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Mar 14, 2023

La dynamique des cellules inflammatoires contrôle la néovascularisation et la cicatrisation des tissus après une lésion radio-induite localisée chez la souris

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 571 (2023) Citer cet article

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Une surexposition locale aux rayonnements ionisants entraîne une inflammation chronique, des lésions vasculaires et une cachexie. Ici, nous étudions la cinétique des cellules inflammatoires du jour (J) 1 à J180 après irradiation de la patte arrière de la souris et analysons le rôle des sous-ensembles de monocytes (Mo) dans la revascularisation tissulaire. À J1, nous constatons que les cellules Mo et T sont mobilisées de la rate et de la moelle osseuse vers le sang. La formation de nouveaux vaisseaux au cours de la phase précoce, comme en témoignent respectivement l'augmentation du score angiographique et de la densité capillaire d'environ 1,4 et 2 fois, est corrélée à une augmentation des lymphocytes T circulants et des macrophages de type Mohi et de type 1 dans le muscle irradié. A J90, une raréfaction vasculaire et une cachexie sont observées, associées à une diminution du nombre de macrophages circulants de type Molo et Type 2 dans les tissus irradiés. De plus, le déficit en CCR2 et CX3CR1 influence négativement la néovascularisation. Cependant, le transfert adoptif de Mohi améliore la croissance des vaisseaux. Nos données démontrent les ondes inflammatoires dynamiques radio-induites et le rôle majeur des cellules inflammatoires dans la néovascularisation.

Des accidents radiologiques aigus à forte dose surviennent chaque année, suite à des accidents industriels (perte de sources radioactives) ou à des surdosages consécutifs à des applications médicales (actes de radiothérapie et de radiologie interventionnelle). La radiolésion est caractérisée par des vagues inflammatoires successives et imprévisibles au cours des premiers jours à quelques années après l'irradiation, et celles-ci conduisent à l'extension horizontale et verticale de la lésion tissulaire, y compris la raréfaction vasculaire et la cachexie musculaire1. Les lésions vasculaires et la raréfaction sont considérées comme la principale cause de morbimortalité à long terme chez les patients conduisant à une ischémie tissulaire après exposition aux rayonnements ionisants2. La surexposition locale aux rayonnements ionisants a de graves conséquences sur la santé, en particulier lorsque la dose absorbée dépasse 25 Gy et entraîne une nécrose tissulaire1,3. La réparation des lésions musculaires squelettiques aiguës est un processus étroitement régulé, qui consiste principalement en trois phases, dont l'inflammation, la régénération et l'angiogenèse4,5. Dans le modèle préclinique d'irradiation corporelle totale, il a été démontré que le nombre de myonucléi et de cellules satellites par myofibre diminuait de manière dose-dépendante6. De plus, une seule dose d'irradiation de 18 Gy bloque la régénération musculaire en induisant la létalité des myoblastes7. Des études de pathologie musculaire utilisant une dose d'irradiation supérieure à 25 Gy ont montré des altérations morphologiques, des hémorragies, des nécroses, des inflammations, des fibroses et la destruction des mitochondries8,9,10,11. L'ischémie est le processus commun à la fois aux lésions radio-locales et aux maladies cardiovasculaires. Dans la maladie ischémique, une perfusion insuffisante d'organe suite à l'obstruction d'un vaisseau thrombotique de l'artère nourricière est un déterminant majeur du remodelage post-ischémique12. Cependant, l'exposition de cellules de mammifères telles que les cellules endothéliales à des rayonnements ionisants conduit principalement à la mort cellulaire induite par des dommages à l'ADN13. L'ischémie est caractérisée par des dommages/raréfactions vasculaires et une inflammation entraînant une fibrose caractérisée par une cicatrice à base de collagène14. La réponse tissulaire ischémique repose sur quatre processus principaux, la vasculogenèse, l'angiogenèse, l'artériogenèse et la croissance collatérale, qui contribuent à la réparation et au remodelage des tissus au cours des maladies vasculaires ischémiques aiguës et chroniques15. Ces processus résultent de changements de forces hémodynamiques au sein de la paroi vasculaire entraînant une modification de l'homéostasie vasculaire15,16.

L'infiltration de cellules inflammatoires dans les zones hypoxiques est une caractéristique de l'ischémie tissulaire, et le rôle respectif de sous-ensembles distincts de leucocytes dans la néovascularisation post-ischémique - cellules T CD4 + et CD8 +17,18, cellules NK19, cellules T régulatrices20, mastocytes21, monocytes / macrophages22 - n'est pas complètement compris. En particulier, les lymphocytes T sont impliqués dans ce processus, comme le démontre le fait que les souris nude, qui manquent de tous les sous-ensembles de lymphocytes T, présentent une réduction prononcée de la croissance des vaisseaux post-ischémiques23. Les leucocytes et les monocytes déclenchent la néovascularisation par la libération de plusieurs facteurs angiogéniques/artériogènes, y compris le facteur de croissance endothélial vasculaire (VEGF), les cytokines pro-inflammatoires telles que le facteur de nécrose tumorale-α, l'interleukine (IL)-1β et les métalloprotéinases24,25. De plus, le rôle des monocytes dans le processus de néovascularisation a été documenté par différents groupes18,26.

Les monocytes sont une population hétérogène avec deux sous-types majeurs chez la souris : les monocytes « inflammatoires » Ly6ChiLy6G-7/4hi (Mohi) et les monocytes « résidents » Ly6CloLy6G-7/4lo (Molo) correspondant respectivement aux sous-populations CD14hiCD16− et CD14loCD16+ chez l'homme27. Les Mohi expriment la NO synthase inductible (NOS) et les cytokines pro-inflammatoires, telles que l'IL-1 et l'IL-12, tandis que les Molo produisent de grandes quantités d'arginase 1, la cytokine anti-inflammatoire IL-10 et le VEGF. Mohi pénètre rapidement dans les sites d'inflammation, tandis que Molo pénètre dans les organes lymphoïdes et non lymphoïdes dans des conditions homéostatiques, patrouille à travers l'endothélium vasculaire de manière dépendante de CX3CR128 et favorise la régénération tissulaire dans divers contextes29. Nous avons récemment montré le rôle central de l'activation des monocytes/macrophages dans l'orchestration du mécanisme de néovascularisation dans un modèle murin d'irradiation colorectale locale22. De plus, dans un modèle murin d'ischémie du membre postérieur, la transplantation de Mohi, mais pas de Molo, a conduit à l'activation de la néovascularisation post-ischémique26.

On pense que le recrutement des monocytes dans les zones ischémiques se produit principalement via la signalisation des récepteurs de chimiokine/chimiokine. En particulier, CCL2 et son récepteur apparenté CCR2, ainsi que la fractalkine (CX3CL1) et les ligands de CX3CR1 sont impliqués dans ce contexte30,31,32. En fait, CCL2 est régulé positivement au site de croissance collatérale et la revascularisation est nettement améliorée avec le traitement CCL233. De même, dans les modèles de membres postérieurs ischémiques, une déficience en CCL2 ou CCR2 réduit l'inflammation post-ischémique et la croissance des vaisseaux25,34 et améliore l'atrophie du muscle gastrocnémien35. La modulation thérapeutique de la réponse inflammatoire peut donc être prometteuse pour améliorer la réponse réparatrice pour la prévention de la maladie post-ischémique15,16.

Ici, à l'aide d'un modèle murin de lésion radio-induite localisée du membre postérieur, nous avons analysé la dynamique de mobilisation et de recrutement des cellules inflammatoires innées et adaptatives dans différents tissus (moelle osseuse (BM), rate, sang et muscles) de J1 à J180 après irradiation. Nous avons montré pour la première fois les ondes inflammatoires caractérisant les lésions par rayonnement ionisant. Ces ondes correspondaient à l'alternance entre les phases de prolifération/mobilisation observées dans différents tissus, tels que la rate, le sang et le muscle ; cependant, ils étaient moins prononcés dans BM. Nous avons mis en évidence deux phases après irradiation des membres postérieurs, correspondant d'abord à une phase précoce d'inflammation et de néovascularisation corrélées à la mobilisation des lymphocytes T CD4 et CD8 de la rate, à l'infiltration dans le muscle de Mohi et à leur différenciation en macrophages pro-inflammatoires (Type 1-like macrophages/M1-like). Dans la phase tardive, nous avons démontré une raréfaction vasculaire et une cachexie, qui étaient corrélées à une diminution du nombre de Molo dans le sang et les muscles et à la différenciation de Molo en macrophages de type 2 (M2-like) dans le muscle.

Enfin, nous avons étudié plus précisément le rôle de Mohi et M1-like sur la néovascularisation au cours de la phase précoce. Le déficit en CCR2 ou CX3CR1 a entravé les mécanismes de l'artériogenèse, alors que l'injection intramusculaire de Mohi chez les souris WT a amélioré l'artériogenèse.

Pour étudier l'effet de l'irradiation sur le membre postérieur, nous avons d'abord évalué la cinétique d'évolution de la lésion par une analyse semi-quantitative de l'étendue de la plaie, de l'ulcération, de la desquamation humide et de la rétraction du membre pendant le processus de cicatrisation chaque semaine jusqu'à J180. Après 14 jours post-irradiation, le score lésionnel augmentait et culminait à J35 puis diminuait lentement jusqu'à J180 (Fig. 1a). Cet effet délétère de l'irradiation était associé à une cachexie/fonte musculaire (rhabdomyolyse). Le poids du gastrocnémien et du tibial a diminué progressivement et significativement à J120, 150 et 180, respectivement de 2 et 1,5 fois par rapport au groupe non irradié (P < 0,01, Fig. 1b).

a Évolution cinétique des scores de blessure mesurés chaque semaine et photographies représentatives des lésions des membres postérieurs radio-induites à différents moments. b Évolution du poids musculaire mesuré sur tibial et gastrocnémien, non irradié (NIR) et irradié, aux jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 et 180 post-irradiation. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au NIR ; n = 8 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

La MB et la rate sont connues pour libérer des cellules inflammatoires après une blessure et contribuer au processus inflammatoire après irradiation22. Les leucocytes CD11b+ correspondant aux neutrophiles et aux monocytes ont été mobilisés du BM ou de la rate vers le sang puis infiltrés dans le muscle irradié (Fig. 2a, b). Nous n'avons observé aucune accumulation de monocytes dans le muscle, ce qui suggère qu'ils se sont différenciés en macrophages36. Non irradié (NIR) correspond à des compagnons de portée euthanasiés à différents moments et a montré des résultats comparables en termes de nombre de cellules inflammatoires dans les tissus (sang, rate, moelle osseuse et muscles) à tout moment.

a–d Analyse quantitative (gauche) et synchronisation représentative par cytométrie en flux (droite) du nombre de cellules pour les neutrophiles (CD45 + CD11b+Ly6G+7/4hi, ligne verte), Mohi (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4hi, ligne rouge) et Molo (CD45 + CD11b+Ly6G–7/4lo, ligne bleue) (gated sur cellules CD45+ et CD11b+) dans l'os m flèche, rate, sang et muscle, respectivement. e Analyse quantitative (à gauche) et synchronisation représentative par cytométrie en flux (à droite) du nombre de cellules pour DC (CD45 + CD11b + CD11c + MHCII +), M1-like Mɸ (CD45 + CD11b-F4 / 80 + CD64 + MHCII +) et M2-like Mɸ (CD45 + CD11b-F4 / 80 + CD64 + MHCII −) dans le muscle, non irradié (NIR) et irradiés, aux jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 et 180 après irradiation. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au NIR ; n = 8–10 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

Dans BM, les neutrophiles (CD11b + Ly6G + 7 / 4hi) ont proliféré de manière significative à J1, J150 et J180 (P <0, 001) par rapport au NIR (Fig. 2a). Mohi (CD11b + Ly6G-7/4hi) a proliféré à J14 et J180 (P < 0,05) et Molo (CD11b+Ly6G-7/4lo) à J150 et J180 (P < 0,001) respectivement par rapport à NIR (Fig. 2a). Fait intéressant, à J5, les neutrophiles, Mohi et Molo ont été appauvris par rapport au NIR puis ont proliféré pour revenir au niveau basal à J7 jusqu'à J90. De plus, les nombres de neutrophiles, de Mohi et de Molo ont augmenté dans la rate à J14 et J150 (P <0, 001, Fig. 2b).

Dans le sang, les nombres de neutrophiles, de Mohi et de Molo ont augmenté de J1 jusqu'à la fin de l'expérience (P <0, 001, Fig. 2c).

Dans le muscle, Mohi, Molo et les neutrophiles ont été recrutés et ont culminé à J1, J5 et J60, puis sont revenus au niveau basal à J3, J30 et J120 (Fig. 2d). Les cellules de type M2 ont culminé à J1 (P <0, 01, Fig. 2e), tandis que les cellules dendritiques ont culminé à J60 (P <0, 01, Fig. 2e) après irradiation musculaire. Nous avons également noté une augmentation, bien que non significative, du M1-like dans le muscle à J60.

Ces résultats suggèrent qu'après irradiation musculaire, les cellules inflammatoires innées sont recrutées précocement et massivement de la rate et du BM dans le muscle. De plus, ces résultats montrent les ondes inflammatoires consécutives récurrentes dans le temps après une radiolésion, correspondant à des phases alternées de prolifération innée des cellules inflammatoires dans le MB et la rate (Fig. 2a, b) et de mobilisation par le sang (Fig. 2c), puis leur infiltration dans le muscle irradié (Fig. 2d, e).

Nous avons précédemment montré, dans un modèle murin de lésion colorectale, qu'après irradiation, des lymphocytes T étaient recrutés dans le tissu lésé22. Ici, nous avons constaté que, dans notre modèle, les lymphocytes T CD4 et CD8 étaient également mobilisés à partir de la rate et présentaient une forte diminution significative de J1 (P <0, 001, Fig. 3a) à J90. Par la suite, les lymphocytes T ont proliféré et ont presque atteint le niveau basal à J120, puis le nombre de lymphocytes T a de nouveau diminué à J150 et J180 (P <0, 001, Fig. 3a) par rapport au NIR. Dans le sang, le nombre de lymphocytes T a augmenté et a culminé à J30 et J60 (P < 0,001, Fig. 3b). Dans le muscle, les lymphocytes T ont été recrutés et ont culminé à J1 et J30 (P <0, 001, Fig. 3c).

a–c Analyse quantitative (gauche) et synchronisation représentative par cytométrie en flux (droite) du nombre de cellules pour les CD4 (CD45+CD3+CD4+) et CD8 (CD45+CD3+CD8+) dans la rate, le sang et les muscles, non irradiés (NIR) et irradiés, aux jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 et 1 80 après irradiation. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au NIR ; n = 8–10 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

Ces résultats montrent qu'une irradiation localisée des membres postérieurs induit une déplétion du nombre de lymphocytes T dans la rate, suggérant leur mobilisation et leur recrutement de la rate vers le muscle irradié. Comme pour les cellules innées, nous avons observé des vagues consécutives de mobilisation et de recrutement de lymphocytes T dans le sang et les muscles. Cependant, nous n'avons pas observé de telles ondes dans la rate, probablement parce que les lymphocytes T étaient immédiatement mobilisés.

CCL2 et CX3CL1 sont connus pour contribuer à la néovascularisation via l'attraction et la rétention des monocytes et des lymphocytes T dans la jambe ischémique26,37.

L'expression de l'ARNm de CCL2 a augmenté de manière significative de 11 et 14 fois à J14 et J30, respectivement, dans le muscle irradié par rapport au NIR (Fig. 4a). De même, l'expression de l'ARNm de CX3CL1 a augmenté de manière significative de 3, 7 fois à J30 et de 7, 7 fois à J90 dans le muscle irradié par rapport au tissu NIR (Fig. 4b).

a Évaluation quantitative des ARNm CCL2 et CX3CL1 dans le muscle. b, c Évaluation quantitative (panneaux de gauche) et photomicrographies représentatives (panneaux de droite) de cellules CD68-positives (b, indiquées par des flèches) ou de cellules CD3-positives (c, indiquées par des flèches) par mm2 dans le muscle non irradié (NIR) et irradié. Les résultats ont été exprimés en pourcentages par rapport au NIR, réglés à 100 % et le muscle irradié a été normalisé au muscle NIR aux jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 et 180 après irradiation, barre d'échelle : 100 µm. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au NIR ; n = 6 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

La régulation à la hausse des chimiokines était associée à une infiltration de macrophages et de lymphocytes dans le muscle. À J7 et J14 après irradiation, le nombre de macrophages CD68-positifs a augmenté de 3,5 et 4 fois (P < 0,001), respectivement, et a diminué à J30, par rapport au tissu NIR. Le nombre de lymphocytes CD3 positifs a été multiplié par 39 à J7, par 24 à J14 et par 18 à J30 (Fig. 4b, c et Fig. 1 supplémentaire).

Ces résultats montrent que l'irradiation localisée entraîne la régulation à la hausse de chimiokines telles que CCL2 et CX3CL1 et le recrutement de cellules inflammatoires.

Nous avons ensuite analysé les acteurs pro-angiogéniques eNOS dans le muscle post-irradiation. Les niveaux d'ARNm d'eNOS dans le muscle irradié ont été régulés à la hausse de 2, 8, 2, 6, 2, 5 et 2, 3 fois, respectivement, à J7, J14, J30 et J90 par rapport au NIR (Fig. 5a). En conséquence, les niveaux de protéines eNOS étaient également significativement régulés positivement à J30 par 2, 3 fois par rapport au NIR (P <0, 001, Fig. 5b).

a–d Quantification des niveaux d'ARNm et de protéines d'eNOS dans le muscle. e, f Évaluation quantitative et photomicrographies représentatives de la microangiographie (c ; les vaisseaux apparaissent en blanc) et de la densité capillaire (d ; les capillaires apparaissent en rouge, les flèches indiquent des exemples de capillaires positifs à l'isolectine B4, barre d'échelle : 100 µm). Les résultats ont été exprimés en pourcentages par rapport au muscle non irradié (NIR), fixé à 100 %, et le muscle irradié a été normalisé au muscle NIR, aux jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 et 180 après irradiation. *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 par rapport au NIR ; n = 5–8 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

De plus, nous avons évalué le processus de néovascularisation après irradiation dans le muscle en utilisant des approches indépendantes et complémentaires de microangiographie et d'immunohistochimie. Le score angiographique était significativement augmenté de 1,4 fois (P < 0,01) à J14 par rapport au groupe NIR. De plus, la densité capillaire était régulée à la hausse à J7 et J14 de 1, 7 (P <0, 05) et double (P <0, 001), respectivement, par rapport au groupe NIR (Fig. 5c, d). De plus, par l'approche bayésienne des variables latentes38, nous avons analysé la corrélation entre le processus de néovascularisation et la mobilisation/recrutement des cellules inflammatoires au cours de la phase précoce (J0-J30) et de la phase tardive (J60-J180). De J1 à J30 après irradiation, nous avons trouvé une corrélation significative entre la formation de nouveaux vaisseaux et la mobilisation des cellules CD4/CD8 (P < 0,01 les deux) de la rate et leur augmentation dans le sang (P < 0,05 les deux) (Tableau 1). De la même manière, l'augmentation du nombre de Mohi infiltrés et leur différenciation en M1-like dans le muscle irradié étaient associées à la néovascularisation (P < 0,01 les deux) (Tableau 1).

Cependant, à J60, le score angiographique est revenu au niveau basal, puis a diminué significativement à J90, J120 et J150 (P < 0,01) par rapport au groupe NIR (Fig. 5c). De plus, à J30, la densité capillaire est revenue au niveau NIR et a significativement diminué de J60 à J180 (P < 0,05) par rapport au groupe NIR (Fig. 5d). Plus important encore, de J60 à J180, nous avons démontré par approche bayésienne que la diminution du nombre de Molo dans le sang (P < 0,05) et dans le muscle (P < 0,001), ainsi que leur différenciation en M2-like dans le muscle (P < 0,05) étaient corrélées à ce processus de raréfaction vasculaire (Tableau 1).

Afin d'aborder directement le rôle des monocytes/macrophages dans le processus de néovascularisation après irradiation des membres postérieurs, nous avons étudié plus précisément le rôle de Mohi et Molo en utilisant des souris déficientes en CCR2 ou CX3CR1. Chez les souris Ccr2 − / −, les taux circulants de Mohi (P <0, 001, Fig. 6a) et de Molo (P <0, 01, Fig. 6b) ont été significativement réduits par rapport aux souris de type sauvage à J3 après irradiation. De plus, Lu et al. ont montré que la mobilisation des monocytes (Mohi et Molo), mais pas des lymphocytes ou des neutrophiles, était altérée du BM vers le sang et du sang vers le muscle lésé chez les souris Ccr2−/− suggérant que le faible taux de monocytes analysés dans le sang n'était pas dû à l'irradiation des membres postérieurs39. De même, nous avons également démontré le faible nombre de macrophages dans le muscle CCR2 - / - par rapport aux souris WT 10 jours après l'irradiation (P <0, 05; Fig. 6d). Ensuite, nous avons cherché à évaluer l'impact des voies de signalisation CCR2 et CX3CR1 sur la croissance des vaisseaux après irradiation. Dix jours après l'irradiation, le score angiographique était réduit chez les souris déficientes en CCR2 et CX3CR1 par rapport à leurs homologues de type sauvage (P <0, 001, Fig. 6e).

a – c Analyse quantitative du nombre de cellules pour Mohi, Molo et les neutrophiles dans le sang chez les souris WT ou les souris déficientes en CCR2 et CX3CR1. **P < 0,01 ; *** P < 0,001 vs WT irradié, n = 3–4 animaux/point dans le temps. d Analyse quantitative de l'infiltration de macrophages CD68 + du sang vers les muscles lésés à J10 après irradiation chez des souris WT ou des souris déficientes en CCR2 et CX3CR1, n = 5 animaux / point de temps. e Évaluation quantitative et photomicrographies représentatives de la microangiographie chez des souris WT ou des souris déficientes en CCR2 et CX3CR1 10 jours après l'irradiation des membres postérieurs. f Évaluation quantitative et photomicrographies représentatives de la microangiographie 10 jours après l'irradiation des membres postérieurs chez des animaux injectés par voie intramusculaire avec du PBS, 105 Mohi ou 105 Molo. * P < 0,05 par rapport aux souris injectées au PBS. Les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport au muscle non irradié (NIR), fixé à 100 % et le muscle irradié a été normalisé au muscle NIR, n = 5–12 animaux/point dans le temps, ANOVA +/− SEM.

Comme prévu, nos résultats montrent clairement que la perturbation des voies CCL2/CCR2 et CX3CL1/CX3CR1 entrave la croissance des vaisseaux post-ischémiques.

Étant donné que les monocytes Molo sont rares dans le BM et difficiles à collecter en quantités suffisantes dans le sang, nous avons utilisé Mohi et Molo spléniques comme substituts pour les sous-ensembles de monocytes en circulation. De plus, il a été démontré que les sous-ensembles de monocytes sanguins et spléniques sont presque identiques en termes de transcriptome et de fonction40. Le lendemain de l'irradiation des membres postérieurs, les souris WT C57BL/6 ont reçu une injection intramusculaire de PBS, 105 Mohi ou 105 Molo. 10 jours après l'irradiation, le transfert de Mohi a amélioré le score angiographique (P <0, 5, Fig. 6f) par rapport aux souris traitées au PBS. En revanche, l'injection de Molo n'a pas amélioré le score angiographique.

Ces résultats identifient clairement un rôle central pour l'activation de Mohi dans l'orchestration de l'inflammation vasculaire et la promotion de la néovascularisation dans la phase aiguë après irradiation des membres postérieurs.

La surexposition locale aux rayonnements ionisants a des conséquences sanitaires graves, notamment lorsque la dose absorbée dépasse 25 Gy et entraîne une nécrose tissulaire1. La radiolésion est caractérisée par des vagues inflammatoires successives et imprévisibles au cours des premiers jours à semaines après l'irradiation, et celles-ci conduisent à une extension en surface et en profondeur de la lésion tissulaire, y compris la raréfaction vasculaire et la cachexie musculaire1. Dans ce rapport, nous avons montré, pour la première fois, les ondes inflammatoires dynamiques caractérisant les lésions radio-induites. Dans la rate et la moelle osseuse, ces ondes correspondent à des phases alternées entre la prolifération et la mobilisation cellulaires par le sang puis leur infiltration dans les muscles irradiés. Ces ondes étaient beaucoup plus prononcées pour les neutrophiles, Mohi puis Molo principalement dans la rate et le muscle. Cependant, dans le sang, le nombre de cellules circulantes innées a été augmenté de J1 à J180 après irradiation, alors que dans le muscle irradié, leur nombre était assez faible suggérant une accumulation dans le sang. De plus, des ondes de lymphocytes T ont été observées dans le sang et les muscles. De nombreuses études ont déjà montré la mobilisation et le recrutement de cellules inflammatoires après une irradiation colorectale localisée22, une ischémie fémorale ou un infarctus du myocarde20,24,41. Cependant, par rapport au modèle ischémique cardiovasculaire classique14, le nombre de macrophages de type M2 dans le muscle irradié n'a augmenté qu'à J1. Nous avons plusieurs hypothèses qui pourraient expliquer cette observation, notamment (i) la prolifération des cellules résidentes M2 dans le tissu, (ii) le défaut de sortie de M2 ​​(capacité de migration)42 ou (iii) la résistance de l'apoptose radio-induite du processus des cellules M2 dans le muscle.

Plusieurs études ont déjà montré que l'endothélium ischémique irradié présente des propriétés pro-inflammatoires. Les cellules endothéliales expriment des chimiokines telles que CCL2 et CX3CL1, conduisant au recrutement et à l'infiltration de cellules inflammatoires via leurs récepteurs CCR2 ou CX3CR1 pour améliorer la formation de nouveaux vaisseaux26,30. Nous avons montré que le tissu irradié exprime, au cours de la phase précoce (J0-J30 post-IR), des facteurs pro-angiogéniques (eNOS) et pro-artériogènes (CX3CL1, CCL2) pour induire la mobilisation des lymphocytes T pro-inflammatoires CD4-, CD8 et Mohi de la rate et du BM par le sang et leur recrutement et leur infiltration dans le tissu irradié conduisant à la différenciation des Mohi en macrophages de type M1. Par la suite, nous avons observé une phase tardive (J60-J180 post-IR) caractérisée par une corrélation entre le recrutement réduit des anti-inflammatoires Molo et leur différenciation en M2-like, raréfaction vasculaire et cachexie. Bien qu'à J90 post-irradiation, nous ayons pu détecter une augmentation de l'expression des ARNm de CX3CL1 et d'eNOS, nous n'avons pas observé d'augmentation similaire des protéines correspondantes, ce qui est en accord avec la raréfaction vasculaire et la cachexie.

Ces résultats sont en accord avec la littérature concernant le rôle de CCL2 et CX3CL1 dans la participation au recrutement des cellules inflammatoires et à l'amélioration de la néovascularisation. Par conséquent, après l'occlusion de l'artère fémorale, la perfusion locale ou la surexpression de CCL2 a augmenté le nombre de monocytes circulants, et il a été démontré que leur accumulation favorise la conductance collatérale et périphérique et la néovascularisation26,31. Les souris déficientes en CX3CL1 contenaient significativement moins de macrophages que les témoins dans le modèle d'athérogenèse43. Ces données s'ajoutent à l'accumulation de preuves montrant que les voies des monocytes/chimiokines jouent un rôle central dans la régulation de l'angiogenèse. De plus, les lymphocytes T sont également impliqués dans ce processus puisque les souris nude, qui manquent de tous les sous-ensembles de cellules T, présentent une réduction prononcée de la croissance des vaisseaux post-ischémiques23. De plus, il a été suggéré que les sous-ensembles de lymphocytes T CD4 et CD8 jouent un rôle dans le remodelage vasculaire. En effet, les souris déficientes en CD4 et CD8 présentent une réduction significative de la croissance des vaisseaux post-ischémiques17,18.

Ensuite, nous avons montré que les monocytes contribuaient au processus de néovascularisation après une irradiation localisée du membre postérieur en utilisant des souris déficientes en CCR2 et CX3CR1. La suppression de CCR2 ou CX3CR1 a réduit le nombre de monocytes circulants et a diminué le score angiographique, comme indiqué précédemment. Il a été démontré que CCR2 et CX3CR1 contrôlent le recrutement des monocytes dans les tissus ischémiques30,44. Le CCR2 est principalement impliqué dans la régulation des niveaux circulants de Mohi. Fait intéressant, l'absence de CCR2 supprime spécifiquement l'infiltration de Mohi dans le myocarde ischémique29,40. En outre, il a été démontré que l'expression de CCR2 par les cellules BM, mais pas par les cellules des tissus musculaires lésés, est nécessaire pour déclencher une réponse inflammatoire après une lésion musculaire squelettique aiguë45 afin de permettre une artérialisation capillaire musculaire ultérieure46. Mohi facilite l'artériogenèse et l'angiogenèse en produisant des facteurs de croissance35,47,48,49. De plus, il a été démontré que la signalisation CX3CR1 favorise la survie des monocytes qui sont des cellules à vie courte50 : la signalisation CX3CR1 endogène pourrait être nécessaire à la survie des monocytes nouvellement mobilisés provenant de BM. Ceci est étayé par notre observation d'un nombre inférieur de monocytes Molo chez les souris CX3CR1-/- par rapport aux animaux WT. Les souris déficientes en CX3CR1 ont révélé un recrutement et une revascularisation adéquats des monocytes pour la réparation cutanée et l'angiogenèse des plaies ; cependant, la réponse des cellules myéloïdes et l'ampleur de la néovascularisation ont été atténuées par rapport aux souris de type sauvage51. De plus, dans l'athérosclérose, de nombreuses études ont montré que la signalisation CX3CL1/CX3CR1 était impliquée dans l'angiogenèse lors de la formation des microvaisseaux de la plaque44,52,53.

Enfin, nous avons mis en évidence un rôle majeur des monocytes Mohi dans la croissance post-ischémique des vaisseaux. L'administration musculaire de Mohi a amélioré l'artériogenèse, alors que l'injection de Molo n'a eu aucun effet sur ce processus. Nous montrons que le transfert adoptif du sous-ensemble inflammatoire de monocytes tôt après l'induction de l'ischémie des membres postérieurs améliore nettement la reperfusion après l'ischémie. Il a été démontré, dans un modèle lapin de ligature aiguë de l'artère fémorale, que la croissance de l'artère collatérale dépend directement du nombre de monocytes circulants25. De plus, le potentiel pro-artériogène distinct pourrait résulter de l'expression différentielle de facteurs angiogéniques tels que MMP-926,54 par la libération de VEGF55 lié à la matrice extracellulaire. Dans l'infarctus du myocarde, une déplétion sélective des macrophages M2 avait un pronostic catastrophique avec une augmentation des ruptures cardiaques fréquentes. La réparation tissulaire a été entièrement sauvée par un apport externe de macrophages de type M256. Ces résultats sont en accord avec le rôle des cellules de type M1 et M2 dans la réparation tissulaire qui correspond à leurs fonctions séquentielles et complémentaires, en ce que les macrophages de type M1 initient le processus de guérison en stimulant l'angiogenèse38,57 tandis que les cellules de type M2 favorisent la stabilisation de l'angiogenèse et la maturation tissulaire en soutenant l'augmentation du diamètre des fibres régénérantes58 lors de la régénération du muscle squelettique chez la souris.

Ainsi, les monocytes/macrophages pourraient être utilisés comme biomarqueurs pour évaluer et gérer le tissu irradié afin d'offrir un traitement de médecine régénérative personnalisé au patient. L'infiltration de macrophages de type M1/M2 pourrait être étudiée par trois méthodes différentes. La plus appropriée pour l'évaluation de l'infiltration de macrophages est la cytométrie en flux avec des mélanges d'anticorps, mais cette approche dépend de la quantité de tissu récolté. Ainsi, la PCR et la coloration immunohistochimique pourraient être utilisées pour analyser l'expression de cytokines ou de cellules inflammatoires.

En résumé, nous avons montré que les cellules inflammatoires jouent un rôle majeur après irradiation des membres postérieurs pour permettre le processus de néovascularisation et maintenir les vaisseaux sanguins pour limiter le développement de la cachexie.

Toutes les procédures animales réalisées ont été validées par le comité institutionnel d'expérimentation animale et d'éthique (C2EA) de l'Institut de radioprotection et de sûreté nucléaire (IRSN). Les expériences ont été menées selon les directives vétérinaires françaises et celles formulées par la Communauté européenne pour l'utilisation d'animaux d'expérimentation (APAFIS #12903-2018010418086132 v1 et APAFIS #19137-2019021313569870 v1). Des souris mâles C57Bl/6 (âgées de 8 semaines) ont été utilisées comme animaux expérimentaux (Janvier, France). Des mâles de huit semaines CCR2-/-, CR3CR1-/- et leurs compagnons de portée C57BL/6 de type sauvage (WT) ont été achetés auprès des Jackson Laboratories. Tous les animaux ont été maintenus dans des conditions de microenvironnement stables (22 ± 1 °C), avec des cycles alternés de lumière et d'obscurité de 12 h et ont reçu de la nourriture et de l'eau de laboratoire standard. Les souris ont été anesthésiées par inhalation d'isoflurane (2 %) et leur membre postérieur droit a été exposé à une dose unique d'irradiation de 80 Gy en utilisant des rayons X de 10 MV à 2,6 Gy/min sur un champ d'irradiation de 2*24 cm (Elekta Synergy Platform, Elekta SAS, Boulogne-Billancourt, France).

La cinétique d'évolution de la lésion a été appréciée par une analyse semi-quantitative. Un score compris entre 0 (normal) et 1 (lésion maximale) a été attribué à chaque signe clinique, y compris l'étendue de la plaie, l'ulcération, la desquamation humide et la rétraction des membres, ce qui a entraîné une lésion totale allant jusqu'à 5 pendant le développement de la plaie et le processus de cicatrisation chaque semaine après l'irradiation.

Les gastrocnémiens ont été excisés, rincés dans du PBS et congelés dans de l'azote liquide. Les tissus ont été coupés à l'aide d'un cryostat en sections de 7 μm d'épaisseur.

Les macrophages et les cellules CD3-positives ont été visualisées après coloration à l'anticorps CD68 (1/250, Biorad) ou CD3 (1/250, DAKO) suivie d'une coloration avec un âne 488-AF - IgG anti-rat ou anti-lapin (1/250, Jackson ImmunoResearch) respectivement. Les cellules positives pour CD68 et CD3 ont été comptées dans des champs choisis au hasard à l'aide du logiciel Image J (NIH). Les sections ont été colorées avec de l'hématoxyline et de l'éosine (H&E) pour analyser la structure musculaire.

Après irradiation, la néovascularisation a été évaluée par deux méthodes différentes comme précédemment59.

Au moment du sacrifice, les souris ont été anesthésiées (Alfaxan (80 mg/kg de poids corporel) et Xylazine (10 mg/kg de poids corporel), et une laparotomie longitudinale a été réalisée pour introduire un cathéter en polyéthylène dans l'aorte abdominale et injecter un produit de contraste (sulfate de baryum, 1 g/mL). Une angiographie des membres postérieurs a ensuite été réalisée et des images (deux par animal) ont été acquises à l'aide d'un transducteur de rayons X numérique haute définition. membres postérieurs. Le nombre de pixels occupés par les vaisseaux a été mesuré dans la zone de quantification à l'aide du logiciel Primed angio (Trophy System, Paris, France). La zone de quantification a été limitée par le placement de l'iliaque, du genou, du bord du fémur et de la limite externe de la jambe. Les résultats ont ensuite été exprimés sous la forme d'un rapport entre la jambe irradiée et la jambe non irradiée.

Le muscle gastrocnémien a été excisé du côté droit (membre irradié) et du côté gauche (membre NIR) et congelé dans un complexe OCT (Sakura Finetek France, Villeneuve d'ASCQ, France) pour la cryosection. Des sections musculaires congelées (7 µm) ont été colorées à l'aide d'un DyLight 594 marqué GSLI-isolectine B4 (Vector Laboratories, dilution 1:200) pour identifier les capillaires. Le nombre de capillaires par mm2 dans la zone musculaire a été déterminé.

Les souris ont été euthanasiées par dislocation cervicale après sédation avec inhalation d'isoflurane (4 %) les jours 1, 3, 5, 7, 14, 30, 60, 90, 120, 150 ou 180 après irradiation des membres postérieurs (n = 8 à 10 souris par point de temps). Le sang périphérique a été prélevé par ponction de la veine cave inférieure avec une solution d'héparine. Le sang total a été lysé après coloration par immunofluorescence à l'aide de la solution de lyse BD FACS (BD Biosciences), et le nombre total de leucocytes sanguins a été déterminé à l'aide de lames Kova. Des cellules de moelle osseuse ont été prélevées du fémur et filtrées à travers un filet en nylon de 40 μm (BD Biosciences). Les rates ont été prélevées et passées doucement à travers un filet en nylon de 40 μm (BD Biosciences). Pour les splénocytes et les cellules dérivées de la moelle osseuse, la suspension cellulaire a été centrifugée à 400 x g pendant 10 min à 4 °C. Les globules rouges ont été lysés en utilisant un tampon de lyse des globules rouges (Sigma-Aldrich) et les splénocytes et les cellules de la moelle osseuse ont été lavés avec du PBS. Les muscles non irradiés et irradiés ont été collectés, émincés avec des ciseaux fins émincés avec des ciseaux fins et passés doucement à travers le désagrégateur de tissus à 12 puits Bel-Art Scienceware (ThermoFisher Scientific). Les cellules ont ensuite été filtrées à travers un filet en nylon (40 μm) et centrifugées (10 min, 400 x g, 4 ° C).

Les cellules isolées du tissu d'intérêt ont été incubées dans l'obscurité à 4 ° C pendant 30 min avec le mélange d'anticorps suivant. Pour la détection de cellules inflammatoires, les cellules totales ont été remplies sur AF700 conjuguée à l'anti-CD45, anti-CD11B conjuguée au FITC (ThermoFisher Scientific), APC conjuguée anti-6B.2 (clone 7/4, biorad), PE-conjuguée anti-LY6g, anti-conjugué anti-conjugu, APC-CONJUGE. Anti-MHCII à 5 conjugués (BD Biosciences), anti-CD4 conjugué à FITC (clone RM4-5; Ebioscience), anti-CD8 conjugué Percpcy5 (clone 53-6.7, BD Pharmingen), APC-conjugué anti-CD3 (Clone 17a2, Ebdi11Ciced (Clonen418, Ebioscience) pendant 30 min à 4 ° C.

Nous avons utilisé différents mélanges d'anticorps dans différents tissus comme suit :

Moelle osseuse : mélange 1 : Mo : anti-CD11b conjugué au FITC, anti-Ly-6B.2 conjugué à l'APC, anti-Ly6G conjugué à la PE ; mélange 2 : lymphocytes : anti-CD45 conjugué AF700, anti-CD4 conjugué FITC, anti-CD8 conjugué PercpCy5, anti-CD3 conjugué APC,

Rate : mélange 1 : Mo : anti-CD11b conjugué à FITC, anti-Ly-6B.2 conjugué à APC, anti-Ly6G conjugué à PE ; mélange 2 : lymphocytes : anti-CD45 conjugué AF700, anti-CD4 conjugué FITC, anti-CD8 conjugué PercpCy5, anti-CD3 conjugué APC,

Sang : mélange 1 : Mo : anti-CD11b conjugué à FITC, anti-Ly-6B.2 conjugué à APC, anti-Ly6G conjugué à PE ; mélange 2 : lymphocytes : anti-CD45 conjugué AF700, anti-CD4 conjugué FITC, anti-CD8 conjugué PercpCy5, anti-CD3 conjugué APC,

Muscle : mélange 1 : Mo : anti-CD45 conjugué à AF700, anti-CD11b conjugué à FITC, anti-Ly-6B.2 conjugué à APC, anti-Ly6G conjugué à PE ; mélange 2 : lymphocytes : anti-CD45 conjugué à AF700, anti-CD4 conjugué à FITC, anti-CD8 conjugué à PercpCy5, anti-CD3 conjugué à APC, mélange 3 : Macrophages : anti-CD45 conjugué à AF700, anti-CD11b conjugué à FITC, anti-Ly6G conjugué à PE, anti-CD64 conjugué à APC, anti-F4 conjugué à APC/ 80, PerCP5.5-conjugué anti-MHCII, PE-Cyanine7-conjugué anti-CD11c Mohi (CD11b+Ly6G–7/4hi), Molo (CD11b+Ly6G–7/4lo), cellules de type M1 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD64+MHCII+) et cellules de type M2 (CD11b+Ly6G-F4/80+CD 64+MHCII-), DC (CD11c+MHCII+), CD4 (CD3+CD4+) et CD8 (CD3+CD4+).

Le nombre total de cellules a ensuite été normalisé au poids du muscle. Les cellules ont été analysées à l'aide d'un cytomètre en flux (Canto II, BD Biosciences).

L'ARN total a été extrait d'échantillons musculaires congelés avec le réactif Trizol conformément aux instructions du fabricant (Invitrogen, France). Après quantification sur un appareil NanoDrop ND-1000 (NanoDrop Technologies, Rockland, DE), la transcription inverse a été réalisée à l'aide du QuantiTect Reverse Transription (Qiagen) selon les instructions du fabricant. La PCR a été réalisée avec l'ABI PRISM 7900 en utilisant Power SYBR PCR Master Mix (Bioline). Ct pour GAPDH de souris a été utilisé pour normaliser l'amplification des échantillons. Les oligonucléotides suivants (Applied Biosystems) ont servi d'amorces : GAPDH sens : 5'-CGTCCCGTAGACAAAAATGGTGAA-3', sens inverse : 5'-GCCGTGAGTGGAGTCATACTGGAACA-3' ; eNOS vers l'avant : 5′-CGCCCACCCAGGAGAGATCCAC-3′, vers l'arrière 5′-GCATCGGCAGCCAAACACCAAAGT-3′ ; CCL-2 vers l'avant : 5′-CCCCACTCACCTGCTGCTA-3′, vers l'arrière 5′-TTACGGGTCAACTTCACATTCAAA-3′ ; CX3CL1 vers l'avant : 5′-GTGGCTTGCTCATCCGCTATCAG-3′, vers l'arrière : 5′-CACATTGTCCACCCGCTTCTCA-3′.

La préparation d'extraits protéiques a été effectuée. En bref, pour préparer la protéine totale, les muscles tibialis antérieurs des membres postérieurs irradiés et non irradiés ont été homogénéisés dans un tampon RIPA (50 mM Tris HCl pH 7,4, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 1 % désoxycholate, 0,1 % SDS avec inhibiteurs de protéase et de phosphatase). Les protéines ont été résolues par électrophorèse sur gel dénaturant à gradient et transférées sur des feuilles de nitrocellulose de 0, 2 μm (Biorad, Marnes la Coquette, France). Des anticorps dirigés contre eNOS (1:1000 ; BD Biosciences) ont été utilisés pour l'immunotransfert. Comme contrôle de charge protéique, les membranes ont été dépouillées et incubées avec un anticorps monoclonal dirigé contre GAPDH (1:10 000, Abcam) et un signal chimioluminescent spécifique a été détecté.

Pour l'expérience de transfert adoptif, les rates de souris C57BL/6 âgées de 8 semaines ont été dissociées mécaniquement sur un tamis cellulaire de 40 mm. Splénocytes colorés avec l'anti-CD45 conjugué à l'AF700, l'anti-CD11b conjugué au FITC, l'anti-Ly-6B.2 conjugué à l'APC, l'anti-Ly6G conjugué au bleu pacifique et l'anti-NK1.1 conjugué à la PE. CD11b + Ly6G-NK1.1- 7/4hi et CD11b + Ly6G2NK1.1- 7/4lo ont ensuite été sélectionnés à l'aide d'un FACS BD InFlux. La pureté pour les deux sous-ensembles était de 99 %. Avant l'injection, les cellules ont été comptées par exclusion au bleu trypan. Au total, 105 monocytes Mohi ou 105 monocytes Molo ont ensuite été injectés par voie intramusculaire aux receveurs C57BL/6 le lendemain après irradiation des membres postérieurs.

Les résultats ont été exprimés en ± SEM. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) a été utilisée pour comparer chaque paramètre. Des comparaisons de tests t de Bonferroni post hoc ont ensuite été effectuées pour identifier les différences de groupe qui expliquent l'ANOVA globale significative. Une valeur de P < 0,05 était considérée comme significative.

L'étude de l'association statistique entre l'infiltration de cellules inflammatoires et de sous-ensembles de leucocytes d'une part avec la néovascularisation post-ischémique d'autre part est difficile puisque ces deux mesures ont été effectuées sur différentes cohortes d'animaux. Cela rend les approches statistiques classiques inefficaces puisque les variables prédictives et de réponse ne sont pas observées sur le même sujet. Le modèle bayésien de variables latentes60 offre la possibilité d'inclure des a priori sur la distribution des cellules inflammatoires et le nombre de sous-ensembles de leucocytes pour estimer leur corrélation avec la croissance des vaisseaux. L'ajustement du modèle a été réalisé à l'aide du logiciel JAGS via la chaîne de Markov Monte Carlos. Toutes les valeurs P dans les différentes sections d'analyse statistique ont été corrigées pour les tests multiples en utilisant la procédure de Benjamini et Hochberg.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données qui étayent les conclusions de cette étude sont incluses dans cet article et ses fichiers d'informations supplémentaires et les données supplémentaires 1.

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Dr Celine Loinard is supported by Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), Fontenay-aux-Roses, France.

Institut de Radioprotection et de Sûreté Nucléaire (IRSN), Fontenay-aux-Roses, France

Céline Loinard, Mohamed Amine Benadjaoud, Bruno Lhomme, Stéphane Flamant & Radia Tamarat

CEA, Fontenay-aux-Roses, France

Jan Baijer

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CL et RT ont conçu l'étude, conçu les expériences et interprété les données. CL, MAB, BL, SF et JB ont réalisé les expériences et analysé les données. CL et RT ont rédigé le manuscrit avec l'approbation finale de tous les co-auteurs.

Correspondance à Céline Loinard.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie les relecteurs anonymes pour leur contribution à la relecture par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Jemond Dalli et Karli Montague-Cardoso. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Loinard, C., Benadjaoud, MA, Lhomme, B. et al. La dynamique des cellules inflammatoires contrôle la néovascularisation et la cicatrisation des tissus après une lésion radio-induite localisée chez la souris. Commun Biol 6, 571 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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Reçu : 04 juillet 2022

Accepté : 15 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04939-3

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