosomiques que n'importe lequel des autres échantillons (Fig. 2c), qui a également été précédemment associée à des cellules de mauvaise qualité ou à des artefacts techniques25.

L'une des raisons pour lesquelles les cellules fixes vivoPHIX et ACME ont moins d'ARN par cellule pourrait être que la méthode de fixation facilite la rupture des cellules. Dans ce cas, nous nous attendrions à une complexité de bibliothèque plus faible et à une fraction plus élevée de lectures provenant de régions introniques, qui proviennent principalement de pré-ARNm et sont enrichies en noyaux26,27. Dans nos échantillons, la fraction de lectures introniques provenant de chaque échantillon était variable selon les méthodes de conservation, allant de 10 % dans les échantillons de DMSO à environ 30 % dans les échantillons de méthanol et vivoPHIX (Fig. 2d). La fraction plus élevée de lectures introniques in vivo dans les échantillons de PHIX et de méthanol indique un enrichissement en ARN nucléaire26,27. Pourtant, étant donné que le nombre de gènes et d'UMI détectés dans le méthanol est, en moyenne, environ trois fois plus élevé que les échantillons in vivoPHIX (Données supplémentaires 2), la fuite d'ARN n'est probablement pas la cause de ce biais. Ensemble, ces résultats démontrent que les méthodes de conservation vivoPHIX et ACME affectent de manière significative la qualité des transcriptomes unicellulaires obtenus à partir de populations humaines de NPC, bien que cela ne puisse pas être expliqué par une fuite accrue d'ARN ou une rupture cellulaire.

Après avoir évalué les paramètres de qualité globale des échantillons, nous avons étudié si les méthodes de conservation affectent la composition cellulaire des échantillons. Pour cela, nous avons regroupé tous les échantillons et les avons analysés ensemble. L'analyse initiale a montré un fort effet de lot dû principalement à la méthode de conservation utilisée. Comme on peut le voir sur la Fig. 3 supplémentaire, avant l'intégration, les cellules de différentes expériences occupent différentes régions du tracé d'approximation et de projection de variété uniforme (UMAP) (Fig. 3 supplémentaire). Ainsi, nous avons utilisé Harmony28 pour intégrer les ensembles de données et identifier les populations cellulaires obtenues à partir de la différenciation hiPSC (Fig. 3). Après correction par lots, nous avons identifié 12 populations cellulaires correspondant à des progéniteurs proliférants, des PNJ, des précurseurs astrogliaux, des progéniteurs intermédiaires et différents types de neurones caractérisés par l'expression de gènes marqueurs spécifiques (Fig. 3, Figs. Supplémentaires 4 et 5, et Données Supplémentaires 4 et 5). Tous les clusters identifiés étaient présents dans tous les échantillons individuels. Pourtant, l'abondance relative de chacune des populations de cellules a changé en fonction de la méthode de conservation utilisée (Fig. 4a et Fig. 6 supplémentaire). Pour déterminer si ces changements étaient dus à des biais expérimentaux ou s'il s'agissait de biais systématiques dus à la méthode de fixation, nous avons effectué une analyse de la composition des échantillons avec scCODA, un outil récemment développé qui peut identifier de manière fiable les changements dans les ensembles de données unicellulaires même avec un faible nombre de répliques5. Contrairement à d'autres méthodes, scCODA modélise le biais de composition de l'échantillon dans son ensemble et non pour chaque groupe indépendamment. Cela empêche d'identifier à tort les changements de proportion de cellules dus à l'épuisement d'une population unicellulaire, ce qui entraînerait artificiellement l'augmentation de toutes les autres populations de cellules dans l'échantillon. Pour identifier les changements de composition, nous avons choisi comme groupe de référence des échantillons frais, afin que les résultats indiquent si nous trouvons des changements de composition par rapport à ce groupe. Les résultats de cette analyse mettent en évidence une déplétion significative des neurones excitateurs dans les échantillons cryoconservés au DMSO par rapport aux échantillons frais, alors que nous ne trouvons pas de biais de composition significatifs dans les échantillons conservés à l'aide de l'une des autres méthodes (Fig. 4b).

un tracé UMAP montrant les populations cellulaires identifiées dans les échantillons de PNJ, qui comprennent différents types de populations de PNJ, des précurseurs astrogliaux, des progéniteurs intermédiaires et des neurones immatures excitateurs et inhibiteurs. b Présentez des parcelles de gènes marqueurs connus qui ont été utilisés pour identifier les populations cellulaires dans (a), y compris les marqueurs NPC (SOX2), les marqueurs de prolifération (TOP2A et PCNA), les marqueurs de destin corticaux (FOXG1), les marqueurs de destin dorsal (PAX3), les marqueurs de plaque de toit (PTN), les marqueurs astrogliaux (ADGRV1 et GJA1), les marqueurs neuronaux immatures (DCX), les marqueurs progéniteurs intermédiaires (HES6), inhibiteurs (GAD2) et excit marqueurs neuronaux atoires (SLC17A6).

a Graphiques UMAP montrant la distribution des cellules dans les grappes pour chacune des méthodes de fixation. Les grappes sont colorées comme sur la figure 3a. Les échantillons conservés dans le DMSO montrent une forte déplétion des cellules dans les amas neuronaux par rapport à tous les autres échantillons. b Barplot montrant la proportion moyenne de cellules affectées à chaque cluster pour chaque méthode. La hauteur des barres représente la moyenne de tous les échantillons conservés selon la même méthode. Les points noirs représentent la proportion de cellules dans les échantillons individuels. * Indique des échantillons avec une différence significative dans la proportion de cellules dans un échantillon particulier par rapport aux échantillons frais comme prédit par scCODA, ce qui signifie que le score moyen de l'échantillon est inférieur à zéro selon le modèle scCODA compte tenu d'un taux de fausse découverte <0,05.

Enfin, nous avons recherché si les méthodes de conservation induisaient des changements dans l'expression des gènes susceptibles d'affecter la comparaison entre les échantillons. Une comparaison de l'expression génique entre les échantillons montre une corrélation élevée entre tous les échantillons (coefficient de corrélation de Pearson R> = 0, 8), bien que les échantillons ACME et vivoPHIX aient des corrélations légèrement inférieures avec tous les autres échantillons (Fig. 7 supplémentaire). Cette corrélation plus faible peut s'expliquer par des changements globaux ou spécifiques au type de cellule dans l'expression des gènes, mais également par des biais de composition. Pour approfondir cette question, nous avons généré des comptages pseudobulk pour chacun des clusters pour chaque échantillon séparément et effectué une analyse de corrélation au niveau du cluster. Nos analyses montrent que la méthode de fixation induit des biais dans le regroupement des populations de cellules à travers les échantillons (Fig. 8 supplémentaire). Cependant, la grande similitude entre les différents clusters, c'est-à-dire les populations de PNJ, fait que les clusters de cellules sont préservés avec une méthode particulière regroupés. Pour résoudre ce problème, nous avons évalué le regroupement des échantillons pour chaque groupe de cellules indépendamment à l'aide de sigclust229, une méthode statistique conçue pour tester la signification statistique du regroupement hiérarchique. Comme on peut le voir sur la figure 5, dans tous les cas, les échantillons de méthanol ont été regroupés avec des échantillons frais. En revanche, dans 8 des 12 populations de cellules identifiées, plusieurs échantillons vivoPHIX et ACME se regroupent séparément des échantillons frais. Cette analyse confirme ainsi que le profil d'expression global des cellules fixées au méthanol dans chaque cluster est plus similaire à celui des cellules fraîches qu'à celui des cellules conservées à l'aide d'autres méthodes.

Dendrogramme montrant la similarité des profils d'expression génique des cellules des différents échantillons appartenant à un même amas cellulaire. Les échantillons sont étiquetés comme suit : frais (F1 et F2, couleur rouge), méthanol (M1, M2, M3 et M4, couleur verte), DMSO (D1, D2 et D3, couleur bleue), ACME (A1 et A2, couleur violette) et vivoPHIX (V1 et V2, couleur magenta). La signification dans le clustering hiérarchique est évaluée à l'aide du test shc implémenté dans sigclust2. Les branches importantes du dendrogramme sont surlignées en rose. *, ** et *** marquent les branches avec une valeur P inférieure à 0,05, 0,01 ou 0,001, respectivement. Les branches non significatives sont surlignées en jaune et les branches non testées en bleu et vert.

Des études antérieures ont montré que les méthodes de dissociation et de conservation peuvent induire un stress cellulaire qui se reflète au niveau transcriptomique9,30. En conséquence, nous avons vérifié l'expression des gènes immédiats précoces (IEG) et des marqueurs d'apoptose dans nos ensembles de données. La signature du gène de l'apoptose était plus élevée dans les échantillons ACME, vivoPHIX et DMSO que dans les échantillons frais, et plus élevée dans le DMSO que dans les échantillons fixés au méthanol, bien que ces différences soient minimes (Fig. 6a). Tous les échantillons fixes avaient une expression d'IEG plus élevée que les échantillons frais, bien que les cellules cryoconservées au DMSO aient montré une expression d'IEG plus élevée que tous les autres échantillons (Fig. 6b). Ce résultat indique que la congélation et la décongélation stressent les cellules d'une manière qui se reflète globalement sur le profil transcriptomique des cellules. Pour déterminer si la préservation des cellules induisait des biais d'expression supplémentaires au niveau du cluster individuel, nous avons utilisé muscat31 pour identifier les gènes exprimés de manière différentielle (DEG) spécifiques au type de cellule dans des échantillons fixes par rapport aux frais (Données supplémentaires 6). Notre analyse montre que le nombre de gènes différentiellement exprimés (DEG) est très différent selon les méthodes de fixation. Alors que les échantillons vivoPHIX présentent de nombreux DEG dans tous les groupes, la quantité de DEG significatifs est proche de zéro dans les échantillons de DMSO (Fig. 6c et données supplémentaires 6). Nous avons utilisé l'analyse d'enrichissement des termes d'ontologie génique pour déterminer si différentes méthodes de fixation introduiraient des biais dans l'expression des gènes liés à des fonctions particulières. Nos résultats n'ont trouvé aucun terme significatif surreprésenté dans les gènes constamment régulés à la hausse ou à la baisse dans plusieurs grappes de cellules, ce qui suggère que l'effet que les méthodes de fixation ont sur l'expression des gènes dans les grappes n'est pas lié à des fonctions ou à des emplacements cellulaires particuliers.

a, b Graphiques de violon montrant la distribution des scores d'enrichissement des signatures d'apoptose (a) et de stress (b) selon les méthodes de préparation des échantillons. Les boîtes à moustaches incluses dans les diagrammes en violon résument la distribution des données. Les côtés supérieur et inférieur de la boîte représentent les 1er et 3e quartiles. La ligne du milieu correspond à la médiane. Les lignes ne dépassent pas 1,5 l'intervalle interquartile. a Le score d'enrichissement de l'apoptose est plus élevé dans les échantillons DMSO, ACME et vivoPHIX par rapport aux échantillons frais (astérisques noirs), et plus élevé dans le DMSO par rapport au méthanol (astérisques bleus). b La signature de stress est plus élevée pour toutes les méthodes de fixation/conservation par rapport aux échantillons frais (astérisques noirs), et également plus élevée dans le DMSO par rapport à toutes les autres méthodes de fixation (astérisques bleus). Dans tous les cas, la signification statistique a été testée à l'aide d'un test unilatéral de somme des rangs de Wilcoxon. Les comparaisons avec les produits frais sont marquées en noir * et les comparaisons du DMSO avec d'autres méthodes de fixation sont en bleu. ** indique une valeur P <0,01 ; *** indique une valeur P <0,001. c Barplot montrant le nombre de gènes significativement régulés à la hausse et à la baisse pour chaque méthode de fixation dans chaque groupe de cellules avec un log2fc > = |0,58| et une valeur P ajustée du test de Wald <0,05. Les échantillons vivoPHIX et de méthanol ont plus de DEG dans les grappes, tandis que le nombre de DEG dans le DMSO est proche de zéro.

Les méthodes de transcriptomique unicellulaire deviennent la nouvelle norme pour étudier les changements transcriptomiques à travers les échantillons et les conditions. Ces technologies sont relativement nouvelles par rapport aux méthodes de transcriptomique en masse telles que RNA-seq ou 3' seq. Ainsi, dans de nombreux cas, il n'existe pas encore de protocoles de préparation standard pour les différents échantillons utilisés. Dans ce projet, nous avons comparé la façon dont les méthodes de préservation et de fixation couramment utilisées affectent la composition cellulaire et l'expression des populations de cellules neurales et gliales dérivées des hiPSC. Ce travail prolonge ainsi les études antérieures qui ont comparé les effets d'une seule méthode de conservation sur la qualité des transcriptomes unicellulaires ou qui se sont concentrées sur leurs effets sur différents types de cellules et peuvent donc ne pas être applicables aux cellules neurales13,14,15,16,17,18,19. Nos résultats montrent que différentes méthodes de préservation/fixation affectent la qualité des ensembles de données transcriptomiques unicellulaires de différentes manières, notamment une diminution de la complexité de la bibliothèque, des modifications de la composition cellulaire et des altérations du profil d'expression des cellules individuelles (tableau 2).

En termes de complexité de la bibliothèque, les échantillons ACME et vivoPHIX montrent une forte diminution de la quantité d'ADNc obtenue après encapsulation d'une seule cellule (Fig. 2a), ce qui se traduit également par une détection plus faible des gènes et des UMI (Fig. 2b). Dans le cas des échantillons vivoPHIX, cela pourrait être lié à une qualité initiale inférieure de l'échantillon d'ARN, qui avait des valeurs RIN inférieures (Fig. 1 supplémentaire). Dans le cas des échantillons ACME, qui avaient une qualité d'ARN équivalente à celle des échantillons frais, cette diminution est cohérente avec les rapports précédents qui montrent que l'intégrité de l'ARN diminue dans les échantillons fixés ACME au fil du temps10. La moindre complexité de la bibliothèque de ces échantillons en raison d'un taux d'abandon plus élevé est probablement la cause des biais dans l'analyse de regroupement de la population cellulaire (Fig. 5) et pourrait contribuer au nombre de DEG identifiés dans chaque cluster (Fig. 6c et Données supplémentaires 6).

En ce qui concerne la composition cellulaire, nos résultats mettent clairement en évidence une forte déplétion des cellules neuronales dans les échantillons cryoconservés au DMSO (Fig. 4). Différentes lignées cellulaires et expériences ont été utilisées pour ce projet, ce qui pourrait être un effet de confusion affectant la composition du type cellulaire. Cependant, la comparaison des échantillons de DMSO et de méthanol provenant de la même différenciation (M3, M4, D1 et D2) (Données supplémentaires 1) met en évidence une nette différence dans l'abondance relative des populations de neurones excitateurs entre les échantillons de méthanol et de DMSO, fournissant une preuve supplémentaire que les biais de composition sont dus à la procédure de fixation/conservation (Fig. 6 supplémentaire). Alors que le DMSO a déjà été signalé comme une excellente méthode de préservation des cellules pour la transcriptomique unicellulaire16,17, aucune de ces études n'a examiné l'effet du DMSO sur les cellules neuronales matures. La réduction du nombre de neurones récupérés pourrait être due à la toxicité du DMSO32,33 ou à la gliose réactive induite par le DMSO, qui a été rapportée précédemment et peut affecter les cellules après une très brève exposition32, ou simplement à la plus grande fragilité des neurones qui ne survivent pas aux cycles de décongélation/congélation. Ce dernier pourrait expliquer l'expression plus élevée des gènes de stress dans les échantillons de DMSO par rapport aux échantillons frais et à tous les autres échantillons fixes. Pourtant, les neurones obtenus ne présentent pas de forts biais d'expression car ils se regroupent souvent avec des échantillons frais et fixés au méthanol et n'ont pratiquement pas de DEG significatifs (Fig. 6 et données supplémentaires 6). Bien que nos résultats démontrent que le DMSO n'est pas un bon choix pour effectuer une analyse de la composition des cellules dérivées de hiPSC, il pourrait être utilisé pour profiler des échantillons de neurones purs lorsque la disponibilité des cellules n'est pas un problème.

Nos analyses démontrent également que les différentes méthodes de fixation/conservation modifient l'expression des gènes de différentes manières. Les biais d'expression induits par la fixation peuvent affecter le profil d'expression global des amas de cellules, comme c'est le cas des échantillons vivoPHIX et ACME (Fig. 5 et Fig. 7 et 8 supplémentaires), ou entraîner des changements spécifiques au type de cellule dans l'expression génique (Fig. 6c et données supplémentaires 6). De plus, nous avons trouvé une expression plus élevée des IEG dans tous les échantillons par rapport aux cellules fraîches et une expression plus élevée des marqueurs d'apoptose dans les cellules vivoPHIX, ACME et DMSO par rapport aux cellules fraîches (Fig. 6a, b). Ces résultats confirment les observations précédentes qui associaient une expression IEG plus élevée aux biais de dissociation et de cryoconservation9,30, et soulignent la nécessité de contrôles précis et d'expériences de validation pour confirmer les changements d'expression génique observés dans les données unicellulaires.

Enfin, il faut considérer que les méthodes de fixation pourraient affecter la détection de gènes exprimés de manière différentielle car elles affectent la complexité de la bibliothèque et le nombre de gènes et d'UMI. Étant donné que la capacité à détecter des gènes exprimés de manière différentielle est directement liée au nombre de lectures ou d'UMI attribuées à un gène, il est possible que de subtils changements d'expression différentielle dus à des conditions biologiques ou expérimentales puissent être manqués. Nous nous attendons à ce que ces effets soient plus importants dans les échantillons ACME et vivoPHIX, qui présentent des gènes et des UMI plus faibles détectés par cellule (Fig. 2c), bien que cela puisse être compensé si davantage de cellules sont séquencées. Les cellules fixées au méthanol ont été utilisées avec succès auparavant pour découvrir des changements dans l'expression des gènes dans les données unicellulaires dans différentes conditions biologiques, ce qui indique que cette méthode de fixation convient non seulement pour identifier l'expression des gènes homéostatiques, mais également pour identifier des différences biologiques plus subtiles.

Compte tenu des avantages et des inconvénients des différentes méthodes (tableau 2) et des limites de cette étude, notre analyse comparative indique que la fixation au méthanol est la meilleure méthode de conservation pour effectuer des analyses transcriptomiques unicellulaires sur les cellules neurales. Les bibliothèques de cellules fixées au méthanol ont une complexité similaire à celle des cellules fraîches (Fig. 2) et ne présentent pas de biais importants dans l'expression des gènes qui affectent le profil transcriptomique global des cellules (Figs. 5 et 6 et données supplémentaires 4 et 5) ou la composition cellulaire (Fig. 4 et Fig. 6 supplémentaires), fournissant ainsi à l'échantillon le profil le plus similaire à celui des cellules fraîches.

Dans ce travail, nous avons testé l'impact des méthodes de fixation et de préservation dans les cellules neuronales et gliales dérivées de hiPSC en utilisant quelques répétitions (2 à 4) par condition. Cette quantité de répétitions est acceptable compte tenu du coût des expériences unicellulaires individuelles et des normes expérimentales actuelles. Pourtant, cela limite notre capacité à évaluer pleinement l'impact de toutes les variables possibles sur la qualité de l'échantillon. Nos résultats montrent que non seulement la méthode de conservation affecte la composition de l'échantillon et l'expression des gènes. D'autres paramètres tels que les jours de conservation, la lignée cellulaire utilisée, l'expérience de différenciation et le lot de billes ont un impact sur les transcriptomes unicellulaires finaux. Cependant, ce travail ne fournit pas une comparaison approfondie de tous, ce qui sort du cadre de ce projet. Par conséquent, les résultats fournis dans ce travail peuvent être différents lorsque vous travaillez avec différents types de cellules, échantillons et technologie unicellulaire ou en utilisant des conditions expérimentales différentes de celles utilisées ici. Les chercheurs doivent tenir compte de tous ces facteurs et optimiser les expériences individuelles étant donné que nos résultats démontrent que le traitement des échantillons peut avoir un impact significatif sur les résultats des expériences de transcriptomique unicellulaire.

Les hiPSC ont été maintenus sur des boîtes revêtues de matrigel 1:40 (Corning, # 354277) dans un milieu mTeSR-1 complété (StemCell Technologies, # 85850) avec 500 U ml-1 de pénicilline et 500 mg ml-1 de streptomycine (Gibco, # 15140122). Pour la différenciation des neurones corticaux, le protocole décrit précédemment21 a été suivi avec de légères modifications. En bref, les colonies hiPSC ont été ensemencées dans des plaques à 12 puits recouvertes de matrigel 1:40 à une densité cellulaire suffisante pour assurer une confluence à 100 % un jour après le placage. Au jour 1, le milieu a été remplacé par un milieu d'induction neurale (milieu de maintenance neurale (ratio 1:1 de DMEM/F-12 GlutaMAX (Gibco, #10565018) et de milieu Neurobasal (Gibco, #21103049) avec 1× N-2 (Gibco, #17502048), 1× B-27 (Gibco, #17504044), 5 μg ml-1 insuline (Sigma, #I9278), 1 mM l-glutamine (Gibco, #35050061), 100 μM acides aminés non essentiels (Lonza, #BE13-114E), 100 μM 2-mercaptoéthanol (Gibco, #31350010), 50 U ml-1 pénicilline et 50 mg ml-1 streptomycine) additionné de 500 ng ml-1 noggin (R&D Systems, # 3344-NG-050), 1 μM Dorsomorphin (StemCell technologies, # 72102) et 10 μM SB431542 (Calbiochem, # 616461)). Le support d'induction neurale a été remplacé tous les jours pendant 9 à 12 jours jusqu'à ce que la feuille neuroépithéliale soit formée. À ce stade, les cellules neuroépithéliales ont été collectées en agrégats à l'aide de dispase (StemCell Technologies, # 07923) et ensemencées sur une plaque à six puits recouverte de 20 μg ml-1 de laminine (Sigma, # L2020) contenant 2 ml de milieu de maintenance neuronale. Les cellules ont été incubées dans un milieu de maintenance neurale avec remplacement tous les deux jours jusqu'à ce que les structures de la rosette neurale soient reconnaissables (jours 12 à 15 après l'induction neurale). Ensuite, 20 ng ml-1 de bFGF (Peprotech, #100-18B) ont été ajoutés au milieu pendant 2 à 4 jours pour favoriser l'expansion des cellules souches neuro. Au jour 18 après l'induction neurale, les cellules ont été séparées avec de la dispase pour l'amplification des précurseurs. Au jour 24, lorsque les neurones commencent à s'accumuler à l'extérieur des rosettes, les cellules ont été passées 1: 3 à l'aide d'Accutase (Merck Millipore, #SCR005) dans une suspension unicellulaire et ensemencées à 50 000 cellules cm-2 sur 20 μg ml-1 plaque à six puits recouverte de laminine. Après une semaine, les cellules ont été à nouveau divisées (rapport 1: 4) et ensemencées sur des plaques à six puits recouvertes de laminine de 20 μg ml-1 et ont poursuivi la culture jusqu'à 50 jours (entre 29 et 50) après l'induction neurale avec des changements de milieu tous les deux jours. Plusieurs lignées cellulaires hiPSCs et expériences de différenciation ont été utilisées pour l'obtention de PNJ (Données supplémentaires 1). Des informations supplémentaires sur les médias et les réactifs utilisés dans la culture cellulaire peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 7. Toutes les lignées cellulaires hiPSC utilisées dans ce travail ont été générées avec le consentement éclairé de donneurs humains. L'utilisation des hiPSC dans ce travail a été approuvée par la Commission nationale espagnole des garanties concernant le don et l'utilisation de cellules et de tissus humains de l'Institut national de la santé Carlos III.

Les cellules ont été dissociées en une suspension unicellulaire selon un protocole précédemment décrit optimisé pour les techniques de scRNA-seq36. En résumé, les cellules ont été dissociées par voie enzymatique pendant 35 min à 37 ° C à l'aide d'un tampon de dissociation papaïne-accutase (1: 1) (PDS Kit, Papain, Worthington Biochemical Corporation, # LK003176), et trempées avec DMEM / F-12 GlutaMAX additionné de 10 µM d'inhibiteur ROCK (Y-27632, StemCell Technologies, # 72304) et 0, 033 mg ml-1 de DNase (DNase (D2), Worthington Biochemical Corporation, #LK003170). Des informations supplémentaires sur les médias et les réactifs utilisés dans la culture cellulaire peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 7. La suspension cellulaire a été filtrée à travers une passoire de 40 µm (Pluriselect Life Science, # 43-10040-60) puis centrifugée à 150 g pendant 3 min à température ambiante. Après trois lavages avec 0, 4 mg ml-1 de BSA dans du DPBS, les cellules ont été comptées et la viabilité par la méthode au bleu trypan a été enregistrée. Seuls les échantillons avec une viabilité cellulaire supérieure à 75 % ont été inclus dans l'étude.

Environ 2,5 × 106 cellules après dissociation ont été cryoconservées dans des cryovials dans 1 ml de milieu de congélation, milieu de maintenance neurale additionné de 10% v/v de DMSO (Sigma-Aldrich, #D2438) et 20 ng ml-1 bFGF. Les cryotubes ont été placés dans un récipient de congélation Mr. Frosty (Nalgene, # 5100-001) préalablement rempli d'alcool isopropylique et stocké à -80 ° C pendant la nuit (ON), puis transférés pour un stockage prolongé dans un congélateur à azote en phase vapeur. Les échantillons cryoconservés au DMSO ont été décongelés dans un bain-marie à 37 ° C sous agitation continue, puis 1 ml de milieu de maintenance a été ajouté au flacon et transféré dans un tube Falcon avec 10 ml de milieu de maintenance. Les cellules ont été centrifugées à 160 g pendant 5 min à température ambiante. Le surnageant a été soigneusement retiré et le culot cellulaire a été lavé avec 1 ml de DPBS et 0, 01% de BSA, puis transféré dans un tube DNA LoBind de 1, 5 ml (Eppendorf, # 022431021). Les cellules ont été à nouveau culottées et remises en suspension dans du DPBS et 0,01 % de BSA. Enfin, les cellules ont été filtrées à travers un tamis de 40 µm et comptées dans une chambre Neubauer en utilisant la méthode standard au bleu trypan.

Après le protocole de fixation au méthanol pour l'ARN-seq unicellulaire dans 10X Genomics (CG000136), 200 µl de DPBS glacé ont été ajoutés pour remettre en suspension un culot de 2, 5 × 106 cellules. 800 ul de méthanol à 100 % pré-refroidi ont été ajoutés goutte à goutte jusqu'à ce que la concentration finale en méthanol atteigne 80 %. Les échantillons dans des tubes d'ADN LoBind ont été placés sur de la glace pendant 30 min, puis allumés à -20 ° C et enfin transférés à -80 ° C pour un stockage prolongé. Les cellules fixées au méthanol ont été décongelées sur de la glace et centrifugées pour éliminer le surnageant. Le culot cellulaire a été lavé et réhydraté dans 1 ml de DPBS avec 0, 01% de BSA et 0, 2 U µl-1 d'inhibiteur de RNase (Takara Bio, # 2313 A) et 1 mM de DTT (Sigma-Aldrich, # D0632)) pour éviter la dégradation de l'ARN. Les cellules ont été à nouveau filtrées avec une passoire de 40 µm et comptées dans une chambre de Neubauer.

Un culot de 1 × 106 à 5 × 106 cellules a été doucement remis en suspension avec 100 µl de tampon de lavage (DPBS avec 0,01% de BSA et 0,2 U µl-1 d'inhibiteur de RNase et 1 mM de DTT). Ensuite, une solution d'ACME (tampon de lavage : méthanol : acide acétique : glycérol ; dans un rapport final de 13:3:2:2) a été ajoutée goutte à goutte tout en mélangeant le tube jusqu'à un volume final de 1 ml et incubée pendant 30 minutes à température ambiante. Après centrifugation à 1000 g à 4 ° C pendant 5 min et rejet du surnageant, le culot cellulaire fixe a été lavé deux fois dans 1 ml de tampon de lavage et remis en suspension dans 1 ml de tampon de lavage additionné de 10% v / v DMSO pour stockage à -80 ° C. Les échantillons fixés à l'ACME ont été décongelés et réhydratés selon le même protocole que les échantillons fixés au méthanol.

Un culot cellulaire contenant 1 × 106 à 5 × 106 cellules a été doucement remis en suspension avec 25 µl de DPBS avec 0,01 % de BSA. Pour la fixation de l'échantillon, 75 µl de réactif vivoPHIX (Rapid Labs, #RD-VIVO-5) (rapport 3:1) ont été ajoutés et mélangés en retournant le tube 10 fois au cours des 5 premières minutes de fixation. Ensuite, le tube a été placé sur un dispositif à roue à température ambiante et incubé pendant 30 min de plus. Les échantillons ont été stockés à 4 ° C ON puis transférés à -80 ° C pour un stockage prolongé.

Les échantillons fixés au vivoPHIX ont été réhydratés par l'ajout d'un volume (100 µl) d'éthanol à 100 % et en mélangeant le tube plusieurs fois par inversion. Ensuite, les cellules ont été culottées à 1000 g pendant 5 min à température ambiante et le surnageant a été jeté. 0,5 ml de vivoPHIX-SCAA (1 volume de vivoPHIX avec trois volumes d'acide acétique glacial) a été ajouté très lentement au culot cellulaire sans le déranger et incubé pendant exactement 3 min à TA. Le vivoPHIX-SCAA du culot a été retiré et les cellules ont été à nouveau culottées à 100 g pendant 5 min à température ambiante pour éliminer tout liquide restant à l'aide d'une pointe de pipette P20. Le culot cellulaire a été lavé trois fois avec du DPBS avec 0, 01% de BSA et 0, 2 U ul-1 d'inhibiteur de RNase et 1 mM de DTT, et le surnageant a été jeté. Les cellules ont été filtrées avec une passoire de 40 µm et comptées dans une chambre de Neubauer.

Un culot cellulaire contenant 1 × 106 à 5 × 106 cellules a été doucement remis en suspension en tapotant le tube avec le tampon de lavage restant (25 µl) après dissociation enzymatique avec une solution d'accutase-papaïne. Ensuite, 10 volumes de CellCover (250 µl) (Anacyte Laboratories) ont été ajoutés et la suspension cellulaire a été stockée à 4° ou -80°C jusqu'à utilisation. Le protocole recommandé fourni à l'entreprise ne suggère pas de congeler les échantillons ou de les conserver pendant une période plus longue de 2 à 7 jours. Cependant, nous avons voulu tester l'efficacité de ce réactif dans notre flux de travail car le protocole est assez simple. Les échantillons fixés au CellCover ont été récupérés selon la même procédure que pour les échantillons fixés au méthanol.

Pour une encapsulation unicellulaire dans un instrument NADIA (Dolomite Bio, #3200590), nous avons suivi le protocole fourni par la société. Nous avons chargé 75 000 cellules dans un volume de 250 µl (300 000 cellules ml−1) et 150 000 billes Macosko oligodT (ChemGenes Corporation, #Macosko-2011-10 (V + )) dans 250 µl (600 billes µl−1) préalablement lavées et remises en suspension dans du tampon de lyse (6 % w/v Ficoll PM-400, 0,2 % v /v Sarkosyl, 0,02 M EDTA, 0,2 M Tris pH 7,5 et 0,05 M DTT dans de l'eau sans nucléase). Les cellules et les billes co-coulaient dans la puce microfluidique de l'appareil avec une efficacité de capture de 5 à 7 %.

Immédiatement après la rupture de l'émulsion de gouttelettes, les ARN capturés par l'oligodT sont rétrotranscrits (maxima H RT Master Mix, Thermo, #EP0751) (Données supplémentaires 8). Ensuite, les amorces de billes en excès qui n'ont pas capturé de molécule d'ARN ont été éliminées par incubation des billes avec de l'exonucléase I (New England Biolabs, # 174M0293L) pendant 45 min à 37 ° C. Les transcriptomes unicellulaires collectés attachés aux microparticules (STAMPS) ont été comptés et remis en suspension dans de l'eau sans nucléase à 400 billes µl-1 et divisés en pools de 4000 billes par tube PCR et amplifiés pendant 9 ou 11 cycles PCR selon le lot de billes utilisé pour l'encapsulation (9 cycles pour le lot 01, 11 pour les autres). Après purification de l'ADNc avec 0,6:1 AMPure XP Beads (Agencourt, #A63881) pour échantillonner, la quantification avec le test Qubit dsDNA HS Assay (Thermo, #Q32851) et la vérification de la taille des fragments à l'aide d'un système TapeStation 4200 (Agilent, #G2991BA) ont été effectuées. Le kit de préparation de bibliothèque d'ADN Nextera XT (Illumina, #FC-131-1096) a été utilisé pour la tagmentation de 600 pg d'ADNc, le marquage de l'adaptateur illumina et l'amplification (Données supplémentaires 8). La taille des bibliothèques Nextera après avoir été purifiées avec des billes AMPure XP 0,6:1 à échantillonner a été déterminée à l'aide d'un système TapeStation 4200 et quantifiée avec le test Qubit dsDNA HS. 20 bp pour la lecture 1 à l'aide de l'amorce personnalisée Read1CustSeqB37 (code-barres cellulaire et UMI) et 64 bp pour la lecture 2 et 8 bp pour l'index i7.

Les bibliothèques scRNA-seq ont été traitées à l'aide du pipeline Drop-seq_tools 2.338 pour générer des matrices Digital Gene Expression (DGE). Tout d'abord, les outils Drop-seq ont été utilisés pour générer l'index et les fichiers d'annotation pour la version d'assemblage hg38 du génome humain en utilisant l'annotation Ensembl version 10039 comme référence. Ensuite, les fichiers fastq contenant des lectures appariées ont été fusionnés en un seul fichier BAM non aligné à l'aide des outils picard v2.18.1440. À l'aide de la boîte à outils Drop-seq avec les paramètres par défaut, les lectures ont ensuite été étiquetées avec la cellule et les codes-barres moléculaires, coupées à l'extrémité 5' pour supprimer les séquences d'adaptateur et à l'extrémité 3' pour supprimer les queues polyA. Ensuite, les lectures ont été mappées sur le génome humain (version hg38) avec la version STAR 2.7.0.a41. Les fichiers bam résultants ont été étiquetés avec les fichiers de métadonnées d'annotation pour identifier les lectures de gènes qui se chevauchent. Enfin, la correction du code-barres des cellules a été effectuée à l'aide des programmes DetectBeadSubstitutionError et DetectBeadSynthesisErrors également avec des paramètres par défaut. Pour estimer le nombre de cellules obtenues lors de l'encapsulation à cellule unique, nous avons utilisé un diagramme de genou en utilisant comme entrée le nombre de lectures cartographiées de manière unique attribuées aux N codes à barres supérieurs, où N est au moins cinq fois le nombre de cellules attendues. Le nombre estimé de cellules obtenu avec cette procédure a ensuite été utilisé pour générer un DGE. Deux matrices DGE ont été générées pour chaque ensemble de données, l'une contenant tous les gènes chevauchant les UMI en utilisant les paramètres LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC LOCUS_FUNCTION_LIST = INTERGENIC et une autre contenant tous les introns chevauchant les UMI en utilisant les paramètres LOCUS_FUNCTION_LIST = null LOCUS_FUNCTION_LIST = INTRONIC.

Les matrices d'expression DGE ont été analysées à l'aide de Seurat v 4.2.142. Tout d'abord, nous avons généré des objets Seurat pour chaque ensemble de données et fusionné ces objets avant d'effectuer le filtrage des cellules de faible qualité. Après inspection manuelle, toutes les cellules avec un nombre d'UMI inférieur à 200 ou supérieur à 17 000, un nombre de gènes inférieur à 200 ou supérieur à 5 500, un pourcentage de transcrits mitochondriaux supérieur à 7,5 % et un contenu ribosomal supérieur à 40 % ont été éliminés. Le nombre de cellules rejetées à chaque étape est fourni dans les données supplémentaires 3. Ensuite, nous avons utilisé DoubletFinder43 sur chaque échantillon d'objet séparément pour supprimer les doublets. Les paramètres et les doublets identifiés dans chaque ensemble de données sont détaillés dans les données supplémentaires 9. Après la suppression des doublets, nous avons fusionné des objets individuels pour effectuer une analyse conjointe. Initialement, tous les gènes exprimés dans moins de trois cellules ont été supprimés. De plus, nous avons ajusté un modèle linéaire pour décrire la relation entre le nombre logarithmique d'UMI et le nombre logarithmique de gènes détectés par cellule. Toutes les cellules avec un résidu inférieur à -0,5 (3 cellules) ont été rejetées. L'objet Seurat final obtenu contenait 16 870 cellules et 24 468 gènes.

Nous avons utilisé la fonction de Seurat pour régresser le pourcentage de transcrits mitochondriaux, le nombre de gènes, le nombre d'UMI et la méthode de conservation. Pour normaliser les données, nous avons utilisé la méthode LogNormalize et multiplié par un facteur d'échelle de 10 000. Nous avons ensuite sélectionné les 2000 gènes les plus variables pour calculer 100 composants principaux (PC). Nous avons utilisé la fonction ElbowPlot pour inspecter manuellement la quantité de variabilité expliquée par chaque PC et sélectionner les 20 premiers PC qui ont été utilisés pour construire le graphique kNN et calculer le tracé UMAP en utilisant 500 époques d'entraînement (itérations). Pour éliminer les effets de lot affectant l'identification des populations de cellules partagées dans les ensembles de données, nous avons utilisé le package Harmony28. La fonction RunHarmony a été appliquée sur l'objet filtré et traité, fournissant les échantillons comme variable à intégrer. En inspectant le tracé du coude mis à jour, nous avons sélectionné les 19 premiers PC corrigés pour effectuer le regroupement. Nous avons utilisé le package clustree44 pour inspecter les résultats de clustering à différentes résolutions de 0,1 à 1 et avons choisi une résolution finale de résolution 0,7 où nous avons obtenu des populations de 12 cellules. Pour calculer les marqueurs supérieurs pour chaque cluster, nous avons utilisé la fonction FindAllMarkers de Seurat avec uniquement des marqueurs positifs et les autres paramètres par défaut. Des marqueurs statistiquement significatifs avec une valeur P ajustée du test de somme des rangs de Wilcoxon inférieure à 0,05 ont été sélectionnés.

Nous avons utilisé la fonction AddModuleScore avec les paramètres par défaut du package Seurat42 pour évaluer si les différentes méthodes de fixation induisaient un stress ou favorisaient l'apoptose parmi les cellules. Cette fonction compare l'expression d'un ensemble de gènes donnés avec des ensembles aléatoires de gènes ayant une expression similaire dans l'ensemble de données pour calculer un enrichissement. Pour la signature de l'apoptose, nous avons construit une signature génique incluant les gènes BCL2, TNF, TP53, CASP3, BAX, CASP8, FAS45. Pour la signature de stress, nous avons utilisé les gènes précoces immédiats suivants FOS, JUN, EGR1, UBC, HSPA1B, BTG2, IER2, ID330. Des différences statistiquement significatives dans le score de signature entre les différentes méthodes de fixation et les échantillons frais ont été calculées à l'aide d'un test unilatéral de somme des rangs de Wilcoxon.

Pour évaluer les changements dans la composition cellulaire, nous avons utilisé scCODA5. Pour exécuter scCODA, nous avons défini des échantillons frais comme condition de référence. Pour établir la comparaison, un cluster avec une faible variabilité entre les échantillons devait être choisi comme référence. Dans ce cas, nous avons utilisé comme référence le cluster NPC, qui avait un bon nombre de cellules et une très faible quantité de dispersion (exprimée en différences entre les groupes). Pour s'assurer que les résultats étaient cohérents et reproductibles, nous avons exécuté scCODA5 dix fois en utilisant la méthode d'échantillonnage Hamiltonian Monte Carlo avec des paramètres par défaut et nous avons fait la moyenne des résultats. Les types de cellules avec des scores moyens inférieurs (ou supérieurs) à zéro ont une diminution (ou une augmentation) significative de l'abondance selon le modèle scCODA (taux de fausse découverte <0,05).

Nous avons utilisé la fonctionaggregateData du package R Muscat31 pour obtenir des valeurs d'expression pseudobulk pour chaque cluster dans chacun des échantillons. Ensuite, nous avons utilisé la fonction pbDS pour effectuer une analyse différentielle de l'expression génique à l'aide de DESeq246 pour chaque cluster et identifier les DEG pour chaque méthode par rapport à des échantillons frais. Les DEG avec une valeur P de test de Wald ajustée <0,05 et un changement de pli log2 absolu >0,58 sont disponibles dans les données supplémentaires 6 et sur la figure 6c. Pour évaluer si les différentes méthodes de fixation/conservation introduisaient des biais dans l'expression d'ensembles de gènes particuliers, nous avons étudié les processus biologiques associés aux gènes régulés positivement et négativement en utilisant la fonction d'enrichissement du package GSEApy47. Pour cette analyse, nous avons utilisé tous les gènes qui étaient régulièrement régulés à la hausse ou à la baisse dans au moins quatre types de cellules pour chaque méthode de fixation/conservation. Seuls les ensembles de gènes contenant au moins dix gènes ont été analysés. Comme ensemble de fond pour l'analyse d'enrichissement, nous avons fourni tous les gènes exprimés dans l'ensemble de données qui avaient au moins 445 UMI, ce qui est l'expression minimale parmi les DEG identifiés. Dans toutes les comparaisons, nous n'avons identifié aucun terme d'ontologie génique significativement surreprésenté (valeur P ajustée au test hypergéométrique <0, 001).

Pour évaluer la corrélation entre les ensembles de données, nous avons comparé les profils d'expression de toutes les cellules de chaque ensemble de données à l'échelle mondiale et au niveau du cluster. À cette fin, nous avons calculé les valeurs d'expression pseudobulk pour tous les gènes d'un cluster/ensemble de données spécifique. Ensuite, nous avons transformé en journal les comptes c en utilisant un pseudo-compte de sorte que l'expression normalisée n soit n = log (c + 1). Nous avons utilisé ces valeurs d'expression normalisées pour calculer le coefficient de corrélation de Pearson par type de cellule/échantillon en utilisant la fonction cor dans R. Nous avons utilisé la fonction pheatmap48 pour effectuer un regroupement hiérarchique en utilisant une méthode de regroupement complète et en utilisant les coefficients de corrélation pour calculer les distances euclidiennes entre les groupes. Étant donné que de nombreux groupes de cellules sont très similaires, nous avons répété la même procédure pour chaque type de cellule séparément et déterminé la signification statistique des groupes d'échantillons à l'aide de la fonction shc du package sigclust2 R29 sur le tableau de corrélation correspondant. La méthode shc utilise une procédure de test de signification basée sur la simulation de Monte Carlo pour évaluer la signification des résultats de regroupement hiérarchique de l'ensemble de données. La signification statistique est évaluée à chaque nœud le long de l'arbre hiérarchique (dendrogramme) à partir de la racine à l'aide d'un test d'hypothèse nulle gaussien, et une valeur P correspondante est calculée à l'aide de l'indice de cluster à 2 moyennes, une statistique sensible aux hypothèses nulle et alternative. Un taux d'erreur par famille contrôlant la procédure est appliqué pour corriger les tests multiples. Nous avons généré des parcelles de dendrogramme pour chaque type de cellule pour illustrer la similitude entre les grappes pour différents échantillons et mettre en évidence les différences statistiquement significatives.

Différents lots de billes peuvent avoir une efficacité de capture d'ARNm différente. Afin d'évaluer l'impact de l'utilisation de différents lots dans les encapsulations scRNA-seq, nous avons mesuré l'efficacité de capture des lots de billes 01 et 02. Nous avons encapsulé le même échantillon deux fois en utilisant les deux lots de billes utilisés dans l'article. Après RT-PCR, nous avons amplifié 4000 STAMPS par PCR en utilisant 9, 10, 11 ou 12 cycles indépendamment. Après purification par AMPure XP Beads, l'ADNc de chaque PCR a été quantifié par le test Qubit dsDNA HS. Nos résultats démontrent que pour obtenir une concentration d'ADNc similaire avec les deux lots de billes, nous devions augmenter de 2 le nombre de cycles de PCR lors de l'utilisation du lot 02 (Fig. 2 supplémentaire).

Toutes les expériences de transcriptomique unicellulaire ont été réalisées en utilisant au moins deux lignées cellulaires différentes et deux expériences de différenciation indépendantes. Les échantillons D1, D2, M3 et M4 proviennent des mêmes expériences de différenciation mais ont été fixés selon des protocoles différents et à des jours différents (cryoconservation DMSO pour D1 et D2, fixation au méthanol pour M3 et M4). Les échantillons F1, F2, M1, M2, D3, A1, A2, V1 et V2 proviennent tous d'expériences de différenciation indépendantes. Tous les détails sur les jours de différenciation, les lignées cellulaires utilisées et d'autres détails de la conservation de l'échantillon se trouvent dans les données supplémentaires 1. Le nombre initial de cellules de chacun des échantillons et le nombre final après filtrage de qualité sont fournis dans le tableau 1. Ces cellules sont celles utilisées dans toutes les analyses fournies dans l'article.

La plupart des analyses informatiques ont été effectuées à l'aide de R49 et de packages spécifiques implémentés dans R 4.2.1 tels que Seurat50, Harmony28, clustree44, muscat31, sigclust229 et DoubletFinder43. Nous avons également utilisé le programme scCODA5 implémenté en Python pour évaluer les changements dans l'abondance des types de cellules et le programme GSEApy47 pour effectuer une analyse d'enrichissement GO-term. Tous les détails sont fournis dans la section Méthodes.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données brutes et traitées de scRNA-seq générées pour cette étude se trouvent dans la base de données GEO sous le numéro d'accession GSE209947. Les données sources sous-jacentes aux Figs. 2c, d, 4b et 6 sont disponibles dans les fichiers de données supplémentaires 10–14.

Karlsson, M. et al. Une carte transcriptomique de type unicellulaire des tissus humains. Sci. Adv. 7, eabh2169 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Jones, RC et al. Le Tabula Sapiens: un atlas transcriptomique à plusieurs organes et à une seule cellule de l'homme. Sciences 376, eabl4896 (2022).

Article CAS PubMed Google Scholar

Nomura, S. Génomique unicellulaire pour comprendre la pathogenèse de la maladie. J Hum. Genet. 66, 75–84 (2021).

Zhao, J. et al. Détection de sous-populations de cellules différentiellement abondantes dans les données scrna-seq. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 118, e2100293118 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Büttner, M., Ostner, J., Müller, CL, Theis, FJ et Schubert, B. scCODA est un modèle bayésien pour l'analyse de données de composition unicellulaire. Nat. Commun. 12, 6876 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wang, T., Li, B., Nelson, CE et Nabavi, S. Analyse comparative des outils d'analyse différentielle de l'expression génique pour les données de séquençage d'ARN unicellulaire. BMC Bioinforma. 20, 40 (2019).

Article Google Scholar

Zhang, M. et al. IDEAS : analyse de l'expression différentielle au niveau individuel pour les données d'ARN-seq d'une seule cellule. Génome Biol. 23, 33 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bresciani, E., Broadbridge, E. & Liu, PP Un protocole de dissociation efficace pour la génération d'une suspension cellulaire unique à partir d'embryons et de larves de poisson zèbre. MéthodesX 5, 1287–1290 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Denisenko, E. et al. Évaluation systématique des biais de dissociation tissulaire et de stockage dans les flux de travail de séquençage d'ARN à cellule unique et à noyau unique. Génome Biol. 21, 130 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

García-Castro, H. et al. Dissociation ACME : une méthode polyvalente de fixation-dissociation cellulaire pour la transcriptomique unicellulaire. Génome Biol. 22, 89 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Liu, L. et al. Dissociation du tissu cérébral de souris microdisséqué pour le séquençage d'ARN unicellulaire sans artefact. Protocole STAR 2, 100590 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Burja, B. et al. Un protocole de dissociation tissulaire optimisé pour l'analyse de séquençage d'ARN unicellulaire de biopsies de peau humaine fraîche et cultivée. Devant. Cellule Dév. Biol. 10, 950 (2022).

Article Google Scholar

Alles, J. et al. Fixation et préservation des cellules pour la transcriptomique unicellulaire à base de gouttelettes. BMC Biol. 15, 44 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Chen, J. et al. Fixation et traitement des PBMC pour le séquençage de l'ARN unicellulaire au chrome. J. Trad. Méd. 16, 198 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Attar, M. et al. Une solution pratique pour préserver des cellules individuelles pour le séquençage d'ARN. Sci. Rep. 8, 2151 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Guillaumet-Adkins, A. et al. Conservation du transcriptome unicellulaire dans les cellules et tissus cryoconservés. Génome Biol. 18, 45 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Wohnhaas, CT et al. La cryoconservation DMSO est la méthode de choix pour préserver les cellules pour le séquençage d'ARN unicellulaire à base de gouttelettes. Sci. Rep. 9, 1–14 (2019).

Article CAS Google Scholar

Phan, H. Van et al. Séquençage d'ARN à haut débit de cellules individuelles fixées au paraformaldéhyde. Nat. Commun. 12, 1–11 (2021).

Article Google Scholar

Raddi, G. et al. Immunité cellulaire des moustiques à résolution unicellulaire. Sciences 369, 1128-1132 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Li, L., Chao, J. & Shi, Y. Modélisation des maladies neurologiques à l'aide de cellules neurales dérivées d'iPSC : modélisation iPSC des maladies neurologiques. Tissu cellulaire Res. 371, 143-151 (2018).

Shi, Y., Kirwan, P. & Livesey, FJ Dirigé la différenciation des cellules souches pluripotentes humaines aux neurones du cortex cérébral et aux réseaux de neurones. Nat. Protocole 7, 1836–1846 (2012).

Article CAS PubMed Google Scholar

Karaiskos, N. et al. L'embryon de drosophile à la résolution du transcriptome unicellulaire. Sciences 358, 194-199 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Danecek, P. et al. Douze ans de SAMtools et BCFtools. Gigascience 10, giab008 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Ilicic, T. et al. Classification des cellules de faible qualité à partir de données d'ARN-seq unicellulaires. Génome Biol. 17, 29 (2016).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Nowakowski, TJ et al. Les trajectoires d'expression spatio-temporelle des gènes révèlent les hiérarchies développementales du cortex humain. Sciences 358, 1318-1323 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Habib, N. et al. ARN-seq à noyau unique massivement parallèle avec DroNc-seq. Nat. Méthodes 14, 955–958 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bakken, TE et al. Transcriptomes à noyau unique et à cellule unique comparés dans des types de cellules corticales appariées. PLoS ONE 13, e0209648 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Korsunsky, I. et al. Intégration rapide, sensible et précise des données unicellulaires avec harmonie. Nat. Méthodes 16, 1289–1296 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kimes, PK, Liu, Y., Neil Hayes, D. & Marron, JS Signification statistique pour le regroupement hiérarchique. Biométrie 73, 811–821 (2017).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

van den Brink, SC et al. Le séquençage unicellulaire révèle l'expression génique induite par la dissociation dans les sous-populations tissulaires. Nat. Méthodes 14, 935–936 (2017).

Crowell, HL et al. Muscat détecte les transitions d'état spécifiques à la sous-population à partir de données transcriptomiques multi-échantillons multi-conditions unicellulaires. Nat. Commun. 2020 11:1 11, 1–12 (2020).

Google Scholar

Zhang, C. et al. Effets du diméthylsulfoxyde sur la morphologie et la viabilité des neurones et des astrocytes primaires cultivés. Cerveau Res. Taureau. 128, 34–39 (2017).

Article CAS PubMed Google Scholar

Verrillo, L. et al. Une stratégie fiable pour l'analyse de séquençage d'ARN unicellulaire à l'aide de cellules corticales primaires cryoconservées. J. Neurosci. Méthodes 347, 108960 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Niehaus, JK et al. Les macrophages spinaux résolvent l'hypersensibilité nociceptive après une lésion périphérique. Neurone 109, 1274–1282.e6 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Inak, G. et al. Une programmation métabolique défectueuse altère la morphogenèse neuronale précoce dans les cultures neurales et un modèle organoïde du syndrome de Leigh. Nat. Commun. 12, 1–22 (2021).

Article Google Scholar

Jerber, J. et al. Profilage d'ARN-seq unicellulaire à l'échelle de la population à travers la différenciation des neurones dopaminergiques. Nat. Genet. 53, 304–312 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Macosko, EZ et al. Profilage d'expression hautement parallèle à l'échelle du génome de cellules individuelles à l'aide de gouttelettes de nanolitre. Cellule 161, 1202-1214 (2015).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

GitHub—broadinstitute/Drop-seq : outils Java pour analyser les données Drop-seq. https://github.com/broadinstitute/Drop-seq (2019).

Howe, KL et al. Ensembl Genomes 2020-permettant la recherche génomique non vertébrée. Nucleic Acids Res. 48, D689–D695 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Boîte à outils Picard 2019. Broad Institute, référentiel Github. https://broadinstitute.github.io/picard/ (2019).

Dobin, A. et al. STAR : aligneur RNA-seq universel ultrarapide. Bioinformatique 29, 15–21 (2013).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hao, Y. et al. Analyse intégrée de données unicellulaires multimodales. Cellule 184, 3573–3587 (2021).

McGinnis, CS, Murrow, LM & Gartner, ZJ DoubletFinder : détection de doublets dans les données de séquençage d'ARN unicellulaire à l'aide de voisins artificiels les plus proches. Cellule Syst. 8, 329–337.e4 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zappia, L. & Oshlack, A. Arbres de clustering : une visualisation pour évaluer les clusterings à plusieurs résolutions. Gigascience 7, giy083 (2018).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Kiraz, Y., Adan, A., Kartal Yandim, M. & Baran, Y. Principaux mécanismes apoptotiques et gènes impliqués dans l'apoptose. Tumeur Biol. Rév. 37, 8471–8486 (2016).

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimation modérée du changement de pli et de la dispersion des données ARN-seq avec DESeq2. Génome Biol. 15, 550 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Fang, Z., Liu, X. & Peltz, G. GSEApy : un package complet pour effectuer une analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes en Python. Bioinformatique 39, btac757 (2023).

Article PubMed Google Scholar

Kolde, R. pheatmap : jolies cartes thermiques. Préimpression sur https://cran.r-project.org/web/packages/pheatmap/index.html (2019).

Équipe de base R. R : un langage et un environnement pour le calcul statistique https://www.R-project.org/ (2021).

Hao, Y. et al. Analyse intégrée de données unicellulaires multimodales. Cellule 184, 3573–3587 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Télécharger les références

Nous remercions tous les membres du Plass Lab pour leurs commentaires utiles et leurs discussions critiques. Nous remercions également Yvonne Richaud-Patin du programme de médecine régénérative d'IDIBELL et le Dr Zomeño de la plateforme de culture cellulaire et tissulaire avancée d'IDIBELL pour leur aide dans la culture cellulaire iPSC. Nous remercions le Dr Iglesias pour l'examen critique du manuscrit. Nous remercions également le Dr Iglesias, le Dr Kim et le Dr Sebé-Pedrós pour leur soutien dans la mise en place des protocoles ACME et vivoPHIX pour la préservation des cellules. Cette recherche a été financée par un projet de recherche des défis de recherche du programme national de R&D du ministère espagnol des sciences, de l'innovation et des universités (numéro de subvention : PID2019-108580RA-I00/AEI/10.13039/501100011033). Le travail MP est soutenu par un contrat Ramón y Cajal du ministère espagnol de la Science et de l'Innovation (RYC2018-024564-I). Nous remercions le programme CERCA/Generalitat de Catalunya pour le soutien institutionnel d'IDIBELL.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake.

Régulation génétique de l'identité cellulaire, Programme de médecine régénérative, Institut Bellvitge pour la recherche biomédicale (IDIBELL), L'Hospitalet del Llobregat, Barcelone, Espagne

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela & Mireya Plass

Programme pour l'avancement de la traduction clinique de la médecine régénérative de Catalogne, P-CMR[C], L'Hospitalet del Llobregat, Barcelone, Espagne

Ana Gutiérrez-Franco, Franz Ake, Mohamed N. Hassan, Natalie Chaves Cayuela, Loris Mularoni & Mireya Plass

Programme de médecine régénérative, Institut Bellvitge pour la recherche biomédicale (IDIBELL), L'Hospitalet del Llobregat, Barcelone, Espagne

Loris Mularoni

Centre de recherche biomédicale en réseau sur la bioingénierie, les biomatériaux et la nanomédecine (CIBER-BBN), Madrid, Espagne

Place Mireya

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

AGF et MP ont conçu le projet et planifié des expérimentations. AGF et NC ont réalisé des travaux expérimentaux. FA, MH et MP ont effectué des analyses de données informatiques. LM a effectué l'analyse de la composition des échantillons. MP a obtenu des fonds, supervisé et coordonné les travaux. AGF, FA et MP ont interprété les résultats. MP a écrit le manuscrit avec la contribution de tous les auteurs.

Correspondance à Mireya Plass.

MP est membre du comité de rédaction de Communications Biology, mais n'a pas été impliqué dans la révision éditoriale ni dans la décision de publier cet article. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Timothy (J) Petros et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteur en chef de la manipulation principale : George Inglis. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Gutierrez-Franco, A., Ake, F., Hassan, MN et al. La fixation au méthanol est la méthode de choix pour la transcriptomique unicellulaire à base de gouttelettes des cellules neurales. Commun Biol 6, 522 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

Télécharger la citation

Reçu : 05 août 2022

Accepté : 12 avril 2023

Publié: 15 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04834-x

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.