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Mar 18, 2023

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Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 2734 (2023) Citer cet article

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Les tissus fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) constituent une vaste et précieuse banque de matériel patient pour les antécédents cliniques et les données de suivi. Il est toujours difficile d'obtenir un profil d'ARN de cellule/noyau (sc/snRNA) dans les tissus FFPE. Ici, nous développons une technologie de séquençage de snRNA basée sur des gouttelettes (snRandom-seq) pour les tissus FFPE en capturant des ARN totaux de pleine longueur avec des amorces aléatoires. snRandom-seq montre un taux de doublet mineur (0,3%), une couverture d'ARN beaucoup plus élevée et détecte plus d'ARN non codants et d'ARN naissants, par rapport aux technologies de pointe à haut débit scRNA-seq. snRandom-seq détecte une médiane de > 3000 gènes par noyau et identifie 25 types de cellules typiques. De plus, nous appliquons snRandom-seq sur un échantillon clinique de cancer du foie humain FFPE et révélons une sous-population intéressante de noyaux à forte activité proliférative. Notre méthode fournit une puissante plate-forme snRNA-seq pour les échantillons cliniques FFPE et promet d'énormes applications dans la recherche biomédicale.

Les tissus de routine fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE) sont les échantillons archivables les plus courants, constituant une vaste et précieuse banque de matériel patient pour les antécédents cliniques, les données de suivi, etc.1. La morphologie tissulaire et les détails cellulaires des tissus FFPE sont bien conservés pour l'histopathologie par la réticulation du formaldéhyde entre l'ADN, l'ARN et les protéines. Inévitablement, les modifications irréversibles causées par la fixation du formol sur les macromolécules dans les échantillons FFPE rendent toujours difficile les applications de biologie moléculaire. Des études récentes ont fait de grands progrès dans le profilage de la transcription dans les échantillons FFPE par des méthodes optimales d'extraction d'ARN2 ou de profilage spatial in situ3. Au cours des dernières années, les méthodes de séquençage d'ARN unicellulaire/noyau à haut débit (scRNA/snRNA-seq) ont révolutionné l'ensemble du domaine de la recherche biomédicale4,5,6. Nous avons construit le premier atlas de cellules humaines et murines avec nos plateformes personnalisées de séquençage de scRNA à haut débit7,8. On pense que la caractérisation transcriptomique précise de chaque cellule dans les échantillons cliniques de FFPE a la capacité de fournir une meilleure compréhension de l'hétérogénéité cellulaire et de la dynamique des populations, améliorant ainsi la précision du diagnostic, du traitement et du pronostic de la maladie humaine. Cependant, l'isolement de cellules/noyaux intacts uniques et la capture d'ARN à partir de tissus FFPE sont toujours difficiles en raison de la réticulation, de la modification et de la dégradation de l'ARN.

Actuellement, les plateformes sc/snRNA-seq à haut débit les plus populaires, telles que 10X Genomics Chromium Single Cell 3' Solution, s'appuient sur l'oligo(dT) pour capturer les ARN poly(A)+, de sorte que l'ARN messager (ARNm) principalement mature sera détecté plutôt que les ARN non poly-adénylés pour l'analyse. De plus, ces méthodes sc/snRNA-seq à base d'oligo(dT) sont principalement limitées aux échantillons frais ou fraîchement congelés, car les amorces oligo(dT) échouent généralement sur les ARN dégradés. Diverses méthodes ont été développées pour surmonter ces défis sous différents angles. SMART-seq-total9 et VASA-seq10 capturent les transcrits polyadénylés et non polyadénylés en déployant une étape supplémentaire de suivi de toutes les molécules d'ARN avec poly (A). D'autre part, SPLiT-seq11 a été utilisé avec succès dans des cellules fixes en utilisant une amorce aléatoire plus efficace et plus large pour capturer les ARN totaux12,13. Cependant, ces méthodes n'étaient pas encore utilisables pour les tissus FFPE. Deux méthodes récemment publiées sur bioRxiv, snPATHO-Seq14 et snFFPE-seq15, ont fourni des méthodes optimisées pour isoler des noyaux intacts uniques à partir de tissus FFPE pour effectuer snRNA-Seq, ce qui démontre la faisabilité de snRNA-Seq dans les tissus FFPE et déverrouille une dimension de ces échantillons difficiles à utiliser. snPATHO-Seq dépend de la technologie 10X Genomics basée sur des sondes afin que seuls des gènes limités puissent être détectés14. snFFPE-seq utilise la plateforme 10X Genomics à base de poly(A), qui n'est pas assez sensible pour capturer les ARN de faible qualité des tissus FFPE15. En pratique, un profilage transcriptomique à grande échelle et complet des échantillons cliniques est toujours nécessaire pour identifier des biomarqueurs prédictifs ou des types de cellules rares. Par conséquent, l'objectif primordial est d'avoir une approche qui peut répondre au besoin de snRNA-seq à haut débit, haute sensibilité et haute couverture sur les tissus FFPE.

Dans cette étude, nous développons snRandom-seq, une méthode de séquençage de snRNA haute sensibilité et pleine longueur basée sur des gouttelettes pour les tissus FFPE. Dans snRandom-seq, nous capturons les ARN totaux à l'aide d'amorces aléatoires pour la transcription inverse et synthétisons le deuxième brin en effectuant une queue poly (dA) sur les ADNc du premier brin. Les ADNc dans un seul noyau sont en outre spécifiquement marqués par notre précédente plate-forme de codage à barres microfluidique16,17, puis amplifiés et séquencés. Pendant ce temps, nous développons un protocole pour isoler des noyaux intacts uniques à partir de tissus FFPE en effectuant la déparaffinisation, la réhydratation et l'extraction du noyau dans des conditions douces. De plus, nous concevons une étape de blocage de l'ADN simple brin pour éviter l'effet de la contamination du génome. Nous utilisons un échantillon de mélange homme-souris pour valider les performances de snRandom-seq, et les résultats montrent un taux de doublet mineur (0,3 %) et une sensibilité comparable avec les technologies de pointe de scRNA-seq à haut débit. Sur les tissus de souris FFPE, snRandom-seq démontre des résultats décents pour le séquençage d'ARNsn et l'annotation de type cellulaire, où snRandom-seq détecte une médiane de> 3000 gènes par noyau pour environ 20 000 noyaux uniques et identifie 25 types de cellules typiques (hépatocyte, cellules germinales, fibroblaste, cardiomyocyte, etc.). De plus, nous appliquons snRandom-seq sur un échantillon clinique de cancer du foie humain FFPE et révélons une sous-population intéressante de noyaux à forte activité proliférative, qui pourrait être une cible potentielle pour la recherche sur le cancer. En bref, snRandom-seq fournit une plate-forme puissante d'ARNsn pour les échantillons FFPE de laboratoire et cliniques et implique diverses applications futures dans la recherche biologique et la pratique clinique.

Le flux de travail principal de snRandom-seq est illustré à la Fig. 1. Pour l'isolement d'un seul noyau de tissus FFPE, les zones d'intérêt du bloc de tissu FFPE mis en banque ont d'abord été sélectionnées et placées dans des tubes. Le déparaffinage et la réhydratation ont été effectués avec du xylène standard et un lavage à l'alcool. Ensuite, les noyaux ont été dissociés et perméabilisés. Pour un seq d'ARN total à noyau unique complet et à haut débit, nous avons fourni une stratégie avec une chimie basée sur des amorces aléatoires pour capturer des ARN totaux de pleine longueur, et une plate-forme à base de gouttelettes facile à utiliser pour marquer un seul noyau. Les ADN simples brins nus ont été bloqués in situ par annelage multiple et extension des amorces de blocage. Les ADNc d'ARN total ont été convertis in situ par annelage multiple d'amorces aléatoires et d'amorces oligo(dT) en transcription inverse. Pour diminuer le taux de doublet, nous avons impliqué une stratégie de pré-indexation dans l'étape de transcription inverse selon le scifi-RNA-seq18 publié. Les noyaux ont été divisés en différents tubes pour la transcription inverse avec des amorces aléatoires pré-indexées, puis regroupés pour la réaction ultérieure. Des queues poly (dA) ont été ajoutées à l'extrémité 3 'hydroxyle des ADNc in situ par la transférase terminale (TdT). Nous avons également établi une plate-forme microfluidique pour le codage à barres à noyau unique à haut débit sur la base de nos travaux précédents16,17. Au cours de la réaction de codage à barres dans les gouttelettes, les amorces poly(dT) ont été libérées des billes par coupure enzymatique19, et simultanément, les ADNc ont été libérés du noyau par dégradation de l'ARN. Ensuite, les amorces poly (dT) liées à la queue poly (dA) à l'extrémité des ADNc et étendues pour ajouter un code à barres spécifique aux ADNc dans chaque gouttelette. Après le codage à barres, nous avons cassé les gouttelettes, amplifié l'ADNc à code-barres et préparé la bibliothèque de séquençage de nouvelle génération (NGS) pour le séquençage apparié.

Le flux de travail de snRandom-seq pour les tissus FFPE comprend la sélection d'échantillons FFPE, la dissolution de la paraffine, l'isolement et la perméabilisation des noyaux simples, le blocage des ADN simple brin, la transcription inverse, la queue dA, le codage à barres des gouttelettes, la libération et l'extension des amorces, la rupture des gouttelettes et l'amplification par PCR, et le séquençage. Cercle pointillé rouge dans le bloc tissulaire FFPE : les zones d'intérêt. Encadré bleu en pointillé : les trois réactions in situ, y compris le blocage des ADN simple brin, la transcription inverse, la queue dA. AAA : queue dA en 3′ de l'ADNc. TTT : poly(dT) dans les amorces à code-barres poly(dT). Flèches grises : le sens de l'extension.

snRandom-seq utilise des amorces aléatoires pour capturer les ARN totaux dans des noyaux uniques (Fig. 1), ce qui diffère des méthodes actuelles d'ARN-seq à cellule unique basées sur poly (A) et basées sur des sondes. Par conséquent, nous avons effectué une expérience standard d'espèces mixtes avec des lignées cellulaires humaines (293T) et de souris (3T3) cultivées pour évaluer la fidélité de snRandom-seq. Des cellules 293T et 3T3 fraîchement récoltées ont été lysées en noyaux et mélangées pour la fixation. Les noyaux fixes ont été utilisés pour snRandom-seq (Fig. 1). Avant de procéder à l'encapsulation microfluidique, les noyaux ont été imagés pour confirmer la morphologie du noyau unique et comptés (Fig. 1a supplémentaire). Une plate-forme microfluidique à haut débit a été créée pour le codage à barres d'une seule cellule / noyau dans snRandom-seq (Fig. 2a, Fig. 1b supplémentaire). Pour la synthèse de billes de code-barres, le dispositif de génération de billes d'hydrogel et le dispositif d'encapsulation cellulaire ont été conçus et fabriqués comme décrit précédemment20 (Fig. 2a supplémentaire). Des billes d'hydrogel de 40 µm de diamètre ont été produites avec précision (Fig. 2b supplémentaire). Trois cycles de ligature à base de fractionnement et de pool ont été effectués sur ces billes d'hydrogel pour la synthèse de codes à barres d'ADN (Fig. 2c supplémentaire, Tableau supplémentaire 2). L'efficacité de réaction élevée de chaque étape de ligature a été reflétée par le pic net de l'électrophérogramme des amorces de code à barres libérées (Fig. 2d supplémentaire). Le noyau, la perle de code-barres et le mélange de réactifs ont été co-compartimentés dans des émulsions eau-dans-huile à l'aide de la plate-forme microfluidique (Fig. 2a) et chaque noyau individuel a été encapsulé dans une gouttelette avec une perle de code-barres (Fig. 2b).

un dispositif d'encapsulation microfluidique pour le codage à barres des noyaux. b Image d'une gouttelette encapsulée contenant une bille, un noyau et un mélange de réactifs. c Électrophérogramme de la bibliothèque d'ADNc de mélange de noyaux 293T (humain) et 3T3 (souris) pour l'analyseur de fragments d'ADN Qsep100™. Des marqueurs inférieurs (20 pb) et supérieurs (1 kb) ont été montrés. d Tracé de code-barres pour l'identification des codes-barres qui représentent les vrais noyaux (ligne rouge). Les codes à barres des noyaux mixtes 293T-3T3 ont été classés du plus grand au plus petit nombre de gènes. e Diagramme de dispersion du mélange d'espèces montrant l'efficacité de capture d'un seul noyau et le taux de doublet de snRandom-seq. f Spécificité d'espèce des UMI dans le mélange 293T-3T3. Noyaux 293T identifiés : n = 1157, noyaux 3T3 identifiés : n = 1086. La médiane de la spécificité d'espèce des UMI dans 293T était de 0,992. La médiane de la spécificité d'espèce des UMI dans 3T3 était de 0,986. g Pourcentages de lectures mappées sur des introns et des exons. Les diagrammes en violon et les diagrammes en boîte ont montré le nombre de gènes (h) et d'UMI (i) détectés dans chaque noyau 293T et 3T3. Noyaux 293T filtrés : n = 1085, noyaux 3T3 filtrés : n = 1066. Les données de la boîte à moustaches correspondaient aux premier et troisième quartiles (charnières inférieure et supérieure) et à la médiane (centre). j Analyse de saturation de trois méthodes. snRandom-seq a utilisé les noyaux 293T et 3T3 ; 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 utilisait des cellules 293 T et 3T3 ; VASA-seq a utilisé des cellules 293T. k Lire la couverture le long du corps du gène par les trois méthodes. snRandom-seq a utilisé des noyaux 293T ; 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 utilisait des cellules 293T ; VASA-seq a utilisé des cellules 293T. Les données en (f, h, i) ont été présentées sous forme de valeurs médianes. Les données de la boîte à moustaches en (f, h, i) correspondaient aux premiers quartiles (charnières inférieures), aux troisièmes quartiles (charnières supérieures) et à la médiane (centre). La moustache supérieure s'étendait de la charnière aux maxima pas plus loin que 1,5 * IQR (intervalle interquartile) de la charnière. La moustache inférieure s'étendait de la charnière aux minima d'au plus 1,5 * IQR de la charnière. L'IQR est la distance entre le premier et le troisième quartile. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Après codage à barres et amplification, la taille des fragments de la bibliothèque d'ADNc du mélange homme-souris a culminé entre 300 et 800 bps (Fig. 2c), ce qui n'est pas nécessaire pour fragmenter mais convient simplement au NGS. Après le traitement des données, nous avons identifié 2250 codes-barres de noyau uniques de haute qualité par la pente raide significative dans le diagramme de rang de code-barres-gène (Fig. 2d), ce qui suggère une séparation claire des vrais noyaux du bruit de fond. Le taux de capture des noyaux était de 42,2 % et le pourcentage de lectures mappées sur les vrais noyaux était de 76 %. Nous avons compté le rapport des lectures cartographiées sur les génomes humains et de souris dans chaque noyau et avons constaté que les amorces pré-indexées réduisaient considérablement le taux de doublet (de 2, 9% à 0, 3%) (Fig. 2e, Supplémentaire 1c). Le taux de doublet de snRandom-seq est significativement inférieur à celui des autres méthodes sc/snRNA-seq basées sur des gouttelettes (sNucDrop-seq : ~2,6 %, VASA-drop : 3,1 %). De manière cohérente, une spécificité d'espèce très élevée de l'UMI (99%) a été observée (Fig. 2f), suggérant que snRandom-seq produisait des bibliothèques à noyau unique haute fidélité. Le pourcentage de lectures mappées sur l'exon ou l'intron des noyaux humains et de souris identifiés a été calculé, et les résultats ont montré que les lectures mappées sur l'intron étaient trois fois supérieures aux lectures mappées sur l'exon (Fig. 2g). De plus, de nombreux ARN non codants longs (ARNlnc) et ARN non codants courts, y compris de petits ARN nucléolaires (snoARN), de petits ARN nucléaires (snARN) et des microARN (miARN), ont été détectés (Fig. 1d supplémentaire). Ces résultats suggèrent que snRandom-seq a capturé de manière exhaustive les transcriptions intégrales.

La distribution du nombre de gènes et d'UMI a montré que snRandom-seq a capturé une médiane de 4141 gènes et 11 594 UMI dans un seul noyau 293T en séquençant en moyenne ~ 29k lectures par noyau 293T (Fig. 2h), et 3427 gènes et 9795 UMI dans un seul noyau 3T3 par ~ 25k lectures par noyau 3T3 (Fig. 2i). Les résultats ont indiqué que snRandom-seq est plus sensible que les deux autres méthodes rapportées de snRNA-seq à haut débit basées sur des gouttelettes (DroNc-seq21 : moyenne de 3295 gènes et 4643 UMI avec ∼160k lectures par noyau pour 5636 noyaux 3T3 ; sNucDrop-seq22 : moyenne de 2665 gènes et 5195 U MI avec environ 23 000 lectures par noyau pour 1984 noyaux 3T3) (Fig. 1e supplémentaire). L'analyse de saturation a montré que le nombre de gènes détectés dans snRandom-seq n'avait pas encore atteint le point de saturation par 60 000 lectures alignées de manière unique par noyau 3T3 et 293T (Fig. 2j). Nous avons également comparé nos données snRNA-seq à la solution V323 10X Chromium Single Cell 3 'à haut débit largement utilisée et à la dernière VASA-drop10 à haut débit rapportée pour scRNA-seq. À une faible profondeur de séquençage (<10k), la sensibilité de snRandom-seq dans les noyaux 3T3 et 293T est comparable à la solution V3 10X Chromium Single Cell 3' dans les cellules 3T3 et 293T, ainsi qu'à la chute VASA dans les cellules 293T (Fig. 2j). Contrairement à la solution 3 'à base de poly (A) 10X Chromium Single Cell 3 'avec un biais évident à l'extrémité 3', snRandom-seq et VASA-drop n'ont affiché aucun biais évident à l'extrémité 3' ou 5' sur le corps du gène (Fig. 2k). Comme prévu, snRandom-seq avait un léger biais vers l'extrémité 3 'en raison de l'ajout supplémentaire d'amorce oligo (dT) dans la transcription inverse (Fig. 2k).

Pour les tissus FFPE, la digestion avec la protéinase K pourrait isoler des noyaux uniques plus propres qu'avec la collagénase (Fig. 3a supplémentaire). Avec une procédure optimisée (Fig. 1), des noyaux intacts uniques ont été efficacement isolés de plusieurs tissus de souris FFPE et d'un échantillon clinique FFPE archivé de 2 ans de cancer du foie humain (Fig. 3a, Fig. 4a supplémentaire), et la morphologie des noyaux et la distribution de taille étaient comparables entre le FFPE et les échantillons frais (Fig. 4b supplémentaire).

a Image de noyaux uniques avant le codage à barres des gouttelettes et la coloration par DAPI. Barre d'échelle, 50 μm. b Pourcentage de lectures cartographiées sur différentes régions génomiques dans différentes conditions. c, Électrophérogramme de la bibliothèque d'ADNc de rein de souris FFPE pour l'analyseur de fragments d'ADN Qsep100™. Marqueur inférieur : 20 pb ; marqueur supérieur : 1k pb. d Vue d'ensemble de la comparaison FFPE/frais et de l'expérience technique de réplication. Le coefficient de corrélation de Pearson (R) des expressions géniques normalisées entre les échantillons FFPE/frais (e) et les échantillons de réplication technique (FFPE1, FFPE2) (f). Chaque point représente le niveau d'expression moyen d'un gène. La ligne rouge indique la ligne de régression linéaire. La valeur p (p) a été calculée à partir d'un test de permutation bilatérale. g Nombre de différents biotypes d'ARN détectés dans l'échantillon FFPE. h Comparaison de détection de gènes de tissus de souris (cœur, reins, testicules et foie) et de foie humain à l'aide de snRandom-seq avec le cerveau de souris par snFFPE-seq15 et le sein par snPATHO-seq14. Noyaux rénaux : n = 5795, noyaux hépatiques : n = 4287, noyaux cardiaques : n = 6732, noyaux testiculaires : n = 3774, noyaux cérébraux : n = 7031, noyaux mammaires : n = 5721. Les données ont été présentées sous forme de valeurs médianes. Les données de la boîte à moustaches correspondaient aux premiers quartiles (charnières inférieures), aux troisièmes quartiles (charnières supérieures) et à la médiane (centre). La moustache supérieure s'étendait de la charnière aux maxima pas plus loin que 1,5 * IQR de la charnière. La moustache inférieure s'étendait de la charnière aux minima d'au plus 1,5 * IQR de la charnière. i Analyse de saturation de snRandom-seq basée sur les tissus de souris FFPE. j Lit la distribution le long du corps du gène par trois méthodes snRNA-seq différentes (snRandom-seq, snFFPE-seq15 et 10X Chromium Fixed RNA Profiling). k Histogramme montrant les ensembles de données de pourcentages de couverture du corps génique générés par les trois méthodes. l Lectures brutes représentatives alignées sur le gène humain C1S dans snRandom-seq et 10X Chromium Fixed RNA Profiling. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Dans notre expérience pilote de séquençage d'ARNsn FFPE, peu de lectures alignées de manière unique ont été cartographiées sur des exons, de nombreuses lectures étant cartographiées sur des régions intergéniques en raison de la contamination du génome (Fig. 3b). Considérant que la double hélice d'ADN dans les tissus FFPE est susceptible d'être perturbée après avoir subi une modification chimique, une étape de blocage des ADN simple brin a été ajoutée à la procédure initiale de snRandom-seq (Fig. 1, encadré). Les ADN simple brin nus dans le noyau unique FFPE isolé ont été bloqués in situ par un recuit multiple et une extension d'amorces de blocage sur des ADN simple brin du génome. Après le blocage de l'ADN, le pourcentage de régions intergéniques a été considérablement réduit (Fig. 3b). La distribution de la région de cartographie était comparable entre l'échantillon FFPE bloqué par l'ADN, l'échantillon frais et le snFFPE-seq (10X Chromium Single Cell 3 'Solution V3), ce qui confirme encore la haute qualité des données snRandom-seq (Fig. 3b). En intégrant les procédures ci-dessus, des bibliothèques d'ADNc de haute qualité ont été générées par snRandom-seq à partir de plusieurs tissus FFPE (Fig. 3c, Fig. 4c, d supplémentaires). La taille des fragments des bibliothèques d'ADNc de FFPE et d'échantillons frais a culminé entre 300 et 800 bps (Fig. 3c, Fig. 4e supplémentaire).

Pour déterminer si snRandom-seq peut générer suffisamment d'informations à partir de tissus FFPE en tant qu'échantillons frais, nous avons collecté à la fois des échantillons FFPE et frais des mêmes tissus de souris et comparé leurs profils d'ARN à l'aide de snRandom-seq (Fig. 3d). La qualité de l'ARN du FFPE et des échantillons frais a été évaluée d'abord par la distribution des fragments d'ARN et DV200. Comme prévu, la qualité de l'ARN de l'échantillon FFPE était relativement inférieure à celle de l'échantillon frais (Fig. 5a supplémentaire), ce qui suggère que l'ARN de l'échantillon FFPE était dégradé. Les pistes fusionnées du navigateur du génome des résultats snRandom-seq ont montré que les zones de couverture des lectures de FFPE et d'échantillons frais étaient similaires (Fig. 6a – g supplémentaires). De manière cohérente, les profils d'ARN total de FFPE et d'échantillons frais par snRandom-seq affichaient une bonne corrélation (Pearson R : ~ 0, 9, p <2, 2e-16; Fig. 3e, Fig. 7a, b supplémentaires). Pendant ce temps, pour prouver la répétabilité de notre méthode, le même échantillon FFPE a été séquencé indépendamment avec snRandom-seq (Fig. 3d), et une forte corrélation (Pearson R ~ 0,92, p < 2,2e-16) des profils d'expression génique dans ces deux lots a également été observée (Fig. 3f). Ces résultats ont montré que snRandom-seq fonctionnait bien dans les échantillons frais et FFPE.

Nous avons ensuite comparé nos résultats FFPE avec d'autres résultats FFPE snRNA-seq rapportés. Après le traitement des données, des milliers de vrais noyaux dans ces tissus FFPE ont été identifiés avec succès à partir des données snRandom-seq (Fig. 3h, Fig. 8a supplémentaire). snRandom-seq a identifié un large éventail de biotypes d'ARN dans l'échantillon FFPE (Fig. 3g), avec environ huit fois plus d'ARNlnc que snFFPE-Seq, et les snoARN, scaARN et miARN n'ont été détectés que dans snRandom-seq (Fig. 8b supplémentaire). Les médianes des gènes détectés par noyau dans les ensembles de données snRandom-seq insaturés étaient toutes supérieures à 3000, significativement plus élevées que celles des deux autres méthodes snRNA-seq à haut débit rapportées pour les échantillons FFPE (snFFPE-Seq 10X Chromium Single Cell 3′ Solution V3 : 276 gènes/noyau ; snPATHO-Seq : 1850 gènes/noyau) (Fig. 3h), ainsi que les médianes des UMI (Fig. 8c supplémentaire). Nos données n'ont pas encore atteint le point de saturation, même en séquençant environ 300 000 lectures cartographiées par noyau et en détectant environ 10 000 gènes (Fig. 3i).

Nous avons en outre comparé la couverture d'ARN de snRandom-seq avec les deux autres méthodes FFPE snRNA-seq. Dans le graphique de la distribution moyenne des lectures sur le corps du gène, snFFPE-Seq utilisant des amorces oligo (dT) a montré un biais distinct à l'extrémité 3 'et le profilage d'ARN fixé au chrome 10X utilisant la même technologie de base de sonde de snPATHO-seq a montré un léger biais à l'extrémité 5 '(Fig. 3j). Cependant, une distribution homogène à travers le corps du gène a été observée dans les données snRandom-seq pour le tissu FFPE (Fig. 3j), ce qui suggère que les amorces aléatoires étaient uniformément liées aux transcrits et que les amorces extra oligo (dT) dans snRandom-seq n'étaient pas valides pour l'échantillon FFPE. Pour la couverture d'ARN au niveau du noyau unique, snRandom-seq a montré une couverture beaucoup plus élevée que celle de snFFPE-seq ou du profilage d'ARN fixé au chrome 10X (Fig. 3k). Pour la couverture d'ARN au niveau d'un seul gène, la distribution des lectures le long de trois gènes sélectionnés (C1S, EMG1, KLRG1) a indiqué la différence critique entre la technologie basée sur les sondes et la stratégie basée sur les amorces aléatoires (Fig. 3l, Fig. 8d supplémentaire). Les lectures cartographiées par profilage d'ARN fixé au chrome 10X étaient limitées aux régions cibles de la sonde (<100 pb). En revanche, les lectures mappées par snRandom-seq étaient uniformément réparties dans les régions exoniques et introniques. Ces résultats suggèrent que snRandom-seq pour les tissus FFPE peut capturer une quantité importante d'ARN de haute qualité et extraire beaucoup plus d'informations transcriptomiques que les plateformes de pointe.

Nous avons ensuite comparé les types de cellules identifiés dans FFPE et des échantillons frais par snRandom-seq. Le regroupement non supervisé du profil de noyau de rein unique filtré de haute qualité ci-dessus a révélé plus de dix groupes distincts. Tous les clusters pourraient être annotés davantage sur la base de marqueurs de type cellulaire connus classiques24,25 (Fig. 4a, b, Fig. 9a supplémentaire). Les expressions géniques de gènes marqueurs de type cellulaire connus classiques22, tels que Nphs1 pour les podocytes, Pecam1 pour les cellules endothéliales et Pdgfrb pour les cellules de type mésangiale, ont été cartographiées de manière fiable sur les grappes correspondantes (Fig. 4b). Le tubule rénal de mammifère dans le rein contient au moins 16 types distincts de cellules épithéliales26. Ici, nous avons identifié la plupart des termes recommandés pour les types de cellules épithéliales des tubules rénaux dans les échantillons de rein de souris FFPE par snRandom-seq, y compris tubule contourné proximal, tubule droit proximal, néphron distal, tubule contourné distal, boucle de Henle, cellules principales du canal collecteur, podocytes, cellules tubulaires proximales, cellules intercalées du canal collecteur et cellules du canal collecteur (Fig. 4a). Outre les principaux marqueurs connus des types de cellules, tels que Slc14a2 pour la collecte des cellules des canaux, nous avons également découvert plusieurs marqueurs potentiels pour ces types de cellules (Fig. 4c). En fusionnant les données snRandom-seq des échantillons FFPE et de l'échantillon frais, ainsi que de l'autre lot d'échantillons FFPE, nous avons obtenu un regroupement cellulaire robuste par t-SNE (incorporation de voisins stochastiques distribués en t) (Fig. 9b supplémentaire). La plupart des types de cellules ont été identifiés dans les trois ensembles de données snRandom-seq (Fig. 4d, Fig. 9c supplémentaire). Comme prévu, il existe certaines différences dans la proportion de types de cellules de la FFPE et des échantillons frais (tels que PTC), qui pourraient être causées par l'erreur d'échantillonnage et différentes méthodes d'extraction de noyaux pour la FFPE et les échantillons frais.

une analyse t-SNE des noyaux isolés d'un échantillon de rein de souris FFPE par snRandom-seq en fonction de leurs expressions géniques et colorées par les types de cellules identifiés. Quatorze types de cellules identifiés ont été colorés et présentés ci-dessous. b Expression de trois marqueurs de type cellulaire sélectionnés dans des noyaux uniques dans les cartes t-SNE du rein de souris FFPE. Les niveaux d'expression des gènes sont indiqués par des nuances de rouge. c Diagramme en points des expressions moyennes des deux marqueurs supérieurs dans chacun des 14 types de cellules. d Proportion de types de cellules annotées de FFPE1, FFPE2 et d'échantillons frais par snRandom-seq. e t-SNE et analyse de la vitesse de l'ARN des snARN des testicules de souris FFPE par snRandom-seq. La vitesse est représentée par des flèches noires dans différents types de cellules par des couleurs distinctes. Les flèches noires indiquent la trajectoire de maturation de l'ARN. f Pourcentages de transcrits épissés et non épissés dans différents types de cellules. g Analyse du cycle cellulaire des testicules de souris FFPE par snRandom-seq. Les points de t-SNE ont été colorés par des phases de cycle cellulaire identifiées (G1, G2M ou S). Cercle pointillé rouge : deux sous-populations de spermatocytes tardifs en phase G2M avec une activité transcriptionnelle active. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons en outre ajouté plus de tissus de souris FFPE pour démontrer l'utilité biologique des données snRandom-seq. Au total, nous avons séquencé et analysé 19 258 noyaux uniques de quatre tissus de souris FFPE (cœur, rein, testicule et foie) à l'aide de snRandom-seq et identifié un total de 25 types de cellules (tels que les hépatocytes, les cellules germinales, les fibroblastes, les cardiomyocytes, etc.). (Fig. 10a, b supplémentaires). Une sous-représentation des cellules immunitaires a pu être observée, ce qui est cohérent avec les découvertes précédentes sur la composition des types de cellules par les bibliothèques d'ARN-seq à noyau unique27.

La grande proportion de séquences introniques détectées dans les échantillons FFPE (Fig. 3b) a suggéré que les données snRandom-seq seraient plus adaptées à l'analyse de la vitesse de l'ARN en distinguant les ARN nouvellement transcrits (non épissés) des ARN matures (épissés)28. Ensuite, nous avons appliqué snRandom-seq aux testicules de souris FFPE, où la spermatogenèse est un excellent modèle pour étudier la dynamique cellulaire. Conformément à d'autres études sur des testicules frais par scRNA-seq29,30, le t-SNE a disposé les cellules germinales à des stades de transition (principalement des spermatocytes précoces et des spermatocytes tardifs) pour qu'ils se succèdent en continu. En revanche, les spermatogonies indifférenciées et les spermatides matures sont en grappes (Fig. 4e). Les vitesses calculées par les transcrits naissants détectés ont été visualisées sur le tracé t-SNE, révélant des directions de vecteur de vitesse distinctes dans différents types de cellules, en particulier dans les cellules situées à gauche des spermatocytes précoces et tardifs (Fig. 4e, f). Combinée à l'analyse des états du cycle cellulaire basée sur l'expression des gènes, la vitesse de l'ARN a révélé une trajectoire de maturation cellulaire évidente sur deux sous-populations de spermatocytes tardifs en phase G2M avec une activité transcriptionnelle active (Fig. 4g).

Enfin, nous avons appliqué snRandom-seq sur un échantillon clinique FFPE d'environ deux ans de sous-type de carcinome hépatocellulaire (CHC) humain macrotrabéculaire-massif (MTM) (Fig. 5a). Nous avons sélectionné une zone tumorale intéressée sur le bloc de paraffine en fonction des examens histopathologiques (Fig. 5b) et effectué snRandom-seq. snRandom-seq a identifié 5914 vrais noyaux et détecté une médiane de 3220 gènes et une médiane de 8182 UMI par noyau dans cet échantillon clinique de FFPE (Fig. 11a supplémentaire, Fig. 5b). À mesure que la profondeur de séquençage augmente, snRandom-seq a détecté environ 8 000 gènes à saturation (Fig. 11b supplémentaire). Un large éventail de biotypes d'ARN, notamment des lncARN, des snARN, des miscARN, des miARN et des snoARN, a été détecté dans l'échantillon (Fig. 11c supplémentaire). Le regroupement non supervisé du noyau unique du foie humain a révélé plusieurs groupes distincts. Les principaux types de cellules du foie humain ont pu être identifiés à partir de l'échantillon humain sur la base des marqueurs de type cellulaire connus31, notamment les hépatocytes (APOA1), les cellules de Kupffer (CD163), les cellules T (CD3E), les fibroblastes (PDGFB), les plasmocytes (FCRL5) (Fig. 5d, Fig. 11d supplémentaire). Notamment, un sous-groupe d'hépatocytes (hépatocyte-2) a été séparé de la population principale d'hépatocytes, avec une forte expression du marqueur prolifératif MKI67 et des deux autres marqueurs (ASPM et TOP2A), qui auraient été liés à la progression du CHC32,33. (Fig. 5e). Pendant ce temps, l'analyse du cycle cellulaire de ces snARN a révélé que la plupart des cellules du groupe d'hépatocytes-2 étaient en phase G2M (Fig. 5f), ce qui suggère que le groupe d'hépatocytes-2 pourrait être un groupe de cellules tumorales en division. Après avoir étudié plus en détail la communication cellulaire entre les grappes (Fig. 5g), nous avons constaté que l'hépatocyte-1 et l'hépatocyte-2 présentaient des schémas de signalisation entrants et sortants différents (Fig. 5h). L'hépatocyte-2 reçoit principalement des signaux des plasmocytes via la voie de signalisation BMP (Fig. 12a supplémentaire), qui serait corrélée à la progression tumorale dans le CHC34,35. L'analyse des paires ligand-récepteur a révélé que les plasmocytes envoyaient préférentiellement des signaux à l'hépatocyte-2 par BMP6-(ACVR1 + ACVR2A) et que la communication entre les plasmocytes et l'hépatocyte-2 avait des paires ligand-récepteur spécifiques, notamment BMP6-(BMPR1B + BMPR2), BMP6-(BMPR1B + ACVR2B), BMP6-(BMPR1B + ACVR2A), BMP6-(BMPR1A + ACVR2A) et BMP6 -(ACVR1 + ACVR2A) (Fig. 5i). L'expression génique a également montré que BMPR1B et ACVR2A ont des expressions spécifiques dans l'hépatocyte-2 (Fig. 12b supplémentaire). Pris ensemble, snRandom-seq a découvert une sous-population proliférative et activée d'hépatocytes à partir d'un échantillon clinique de FFPE, ce qui fournit un indice précieux pour des études supplémentaires à l'avenir.

a Aperçu expérimental d'un échantillon clinique de FFPE de sous-type de carcinome hépatocellulaire macrotrabéculaire massif humain (MTM-HCC) pour snRandom-seq. b Aspect histologique de MTM-HCC à faible grossissement (à gauche, barre d'échelle, 5 mm) et à fort grossissement (à droite, barre d'échelle, 200 μm). Cercle pointillé rouge : zone tumorale. Cercle et ligne pointillés bleus : zone d'échantillonnage. Cercle et ligne en pointillés blancs : zone agrandie. c Graphiques en violon et diagrammes en boîte montrant le nombre de gènes et d'UMI détectés dans l'échantillon humain clinique FFPE par snRandom-seq. Noyaux MTM-HCC : n = 5914. Les données ont été présentées sous forme de valeurs médianes. Les données de la boîte à moustaches correspondaient aux premier et troisième quartiles (charnières inférieure et supérieure) et à la médiane (au centre). Les données de la boîte à moustaches correspondaient aux premiers quartiles (charnières inférieures), aux troisièmes quartiles (charnières supérieures) et à la médiane (centre). La moustache supérieure s'étendait de la charnière aux maxima pas plus loin que 1,5 * IQR de la charnière. La moustache inférieure s'étendait de la charnière aux minima d'au plus 1,5 * IQR de la charnière. d Carte t-SNE des noyaux isolés de l'échantillon FFPE en fonction de leurs expressions géniques. Six types de cellules, dont deux sous-types hépatocellulaires, ont été annotés et représentés. e Les trois premiers marqueurs de chacun des six types de cellules. f Pourcentages des noyaux en phase G1, G2M ou S dans les six types de cellules. g Le nombre total d'interactions entre différentes populations cellulaires. La taille des cercles représentait le nombre de cellules dans chaque groupe de cellules et la largeur des bords représentait la probabilité de communication. h La carte thermique montrant les modèles de signalisation sortants (à gauche) et les modèles de signalisation entrants (à droite) de chaque groupe de cellules. i Diagrammes à bulles montrant la probabilité de communication et la signification statistique des paires récepteur-ligand dans le réseau de signalisation BMP. La couleur des points représentait les probabilités de communication et la taille des points représentait les valeurs p calculées. Les espaces vides signifient que la probabilité de communication était nulle. Les valeurs de p ont été calculées à partir d'un test de permutation unilatéral. Les données source sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

snRandom-seq a également été effectué sur un échantillon FFPE de sous-type de CHC humain normal (Fig. 13a supplémentaire). Sur la base des données snRandom-seq, un nombre suffisant de gènes et un nombre d'UMI ont été détectés, et les principaux amas de cellules du foie ont été identifiés (Fig. 13b, c supplémentaires). Des études antérieures ont indiqué que les lncRNA présentent une expression spécifique au tissu36,37, qui est toujours ignorée dans l'analyse de routine de l'ARN-seq à cellule unique en raison de leur faible expression. Nous avons constaté que les grappes d'hépatocytes du sous-type de CHC normal présentaient une expression notable des lncARN, notamment LINC02476 et LINC01151 dans l'hépatocyte-2, LINC00540, LINC02307 et LINC02109 dans l'hépatocyte-3, LINC02384 dans l'hépatocyte-4 (Fig. 13d supplémentaire). Il a été rapporté que LINC02476 favorise le phénotype malin du CHC en épongeant miR-497 et en augmentant l'expression de HMGA238, et que LINC00540 influence la progression et les métastases du CHC humain via la voie Wnt/β-caténine dépendante de NKD239. Ces résultats suggèrent que l'hépatocyte-2 (exprimé LINC02476) et l'hépatocyte-3 (exprimé LINC00540) du sous-type de CHC normal pourraient présenter une pathogenèse différente. Pris ensemble, snRandom-seq avec les avantages de la couverture des transcriptions complètes est prometteur dans l'analyse de l'ARNnc dans la biologie du cancer.

Nous avons en outre effectué une application de snRandom-seq sur une paire appariée d'échantillons cliniques FFPE initiaux et rechutés provenant du même patient atteint de métastase hépatique du cancer colorectal (CRLM). snRandom-seq a détecté des médianes d'environ 1 000 comptes de gènes et d'environ 2 000 comptes d'UMI dans les échantillons FFPE initiaux et en rechute (Fig. 14a supplémentaire). Les cellules des échantillons FFPE initiaux et rechutés ont été complètement intégrées et les principaux types de cellules (hépatocytes, cellules cancéreuses, cellules T, fibroblastes, cellules myéloïdes, cellules endothéliales, cellules étoilées, macrophages, cholangiocytes, cellules B / plasma) ont été identifiés dans les deux échantillons (Fig. 14b, c supplémentaires). Nous avons observé que la proportion de lymphocytes T était plus élevée dans l'échantillon FFPE en rechute (Fig. 14d supplémentaire), suggérant une réponse immunitaire antitumorale plus active dans l'échantillon en rechute. De manière constante, les proportions des grappes de cancers dominantes (cellules cancéreuses-1, -2 et -3) ont diminué dans l'échantillon en rechute (Fig. 14d supplémentaire). Cependant, la proportion de cellules cancéreuses-4 a augmenté dans l'échantillon en rechute (Fig. 14d supplémentaire). Nous avons en outre découvert que les gènes codant pour le régulateur de composition des lipides (SCD) et les lipides de liaison aux protéines (APOA2, APOC3 et APOA1) affichaient des niveaux d'expression élevés dans le groupe de cellules cancéreuses 4 dans l'échantillon en rechute (Fig. 14e supplémentaire), suggérant une amélioration du métabolisme des lipides dans le sous-groupe de cellules cancéreuses du CRLM en rechute.

Nous avons développé une méthode snRNA-seq à haut débit basée sur des gouttelettes pour les tissus FFPE archivés en utilisant une amorce aléatoire pour capturer les ARN totaux de pleine longueur à partir de noyaux uniques de manière sensible et complète, ce qui fournit donc une avancée critique pour profiler le transcriptome à noyau unique à partir de tissus FFPE ou d'autres types d'échantillons biologiques de faible qualité. Il convient de noter que snRandom-seq utilise des procédures de biologie moléculaire de routine et une plate-forme mature de codage à barres de gouttelettes microfluidiques qui est similaire à la plate-forme actuelle populaire de génomique 10X. Par conséquent, snRandom-seq est facile à utiliser et à commercialiser pour des applications à grande échelle.

L'application biologique moléculaire des tissus FFPE a toujours été difficile en raison de l'ARN chimique réticulé et de mauvaise qualité. Bien que des noyaux uniques puissent être isolés à partir de tissus FFPE et que la réticulation de l'ARN puisse être inversée par digestion à la chaleur et à la protéase, la stratégie populaire de capture d'ARN à base d'oligo (dT) n'est pas efficace avec ces échantillons de faible qualité, comme le démontre le snFFPE-seq avec la plateforme 10X Chromium Single Cell 3' Solution V315, ainsi que l'amorce invalide oligo(dT) dans notre snRandom-seq. snPATHO-Seq14, qui a adopté la technologie basée sur les sondes 10X Genomics pour le noyau FFPE, peut refléter les signatures géniques des gènes d'intérêt, alors qu'il ne cible qu'une très petite partie des transcriptomes. Tout en utilisant l'approche basée sur les amorces aléatoires, nous sommes en mesure d'effectuer efficacement un profilage de transcription à noyau unique impartial sur les échantillons FFPE. Nous envisageons également une intégration de la chimie snRandom-seq avec la technologie de codage à barres spatial3,40, qui permet une analyse de l'expression génique spatiale à haute sensibilité et complète dans les tissus FFPE, en association avec l'histologie de routine. Le microbe est un autre type d'échantillon difficile pour le scRNA-seq, dont la teneur en ARNm est très faible et les queues poly (A) à l'extrémité 3' manquent généralement41. Nous tentons de modifier snRandom-seq et d'étendre son application dans l'ARN-seq à haut débit et à haute sensibilité d'un seul microbe.

Par rapport aux méthodes snRNA-Seq à haut débit à la pointe de la technologie sur les échantillons FFPE14,15, snRandom-seq surpasse ces méthodes sous divers angles, soutenues par les performances décentes sur l'identification du type de cellule, l'analyse de l'expression différentielle et l'analyse des phases du cycle cellulaire. Des données snRNA-seq de haute qualité et haute sensibilité provenant d'échantillons cliniques de FFPE par snRandom-seq permettent de révéler des gènes cibles spécifiques à un type de cellule ou d'identifier des sous-populations rares de diagnostic de précision et de traitement des maladies humaines. De plus, les amorces aléatoires permettent à snRandom-Seq de couvrir davantage de régions du corps du gène, ce qui permet la détection d'une grande quantité d'ARN non codants et l'utilité supplémentaire des transcrits naissants dans l'analyse de la vitesse de l'ARN. Nous avons utilisé des transcrits naissants pour l'analyse de la vitesse de l'ARN et révélé une trajectoire de maturation cellulaire évidente sur deux sous-populations spécifiques dans cette étude. De plus, ces ensembles de données snRNA-seq totaux de pleine longueur permettent une analyse complète de la variation du nombre de copies (CNV), de l'épissage alternatif et des mutations au niveau d'une seule cellule/noyau.

En conclusion, les protocoles expérimentaux simples et les informations transcriptomiques complètes des tissus FFPE décrits dans cette étude devraient permettre à snRandom-seq d'être utilisé à grande échelle dans les recherches fondamentales et cliniques à l'avenir.

Toutes les procédures impliquant des souris dans cette étude ont été approuvées par le Comité de protection et d'utilisation des animaux de l'Université du Zhejiang (numéros d'approbation : ZJU20170466). La collecte d'échantillons humains et les recherches menées dans cette étude ont été approuvées par le comité d'éthique de la recherche du premier hôpital affilié de la faculté de médecine de l'université du Zhejiang (numéros d'approbation : IIT20220893A). Les informations cliniques ont été recueillies après consentement éclairé écrit. Cette étude est conforme aux directives du ministère de la Science et de la Technologie (MOST) pour l'examen et l'approbation des ressources génétiques humaines (numéros d'approbation : 2023BAT0303).

Les cellules HEK293T (Cat. CL-0005) et les cellules 3T3 (Cat. CL-0006) ont été commandées auprès de la société (Procell Life Science&Technology). Des souris mâles de type sauvage C57BL6/J (âgées de 6 à 8 semaines) ont été commandées auprès de Shanghai SLAC Laboratory Animal. Seules des souris mâles ont été utilisées dans l'étude. Le sexe a été déterminé sur la base d'études similaires dans ce domaine. Les souris étaient logées dans des conditions de laboratoire standard, y compris un cycle lumière/obscurité de 12 h, des températures de 18 à 23 ° C avec une humidité de 40 à 60 %, avec un accès libre à l'alimentation et à l'eau des souris. Toutes les expériences étaient conformes aux normes réglementaires pertinentes du Zhejiang University Laboratory Animal Center. Des échantillons FFPE de tissus de souris ont été préparés par Core Facilities, Zhejiang University School of Medicine. Les tissus FFPE de cancers humains cliniques ont été fournis par le premier hôpital affilié de la faculté de médecine de l'Université du Zhejiang. Les tissus FFPE d'un carcinome hépatocellulaire macrotrabéculaire-massif et d'un CHC normal ont été prélevés chez deux patients chinois de sexe masculin (respectivement âgés de 43 et 45 ans) par résection chirurgicale. La paire appariée d'échantillons cliniques FFPE initiaux et rechutés a été prélevée sur le même patient chinois de sexe masculin (âge initial 62 ans, rechute 64 ans) avec des métastases hépatiques de cancer colorectal. Les informations cliniques ont été recueillies après la rédaction du consentement éclairé.

Les cellules HEK293T et les cellules 3T3 ont été maintenues dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM, Gibco, Cat #11965092), additionné de 10 % (v/v) de sérum bovin fœtal inactivé par la chaleur (FBS, Gibco, Cat # 26010074) et cultivées à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 (Thermo Heracell 240i). Les deux cellules ont été passées tous les 2 jours. Pour l'expérience de mélange d'espèces, les cellules HEK293T et les cellules 3T3 ont été récoltées et lavées trois fois dans du PBS par centrifugation à 4 ° C, 600 g pendant 3 min. Les cellules ont été lysées par un tampon de lyse de noyaux pré-froid (1X PBS avec 0, 1% de Nonidet P-40 (NP-40, Aladdin, Cat # N274254) et 1 U / μL d'inhibiteur de RNase (Invitrogen, Cat # N8080119)) incubé à 4 ° C pendant 5 min. Ensuite, les noyaux frais ont été lavés trois fois et fixés en ajoutant 1 ml de paraformaldéhyde à 4% (PFA, Aladdin, Cat # P395744) dans du PBS et en incubant à température ambiante pendant 15 min. Ensuite, le PFA a été jeté par centrifugation à 600 g pendant 3 min, et les noyaux ont été lavés trois fois avec 1 mL de tampon de lavage pré-froid (1X PBS avec 1 U/μL d'inhibiteur de RNase). Les noyaux ont été perméabilisés en ajoutant 500 µL de Triton X-100 à 0,1 % (Aladdin, Cat # T109027) dilués dans un tampon de lavage pré-froid et incubés à 4 °C pendant 5 min. Ensuite, 1 ml de tampon de lavage a été ajouté directement aux noyaux, et les noyaux ont été lavés trois fois avec 1 ml de tampon de lavage pré-froid. Les noyaux HEK293T et les noyaux 3T3 ont été comptés respectivement et également mélangés. Ensuite, le mélange a été traité en ARN-seq à noyau unique selon le protocole snRandom-seq suivant.

Les échantillons de FFPE ont été coupés du bloc de paraffine et ont été lavés deux fois avec 1 ml de xylène (Aladdin, Cat # X112054) pendant 5 min à température ambiante pour éliminer la paraffine. Les échantillons ont été doucement réhydratés en les immergeant dans une série graduée de solutions d'éthanol (Aladdin, Cat # E130059), en commençant par de l'éthanol pur à 100 % et en terminant par de l'éthanol à 30 %. Les échantillons ont ensuite été lavés deux fois avec un tampon de lavage pré-froid et homogénéisés avec un homogénéisateur Dounce (Bellco Glass, Inc. Dounce Homogenizer 2 mL, Cat # 50-194-5204) en présence de tampon de lyse pré-froid (tampon PBS 1X, 0,1 % Triton X-100, 1 U/μL d'inhibiteur de RNase) sur de la glace. Après homogénéisation, 1 mL supplémentaire de tampon de lyse a été utilisé pour rincer le douncer, et 100 μL de 10 mg/mL de protéinase K (Sangon Biotech, Cat # A610451) ont été ajoutés dans le tampon de lyse, en incubant à 37 °C pendant 5 min. Ensuite, les noyaux isolés ont été filtrés à travers un tamis cellulaire de 20 μm (pluriSelect, Cat # 43-10020-40) et lavés deux fois avec un tampon de lavage. Une aliquote de noyaux a été colorée avec une solution de coloration DAPI (4',6-diamidino-2-phénylindole) (Abcam, Cat # ab228549), chargée sur un hémocytomètre et observée au microscope à fluorescence inversé (Nikon Eclipse, Ts2-FL). Les noyaux uniques qualifiés ont été traités en ARN-seq à noyau unique selon le protocole snRandom-seq suivant. Un protocole détaillé, y compris le volume du tampon de lyse et du tampon de perméabilisation, des systèmes de réaction et des programmes de réaction, a été fourni dans le fichier d'informations supplémentaires (Note supplémentaire 1 : protocole snRandom-seq 1.0).

Des échantillons frais de tissus de souris adultes ont été récoltés à partir de la même souris pour les échantillons FFPE. Des échantillons frais ont été lavés deux fois avec un tampon de lavage pré-froid, coupés en morceaux et homogénéisés avec un homogénéisateur Dounce avec un tampon de lyse pré-froid sur de la glace. Après homogénéisation, les noyaux isolés ont été lavés deux fois avec du tampon de lavage. Les noyaux simples frais ont été fixés, perméabilisés et qualifiés selon le protocole de la lignée cellulaire, puis transformés en noyaux uniques ARN-seq selon le protocole snRandom-seq suivant.

Deux échantillons identiques de rein de souris FFPE ont été coupés séparément du même bloc de paraffine, puis traités avec le protocole snRandom-seq.

Les noyaux FFPE qualifiés ont été comptés et un total de 100 000 à 1 000 000 noyaux ont été utilisés pour le blocage in situ de l'ADN. Le mélange réactionnel suivant a été préparé : noyaux dans 25,5 µL de PBS, 5 µL d'amorce bloc 10 µM, 2 µL d'ADN polymérase, 10 µL de tampon de polymérisation d'ADN 5X, 5 µL de dNTP 100 mM, 2,5 µL d'inhibiteur de RNase. La séquence de l'amorce de bloc a été fournie dans le fichier d'informations supplémentaires (tableau supplémentaire 1 : amorces). Le kit ADN polymérase était inclus dans le kit VITAPilote-EFT1300 (Cat # R20123124) commandé auprès de M20 Genomics. Le mélange réactionnel a été incubé à 37°C pendant 30 min. Après incubation, les noyaux ont été lavés avec du PBST (1X PBS avec 0,05 % de T-ween 20) trois fois pour laver les amorces de blocage résiduelles et les dimères d'amorces.

In situ, la transcription inverse a été réalisée en utilisant le mélange réactionnel suivant : 100 000 à 1 000 000 noyaux dans 22,5 µL de PBS, 5 µL d'amorce aléatoire 10 µM, 5 µL d'amorce oligo(dT) 10 µM, 2,5 µL de transcriptase inverse, 10 µL de tampon de transcription inverse 5X, 2,5 µL de dNTP 100 mM, 2,5 µL de RNase In inhibiteur. Les séquences de l'amorce aléatoire et de l'amorce oligo (dT) ont été fournies dans le fichier d'informations supplémentaires (tableau supplémentaire 1 : amorces). Le kit de transcription inverse était inclus dans le kit VITAPilote-EFT1300 (Cat # R20123124) commandé auprès de M20 Genomics. Le mélange réactionnel a été incubé avec douze cycles de recuits multiples allant de 8 °C à 42 °C et 30 min à 42 °C. Après la transcription inverse, les noyaux ont été lavés trois fois avec du PBST pour éliminer l'amorce aléatoire résiduelle et les dimères d'amorce.

Pour la queue dA, le mélange réactionnel suivant a été préparé : 100 000 à 1 000 000 noyaux dans 39 µL de PBS, 5 µL de tampon de réaction TdT 10X, 0,5 µL d'enzyme TdT, 0,5 µL de dATP 100 mM (NEB, Cat # N0440S), 5 µL de CoCl2. Le kit de réaction TdT a été commandé auprès de NEB (Cat # M0315S), comprenant un tampon de réaction TdT 10X, l'enzyme TdT et CoCl2. Le mélange réactionnel de queue dA a été incubé à 37 ° C pendant 30 min, puis lavé avec du PBS avec 0, 05% de Tween 20 trois fois.

Les dispositifs microfluidiques ont été conçus à l'aide d'AutoCAD (2021, AutoDESK, USA) selon nos travaux précédents17. Les conceptions assistées par ordinateur ont été imprimées sous forme de photomasques pour solidifier un motif en relief en tant que maître sur une plaquette de silicium. La conception de l'appareil est fournie dans le Supplément 1a et le Supplément 2a. La profondeur du canal sur les dispositifs pour billes d'hydrogel est de 30 μm, et pour l'encapsulation cellulaire est de 50 μm. Des dispositifs microfluidiques ont été fabriqués en utilisant du polydiméthylsiloxane (PDMS) selon le protocole décrit42. La base PDMS et les agents de durcissement (10: 1, poids / poids) ont été mélangés par Thinky Mixer et marqués dans des canaux en utilisant le maître comme moule. Ensuite, une dalle PDMS a été acquise et les orifices d'entrée et de sortie ont été perforés. Le côté du canal a été traité avec du plasma d'oxygène et la dalle de PDMS a été collée avec une lame de verre pour obtenir le dispositif microfluidique. Traiter les surfaces du canal avec du perfluorododécyltrichlorosilane pour un revêtement fluorophilique afin de produire des gouttelettes monodisperses et fiables avant d'utiliser cet appareil.

Nous avons conçu les billes à code-barres sur la base de travaux antérieurs16,17 et les avons personnalisées avec la société M20 Genomics. Des billes d'hydrogel ont été synthétisées par l'émulsification microfluidique et la polymérisation du mélange acrylamide-amorce. Le mélange d'acrylamide-amorce contient 1 × solution d'acrylamide:bis-acrylamide (Invitrogen, Cat # AM9022), 50 μM d'oligonucléotides modifiés par acrydite, 10% wt/vol de persulfate d'ammonium (APS, Sangon Biotech Cat # A100486-0025), et 1 × Tampon salin tamponné Tris-EDTA-Triton (TBSET). Dans cette étude, l'oligonucléotide modifié par l'acrydite a été conçu pour contenir une base désoxy-uridine, au lieu d'un fragment photoclivable. Ensuite, les billes ont été divisées dans une plaque à 96 puits dans des amorces de code-barres uniques pour des ligatures en 3 étapes au lieu de réactions d'extension en 2 étapes. Les séquences d'amorces de codes à barres ont été fournies dans le fichier d'informations supplémentaires (tableau supplémentaire 1 : amorces).

Le codage à barres des gouttelettes a été réalisé conformément aux travaux antérieurs16,17. La morphologie des noyaux uniques après des réactions in situ a été observée au microscope optique. Les noyaux individuels ont été comptés et dilués avec une solution à gradient de densité de 30 %. Des noyaux, un mélange réactionnel d'extension d'ADN 2X et des billes à code-barres ont été encapsulés dans des gouttelettes à l'aide de la plate-forme microfluidique comme décrit précédemment. Le mélange réactionnel d'extension d'ADN 2X a été commandé auprès de M20 Genomics. Ensuite, les émulsions ont été incubées à 37 °C pendant 1 h, 50 °C 30 min, 60 °C 30 min et 75 °C 20 min. Après la réaction de codage à barres, les gouttelettes ont été brisées en les mélangeant avec du tampon PFO. La phase aqueuse a été prélevée et purifiée par des billes Ampure XP (Beckmen, Cat #A63881). Une PCR a été réalisée pour amplifier le produit purifié avec les amorces Primer1 et Primer2 (tableau supplémentaire 1). Le produit amplifié a été purifié par des billes Ampure XP et quantifié par Qubit (Invitrogen).

Après amplification et purification, le kit de préparation de bibliothèque d'ADN universel VAHTS pour Illumina V3 (Vazyme, Cat # ND607-01) a été utilisé pour construire la bibliothèque. L'ADN d'entrée a été quantifié par Qubit2.0 (Life Technologies) et la taille a été mesurée avec l'analyseur de fragments d'ADN Qsep100™ (BIOptic). Ensuite, une réparation terminale et une adénylation ont été effectuées. Le mélange réactionnel contenant de l'ADN fragmenté (50 ng), du tampon de réparation terminale, des enzymes de réparation terminale et de l'eau sans nucléase a été incubé à 30 ° C pendant 30 min et inactivé à 65 ° C pendant 30 min. Le mélange réactionnel de fin de préparation fini a été ajouté avec un adaptateur de travail et des enzymes de ligature, puis a été incubé à 20 ° C pendant 15 min. L'ADN ligaturé a été purifié et la taille a été sélectionnée avec des billes AMPure XP (Beckmen, Cat #A63881). L'amplification de la bibliothèque a été suivie et la purification a été effectuée avec des billes AMPure XP. La bibliothèque finale a été quantifiée par Qubit2.0 et la taille de la bibliothèque a été mesurée avec l'analyseur de fragments d'ADN Qsep100™. Le séquençage de la bibliothèque a été effectué à l'aide du kit de réactifs NovaSeq 6000 et S4 avec des lectures appariées de 150.

Tout d'abord, les séquences d'amorces et les bases supplémentaires générées par l'étape de dA-tailing ont été coupées dans les données de séquençage brutes. Ensuite, pour chaque Read1, nous avons extrait l'UMI (8 nts) et le code-barres spécifique à la cellule (30 nts) et fusionné les codes-barres séquencés qui peuvent être attribués de manière unique au même code-barres accepté avec une distance de Hamming de 2 nts ou moins. Read2 a été utilisé pour générer la matrice d'expression génique par le module STARsolo dans STAR (2.7.10a) avec des paramètres raisonnables. Les noyaux valides ont été identifiés par STARsolo. Bedtools (2.26.0) a été utilisé pour calculer la couverture du transcriptome. IGV(2.13.2) a été utilisé pour générer un tracé de couverture du génome. ggplot2 (3.3.5) dans R (4.2.1) a été utilisé pour générer des tracés bruts.

La matrice d'expression génique filtrée par code-barres a été générée avec les ARN mitochondriaux et les ARN ribosomiques retirés. L'analyse et la visualisation des données snRNA-seq ont été effectuées à l'aide de la boîte à outils RStudio et Seurat 3, y compris le prétraitement, l'intégration, la visualisation, le regroupement, l'identification du type de cellule, les tests d'expression différentielle. Les noyaux avec moins de 200 gènes détectés et les gènes détectés dans moins de trois noyaux ont été filtrés. Pour l'intégration des ensembles de données snRNA-seq, les comptages ont d'abord été normalisés à l'aide de la fonction sctransform dans Seurat43 et intégrés à l'aide de l'analyse de corrélation canonique (CCA)44. Des intégrations ont été effectuées sur les échantillons de comparaison FFPE/frais (FFPE1, FFPE2 et frais). Pour chaque échantillon, 2000 ancres ont été identifiées et les ensembles de données snRNA-seq ont été intégrés à la fonction IntegrateData en utilisant 20 dimensions44. Les ensembles de données intégrés ont été construits sur le graphique du voisin le plus proche partagé (SNN) en exécutant une analyse en composantes principales (PCA), FindNeighbors avec 30 PC, la fonction FindClusters avec une résolution de 1. Les clusters ont été visualisés à l'aide de l'incorporation de voisins stochastiques distribués en t (t-SNE) des composants principaux tels qu'implémentés dans Seurat. Les identités de type cellulaire pour chaque groupe ont été déterminées manuellement à l'aide d'une liste publiée de gènes marqueurs. Les gènes marqueurs ont été identifiés à l'aide de la fonction FindAllMarkers de Seurat et ont conservé les gènes marqueurs correspondant aux critères de filtre (only.pos = TRUE, min.pct = 0,25, logfc.threshold = 0,25). Les phases du cycle cellulaire ont été prédites à l'aide d'une fonction incluse dans Seurat qui note chaque cellule en fonction de l'expression de gènes marqueurs canoniques pour les phases S et G2/M.

Pour comparer le niveau d'expression génique entre la FFPE et l'échantillon frais, ainsi qu'entre les deux répliques techniques, nous avons importé les données de comptage dans Seurat (v3 et v4.1.1), normalisé et mis à l'échelle les données avec les paramètres par défaut. Ensuite, nous avons calculé l'expression normalisée moyenne à l'aide de la fonction AverageExpression de Seurat. Après cela, nous avons tracé le logarithme naturel de l'expression moyenne avec un pseudo-compte ajouté et calculé le coefficient de variation et la valeur de p en utilisant ggpubr (0.4.0) dans R(4.2.1).

Les fichiers de sortie des données snRandom-seq ont été traités avec le scVelo (version 0.2.4) pour marquer les transcrits épissés et non épissés, et les résultats ont été analysés avec le package velocyto.R 0.6 dans R.

L'analyse de la communication cellulaire a été effectuée à l'aide du package R CellChat (version 1.6.1) avec les paramètres par défaut.

Les détails statistiques pour chaque expérience sont fournis dans les légendes des figures. L'expérience d'encapsulation microfluidique, l'expérience d'isolement de noyaux uniques FFPE, l'expérience de synthèse de billes, l'expérience d'analyse de fragments d'ADN, l'expérience de comparaison de la protéinase K et de la collagénase et l'expérience de comparaison de la qualité de l'ARN (DV200) ont été répétées plus de cinq fois indépendamment avec des résultats similaires. L'expérience de mélange 293T-3T3 et l'expérience de bloc d'ADN ont été répétées trois fois indépendamment avec des résultats similaires. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Aucune donnée n'a été exclue des analyses. Les expériences n'étaient pas randomisées. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation pendant les expériences et l'évaluation des résultats.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données snRandom-seq snRNA-seq générés dans cette étude ont été déposés dans les archives de séquences du génome sous le code d'accession "CRA010745" (mélange 293T-3T3 et tissus FFPE de souris) et "HRA003712" (échantillons MTM-HCC et HCC FFPE normaux). Les données publiques de scRNA-seq du mélange de cellules 293T et 3T3 par 10X Chromium Single Cell 3' Solution V3 utilisées dans cette étude sont disponibles dans les archives à lecture courte sous le code d'accession "SRP073767". Les données publiques de scRNA-seq des cellules 293T par VASA-drop sont disponibles sur Gene Expression Omnibus sous le code d'accession "GSE176588". Les données sources sont fournies dans ce document.

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Le projet a été soutenu par la National Natural Science Foundation of China (n° 32200073, YW, n° 82200977, ZX) et le Leading Innovative and Entrepreneur Team Introduction Program of Zhejiang (n° 2021R01012, YW). Merci pour le soutien technique des installations centrales du centre médical de l'université du Zhejiang et du laboratoire Liangzhu. Nous remercions Jingyao Chen et Chengcheng Zhang des installations principales de l'École de médecine de l'Université du Zhejiang pour leur soutien technique.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ziye Xu, Tianyu Zhang, Hongyu Chen.

Département de médecine de laboratoire, premier hôpital affilié, École de médecine de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Ziye Xu, Yu Chen et Yongcheng Wang

Laboratoire Liangzhu, Centre médical de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Ziye Xu, Yuyi Zhu, Yuexiao Lv, Haide Chen, Guoji Guo et Yongcheng Wang

M20 Génomique, Hangzhou, Chine

Tianyu Zhang, Shengyu Ni, Fangru Lu, Zhaolun Wang, Hao Yang, Ling Dong et Jiong Liu

École de médecine, Université de la ville de Hangzhou, Hangzhou, Chine

Fan de Hongyu Chen et de Longjiang

Institut de bioinformatique, Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Fan de Hongyu Chen et de Longjiang

Institut James D. Watson des sciences du génome, Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Fan de Hongyu Chen et de Longjiang

Collège de génie biomédical et de science des instruments, Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Shunji Zhang, Hong Zhang et Yongcheng Wang

Département d'informatique biomédicale, Harvard Medical School, Boston, États-Unis

Jiaye Chen

Département de radiologie, premier hôpital affilié, École de médecine de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Lili Yang et Feng Chen

Département de chirurgie colorectale, premier hôpital affilié, Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Weiqin Jiang

Département de médecine nucléaire et centre de TEP/TDM, deuxième hôpital affilié, école de médecine de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Hong Zhang

Département de pathologie et Département d'oncologie médicale du deuxième hôpital affilié, École de médecine de l'Université du Zhejiang, Hangzhou, Zhejiang, Chine

Dandan Zhang

Département de pathologie, Laboratoire clé de protéomique des maladies de la province du Zhejiang, École de médecine, Université du Zhejiang, Hangzhou, Chine

Dandan Zhang

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YW et ZX ont conçu l'étude et rédigé l'article. YW, GG et JL ont conçu le projet. ZX, YZ, SZ, HDC, YL, HY et LD ont développé la chimie snRandom-seq. ZX, TZ, LF, HYC, JC, SN, FL, ZW, DZ et YC ont analysé les données. YW, SZ et YL ont construit la plateforme microfluidique. LY, WJ, FC et HZ ont contribué à l'expérience humaine FFPE. YW, GG et LF ont supervisé ce projet. Tous les auteurs ont révisé et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Longjiang Fan, Guoji Guo ou Yongcheng Wang.

YW et ZX ont déposé une demande de brevet auprès de l'office chinois des brevets concernant la méthode de ce travail (numéro de demande : CN 114507711 A). Plusieurs auteurs sont impliqués dans la commercialisation de la technique et s'engagent avec M20 Genomics, Inc. (LD et JL sont co-fondateurs et employés ; YW et GG sont co-fondateurs, actionnaires et consultants ; TZ et SN sont des employés.) Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Communications remercie Rui Chen et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Xu, Z., Zhang, T., Chen, H. et al. Séquençage d'ARN total à noyau unique à haut débit de tissus fixés au formol et inclus en paraffine par snRandom-seq. Nat Commun 14, 2734 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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Reçu : 10 novembre 2022

Accepté : 27 avril 2023

Publié: 12 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-38409-5

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