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Oct 18, 2023

Vaccination avec un VIH T

npj Biofilms et Microbiomes

npj Biofilms et Microbiomes volume 8, Numéro d'article : 104 (2022) Citer cet article

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Le microbiote intestinal apparaît comme un facteur crucial modulant les réponses vaccinales ; cependant, peu d'études ont étudié si les vaccins, à leur tour, peuvent modifier le microbiote et dans quelle mesure ces changements peuvent améliorer l'efficacité des vaccins. Pour comprendre l'effet de la vaccination par les lymphocytes T sur le microbiome intestinal, nous avons administré un immunogène des lymphocytes T du VIH-1 (bras HTI) ou du PBS (contrôle, bras Mock) à des souris C57Bl/6 selon un schéma hétérologue prime-boost. La dynamique longitudinale du microbiote intestinal des souris a été caractérisée par le séquençage de l'ARN ribosomique 16 S dans des échantillons fécaux prélevés dans des cages, ainsi que dans trois sections intestinales (caecum, petit et gros intestin). Des cellules sériques et spléniques ont été obtenues au dernier moment de l'étude pour évaluer les corrélats immunitaires à l'aide des tests IFNγ ELISPOT et cytokine Luminex®. Par rapport à Mock, les souris vaccinées par HTI ont été enrichies en genres Clostridiales (groupe Eubacterium xylanophilum, Roseburia et Ruminococcus) connus comme principaux contributeurs de métabolites anti-inflammatoires, tels que les acides gras à chaîne courte. Un tel changement a été observé après la première dose HTI et est resté tout au long du suivi de l'étude (18 semaines). Cependant, les genres Clostridiales enrichis étaient différents entre les fèces et les coupes intestinales. L'abondance de bactéries enrichies chez les animaux vaccinés était positivement corrélée aux réponses des lymphocytes T spécifiques au HTI et à un ensemble de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'IL-6. Cette analyse longitudinale indique que, chez la souris, la vaccination des lymphocytes T peut favoriser une augmentation des bactéries intestinales connues pour produire des molécules anti-inflammatoires, qui à leur tour sont en corrélation avec les cytokines pro-inflammatoires, suggérant une adaptation du milieu microbien intestinal à l'inflammation systémique induite par les lymphocytes T.

Il a été bien établi que le microbiote gastro-intestinal résident joue un rôle central dans le développement et la régulation des réponses immunitaires innées et adaptatives1. Parmi les différents déterminants de la réponse immunitaire adaptative, la polarisation de la réponse des lymphocytes T pourrait être particulièrement affectée par la composition des bactéries intestinales2. En fait, l'absence de bactéries spécifiques a été associée à des fréquences réduites de cellules Treg dans l'intestin3 ou à des réponses cellulaires Th17 dérégulées chez des souris sans germes et traitées avec des antibiotiques4. Des ratios anormaux de ces sous-populations de lymphocytes T (Th17 et Treg) ont été fréquemment associés à des maladies métaboliques ou immunologiques5.

Compte tenu de l'interaction étroite et de la co-évolution du microbiote intestinal et du système immunitaire6, de plus en plus de preuves suggèrent que certains taxons bactériens pourraient également moduler les réponses immunitaires induites par les vaccins7, en exerçant des effets locaux ou systémiques8. Ces dernières années, plusieurs études cliniques et animales ont montré que la composition et les fonctions du microbiote intestinal sont des déterminants cruciaux de l'immunogénicité et de l'efficacité des vaccins oraux et injectables9,10. Jusqu'à présent, la plupart des travaux dans ce domaine se sont concentrés sur le rôle du microbiote dans la modulation des réponses anticorps induites par les vaccins7. Il convient de noter que l'importance de l'immunité à médiation cellulaire T est de plus en plus reconnue dans la protection induite par plusieurs stratégies d'immunisation, y compris celles contre des agents pathogènes tels que le VIH-111 ou le SRAS-CoV-212. Pourtant, un nombre limité d'études ont directement étudié la relation entre le microbiote intestinal préexistant et les réponses des lymphocytes T à la vaccination13.

L'effet de l'administration du vaccin sur le microbiote intestinal a encore moins retenu l'attention. Des travaux antérieurs portant sur les effets des vaccins contre le VIH-114,15 et la typhoïde16 orale sur le microbiote intestinal humain n'ont signalé aucune perturbation perceptible de la structure de la communauté microbienne induite par la vaccination. En revanche, une augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes après immunisation ADN/protéine du VIH-1 a été observée dans le microbiome rectal des primates non humains17. De plus, une étude récente comparant deux stratégies de vaccination contre le SARS-CoV-2 a rapporté des changements dans le microbiote intestinal humain 1 mois après la vaccination, caractérisés par une plus faible diversité alpha et une abondance accrue d'une certaine espèce bactérienne, comme Bacteroides caccae18. Collectivement, cela fournit au moins une preuve circonstancielle que la vaccination peut influencer le microbiote résident. Par conséquent, comprendre comment les vaccins favorisent les changements dans le milieu immunitaire intestinal de l'hôte et modifient la structure de la communauté microbienne peut fournir des informations importantes sur cette interaction et, à son tour, sur l'identification de bactéries spécifiques qui modulent positivement les résultats de la vaccination.

Dans la présente étude, des vecteurs exprimant l'immunogène des cellules T du VIH-1 (HTI)19,20 ont été utilisés pour évaluer les changements induits par le vaccin dans le microbiote intestinal et pour identifier les corrélats potentiels avec la réponse immunologique à la vaccination dans un modèle murin. L'immunogénicité du HTI a été testée chez la souris21,22 et chez l'homme23 à l'aide de différents vecteurs vaccinaux (tels que l'ADN, l'adénovirus du chimpanzé, ChAdOx1 ; le virus du vaccin modifié Ankara, MVA et Bacillus Calmette-Guérin, BCG). Sur la base de ces preuves antérieures, la souche de souris C57Bl / 6 et une amorce à trois ADN suivie d'un rappel ChAdOx.1-MVA ont été sélectionnées pour obtenir une immunogénicité maximale. Le séquençage du gène de l'ARNr 16S a été utilisé pour caractériser les profils longitudinaux du microbiome fécal et du contenu intestinal chez des souris recevant un schéma d'immunisation HTI prime-boost ou PBS (groupe témoin). Les corrélations entre les signatures microbiennes intestinales, la réponse vaccinale des lymphocytes T et les cytokines après une immunisation complète ont également été évaluées.

Pour étudier les effets de la vaccination HTI sur le microbiote intestinal, deux groupes expérimentaux recevant l'immunogène HTI (Immunized, n = 20) ou PBS (Mock, n = 20) ont été comparés (Fig. 1). Des échantillons fécaux ont été prélevés longitudinalement dans des cages et dans trois sections intestinales pour le profilage du microbiome intestinal ; du sérum et des splénocytes ont été obtenus à la fin de l'étude pour évaluer respectivement l'immunogénicité du vaccin et les profils de cytokines (Fig. 1 supplémentaire). Deux semaines avant la vaccination, le microbiote intestinal des souris a été homogénéisé par conditionnement antibiotique suivi d'un transfert de microbiote fécal (FMT) de souris à souris pour réduire la variabilité de base, comme détaillé dans le texte supplémentaire et la Fig.

Des souris femelles et mâles ont été immunisées avec un vaccin anti-VIH à cellules T (trois amorces DNA.HTI suivies d'un rappel ChAd.HTI et MVA.HTI ; n = 20) ou un vaccin factice (PBS ; n = 20). Un conditionnement antibiotique suivi d'un transfert de microbiote fécal a été effectué avant la vaccination afin d'homogénéiser le contenu intestinal de tous les animaux. La collecte d'échantillons, y compris les selles, le contenu luminal, le sérum et la rate, a été achevée aux moments indiqués. Abréviations : transfert de microbiote fécal FMT, antibiotique Atb, solution saline tamponnée au phosphate PBS. La figure a été en partie générée à l'aide de Servier Medical Art, fourni par Servier, sous licence Creative Commons Attribution 3.0 non transposée.

Les échantillons longitudinaux simulés et immunisés ne présentaient aucune différence dans le nombre de lectures filtrées de haute qualité, avec une médiane de 52 092 et 46 584 lectures, respectivement (Fig. 3a et tableau S4 supplémentaires). Les contrôles d'extraction négative (n = 12) et de PCR sans matrice (n = 11) avaient un nombre de lectures significativement inférieur (5966 et 1444 nombre moyen de lectures, respectivement) par rapport aux groupes expérimentaux (Fig. 3a supplémentaire). Bien que la profondeur de séquençage soit plus élevée dans le lot 1 (Fig. 3b supplémentaire), aucun impact substantiel sur la structure des données n'a été observé après évaluation des différences entre les deux lots (Fig. 4 supplémentaire) (le lot a été inclus en tant que covariable dans les tests pour les échantillons fécaux regroupés prélevés dans les cages).

Avant la vaccination, les échantillons présentaient une composition bactérienne similaire (0 semaine, Fig. 2 supplémentaire) et seul le genre A2 a été augmenté dans le groupe Mock (Fig. 5a supplémentaire). Après avoir été séparées par sexe, les souris femelles ont montré une plus grande abondance de Lactobacillus et de Muribaculum avant la vaccination (Fig. 5b supplémentaire).

Au niveau de la famille, la composition globale de la communauté microbienne entre les groupes Mock et Immunisé était similaire au cours de l'expérience (Fig. 2a). Les échantillons de contenu fécal et luminal étaient dominés par les Muribaculaceae (49,8% et 57,9%), les Lachnospiraceae (14,2% et 11,4%), les Bacteroidaceae (9,4% et 4,8%) et les Bifidobacteriaceae (7,1% et 6,2%) (Fig. 2a et Fig. 6a supplémentaire), à ​​l'exception de l'intestin grêle (Fig. 6b supplémentaire). Dans cette section intestinale, la réduction du groupe Lachnospiraceae NK4A136 (0, 2%) et des Bacteroides (0, 05%) était concomitante à une augmentation globale des Lactobacillus (7, 7%) et des Ligilactobacillus (3, 7%) (Fig. 6c, d supplémentaires). Malgré les similitudes de composition globales lors de l'administration du vaccin (0 semaine à 15 semaines, Fig. 2a et Fig. 6e supplémentaire), les échantillons ont été regroupés séparément par groupe expérimental (p = 0, 022), mais pas par moment dans chaque groupe (p = 0, 594) (Fig. 2b), comme indiqué par les analyses univariées et multivariées (tableau supplémentaire 5). Les covariables Cage et Sexe ont également montré un impact significatif sur la composition du microbiote (tableau supplémentaire 5). Malgré l'absence de contribution au niveau individuel dans nos évaluations, une tendance à une dissimilitude Bray-Curtis plus élevée dans le groupe immunisé par rapport au groupe Mock a été observée (Fig. 6f supplémentaire), indiquant potentiellement un fort impact sur le microbiote intestinal des souris vaccinées. De plus, aucune différence de diversité alpha (indice de Shannon) n'a été observée entre les groupes lors de la vaccination (Fig. 6g supplémentaire). Un regroupement par groupe expérimental (p = 0,021) et section intestinale (p = 0,001) a également été observé au dernier moment de l'étude, étant des échantillons d'intestin grêle séparés de ceux du caecum et du gros intestin (Fig. 2c). De plus, les échantillons de l'intestin grêle présentaient une diversité alpha plus faible dans les groupes simulés et immunisés par rapport au caecum et au gros intestin, bien qu'aucune différence entre les deux groupes expérimentaux n'ait été détectée (Fig. 2d).

un graphique à barres empilées affichant l'abondance relative des familles bactériennes (les 15 plus abondantes) à différents moments chez les souris vaccinées par HTI (immunisées) ou vaccinées par PBS (simulées). CageID (fèces regroupées) et les échantillons individuels pour chaque cage (contenu intestinal) sont rapportés sur l'axe des x. Biplot PCoA basé sur les première et deuxième composantes (distances Bray-Curtis au niveau du genre) de (b) échantillons fécaux provenant de cages (c) et de coupes intestinales (intestin grêle, caecum et gros intestin). Les biplots rapportent les genres avec les 5 principaux effets sur la composition de la communauté, la position du vecteur indiquant la direction de l'effet. Des ellipses arbitraires ont été dessinées pour faciliter l'interprétation de la figure. Les valeurs r au carré et p de PERMANOVA sont indiquées. d Diversité alpha basée sur l'indice d'entropie de Shannon (niveau ASV) d'échantillons fécaux individuels obtenus au dernier point de l'étude à partir de l'intestin grêle, du caecum et du gros intestin. Les boîtes à moustaches sont colorées par le groupe expérimental. Les valeurs médianes et les intervalles interquartiles sont présentés dans des boîtes à moustaches. Les valeurs de p des tests de rang signé de Wilcoxon sont rapportées.

L'analyse discriminante longitudinale a montré que l'abondance de bactéries spécifiques a changé après la vaccination. Alors que seul le genre A2 était différentiellement abondant entre les groupes expérimentaux au départ (Fig. 5a supplémentaire), le groupe Immunisé a montré un enrichissement dans un ensemble de genres Clostridiales après la vaccination (Fig. 3). L'observation la plus remarquable était un enrichissement en Ruminococcus dans les échantillons fécaux des cages (semaine 3 à 15) et Roseburia dans les coupes intestinales (caecum et gros intestin), tandis que le groupe Eubacterium xylanophilum est resté systématiquement plus élevé dans les échantillons fécaux des cages et des coupes intestinales après la semaine 3. De plus, Ligilactobacillus a augmenté spécifiquement dans les échantillons de l'intestin grêle (Fig. 3). L'évaluation longitudinale de l'abondance de ces genres a indiqué une tendance à la hausse à partir de la vaccination dans le groupe immunisé (Fig. 7 supplémentaire). À l'inverse, aucun genre spécifique n'était systématiquement plus élevé dans le groupe Mock au fil du temps.

Analyse LEfSe comparant l'abondance relative des genres bactériens entre les groupes immunisés et simulés pendant l'administration du vaccin (échantillons fécaux regroupés à 3 semaines, 9 semaines, 6 semaines et 15 semaines) et à la fin de l'étude à la semaine 15 pour des échantillons fécaux individuels de l'intestin grêle, du caecum et du gros intestin. Les barres horizontales représentent la taille de l'effet pour chaque genre discriminant (p < 0,05 et scores LDA > 2,0). La longueur de la barre représente le score LDA transformé en log10, indiqué par des lignes verticales.

Pour examiner l'immunogénicité HTI, un test IFNγ évaluant l'ampleur et l'ampleur de la réponse spécifique des lymphocytes T contre les peptides HTI a été effectué dans des splénocytes collectés au dernier moment de l'étude. Aucune différence dans les splénocytes producteurs d'IFNγ de fond n'a été trouvée entre les souris simulées et immunisées, ce qui indique que le schéma de vaccination n'a pas induit d'activation notable des cellules T non spécifiques (Fig. 8a supplémentaire). Après re-stimulation spécifique avec des pools de peptides couvrant la séquence HTI, le groupe Mock n'a montré aucune réponse IFNγ au-dessus des seuils. En revanche, les souris immunisées ont montré de fortes réponses, à la fois en amplitude (médiane = 1560 IFN-γ SFC/million de splénocytes, p = 0,00031, Fig. 8b supplémentaire) et en largeur (médiane = 8,0 sur 17 pools positifs, p = 0,00028, Fig. 8c supplémentaire) par rapport à Mock.

Après avoir évalué les taux sériques de 22 cytokines dans les groupes simulés et immunisés (Fig. 9a supplémentaire), l'IL-6 était la seule cytokine montrant une tendance à la hausse dans le groupe immunisé après séparation par sexe (p = 0,052) (Fig. 9b supplémentaire), bien que la signification n'ait pas passé la correction des tests multiples (p ajusté à la BH = 0,69). Plus précisément, les femmes du groupe immunisé présentaient des taux d'IL-6 inférieurs à ceux des hommes des groupes immunisé et simulé (Fig. 9b supplémentaire). Nous avons ensuite examiné les liens potentiels entre les réponses spécifiques au HTI, les niveaux de cytokines sériques et les genres bactériens discriminants. Le groupe Eubacterium xylanophilum et Roseburia des trois sections intestinales étaient positivement corrélés à la réponse des lymphocytes T spécifiques au HTI induite par le vaccin (Fig. 4), mesurée en amplitude et en ampleur. De plus, la plupart des cytokines testées ont montré des corrélations positives avec le groupe Eubacterium xylanophilum, Roseburia et Ruminococcus, bien qu'il y ait eu quelques exceptions (c.-à-d. IL-33). Une tendance opposée a été observée pour Ligilactobacillus, qui a globalement montré des associations négatives avec les niveaux de cytokines sériques (Fig. 4). Il convient de noter que l'IL-6 était positivement associée au groupe Eubacterium xylanophilum, Ruminococcus et en particulier Roseburia dans le gros intestin. De plus, Roseburia a montré des corrélations positives avec d'autres cytokines, notamment GM-CSF, IL-2, IFNγ, IL-17A et IL-25 (intestin grêle), IL-27 (caecum et gros intestin) et IL-22 (gros intestin). Des corrélations significatives ont été confirmées par des diagrammes de dispersion individuels (Fig. 10 supplémentaire). De plus, le groupe Eubacterium xylanophilum, Roseburia et Ruminococcus des trois compartiments intestinaux se sont regroupés à proximité des réponses spécifiques au HTI (ampleur et ampleur) dans un regroupement hiérarchique, affichant également des associations positives avec un groupe de cytokines (Fig. 11 supplémentaire).

Corrélations de Spearman entre les genres bactériens (seules les bactéries enrichies longitudinalement chez les souris immunisées contre le HTI ont été évaluées), l'immunogénicité du HTI (ampleur et ampleur de la réponse) et les niveaux de cytokines sériques. Les associations sont évaluées pour chaque section de l'intestin (intestin grêle, caecum et gros intestin). Les cytokines pour chaque section intestinale sont ordonnées en fonction d'un regroupement hiérarchique non supervisé. La couleur et la taille du carré représentent l'ampleur de la corrélation. La signification est indiquée par des astérisques blancs (*p < 0,05 ; **p < 0,01 ; ***p < 0,001 après ajustement de Benjamini-Hochberg pour les comparaisons multiples).

À ce jour, des études limitées ont étudié comment l'administration de vaccins peut modifier les communautés microbiennes intestinales résidentes. Ici, nous avons utilisé un schéma prime-boost combinant l'insert HTI dans différents vecteurs vaccinaux, pour induire de fortes réponses spécifiques au HTI et étudier leur impact sur le microbiote. Ces résultats ont montré, chez la souris, une augmentation des bactéries Clostridiales suite à l'immunisation des lymphocytes T du VIH, qui à leur tour s'associent à des cytokines pro-inflammatoires. À l'exception du groupe Eubacterium xylanophilum, les genres de Clostridiales trouvés dans les matières fécales étaient différents de ceux des trois sections intestinales du groupe Immunisé. Ces différences pourraient être liées à la présence d'espèces distinctes dans l'épithélium intestinal par rapport à la lumière24 et à la présence de 50 à 60 % de bactéries formant des spores, comme les Ruminococcaceae et les Lachnospiraceae, les plus susceptibles d'être présentes dans les matières fécales25. Remarquablement, les associations entre les bactéries enrichies et les cytokines sériques variaient dans les trois sections intestinales, étant représentatives des besoins en oxygène distincts et d'une diaphonie différente entre les cellules muqueuses et les communautés microbiennes coexistantes26. La différence la plus importante a été observée dans l'intestin grêle, qui était appauvri en bactéries anaérobies obligatoires, telles que Ruminococcacae et Lachnospiraceae, par rapport au caecum et au gros intestin, comme indiqué précédemment27.

À l'appui de nos résultats, une étude récente chez des macaques rhésus a montré que la vaccination avec trois vaccins plasmidiques à ADN exprimant Env du VIH-1 suivis d'un rappel de la protéine gp140 induisait des changements dans le microbiote rectal, entraînant une augmentation du rapport Firmicutes/Bacteroidetes ainsi que des associations de réponses vaccinales IgG anti-VIH-1 rectales avec une augmentation de Clostridium IV et une réduction de Prevotella17. Un enrichissement en Ruminococcus du microbiote intestinal des porcelets a également été rapporté après immunisation avec le vaccin Lawsonia intracellularis28. En parallèle, une augmentation de l'abondance des Bacteroides ainsi que des altérations de la structure de la communauté microbienne ont été observées après l'administration du vaccin Mtb (avec ESAT6 adjuvanté avec des agonistes du TLR8) chez la souris29. De même, un enrichissement en Bacteroides caccae et une diminution des espèces clostridiennes, telles que Coprococcus comes, Dorea longicatena et Ruminococcus obeum ont été rapportés chez les vaccinés Covid-1918. Ces tendances apparemment conflictuelles indiquent qu'une compréhension plus approfondie est nécessaire pour déchiffrer les changements microbiens spécifiques induits par des stratégies de vaccination distinctes.

Nos données ont indiqué que les bactéries ont augmenté après la vaccination HTI (groupe Eubacterium xylanophilum, Roseburia et Ruminococcus), situées dans les trois sections distinctes de l'intestin, positivement corrélées à la réponse des lymphocytes T spécifiques au HTI et à un groupe de cytokines sériques. Plus précisément, le genre Roseburia, connu sous le nom de bactérie productrice de butyrate30, dans le caecum et le gros intestin, était positivement corrélé à l'ampleur et à l'étendue de la réponse des lymphocytes T spécifiques au HTI dans les cellules de la rate. Au niveau sérique, Roseburia était en corrélation avec l'IL-27, qui est produite par les cellules présentatrices d'antigène et régule les cellules B et T31. Fait intéressant, malgré sa fonction effectrice différente, l'IL-27 partage la sous-unité du récepteur gp130 avec l'IL-632 et les cytokines et l'IL-22 étaient associées au contenu de Roseburia dans le gros intestin. Bien que les niveaux de Roseburia dans l'intestin grêle ne soient pas corrélés avec les réponses des lymphocytes T spécifiques au HTI, de fortes corrélations ont été observées avec les cytokines inflammatoires (IL-6, GM-CSF), deux cytokines de polarisation Th1 (IFNγ et IL-2) et les cytokines de polarisation Th17 (IL-17A et IL-22). Cependant, aucune de ces cytokines n'a été produite de manière différentielle entre le groupe simulé et le groupe immunisé et seule l'IL-6 a montré une signification marginale, qui n'a pas réussi la correction de comparaison multiple. Nous émettons l'hypothèse que l'abondance de Roseburia peut augmenter en raison de la stimulation par le vaccin des lymphocytes T et être liée aux réponses Th1, comme indiqué par une corrélation positive avec l'IFNγ et l'IL-2 dans le plasma, mais surtout avec les réponses des lymphocytes T spécifiques à l'HTI dans les cellules spléniques. L'augmentation de Roseburia peut également être liée à la présence de médiateurs de l'inflammation tels que l'IL-633, probablement produits après la vaccination et les cytokines Th17 (IL-17A et IL-22) dans le sérum, qui pourraient affecter les réponses immunitaires muqueuses dans l'intestin. D'autres genres de Clostridiales producteurs de butyrate34 enrichis chez des animaux vaccinés ont montré des corrélations positives avec les réponses des lymphocytes T spécifiques au HTI (groupe Eubacterium xylanophilum dans l'intestin grêle et le caecum) et les taux sériques d'IL-6 (groupe Ruminococcus et Eubacterium xylanophilum dans le gros intestin). De plus, bien que Ligilactibacillus ne soit pas associé aux réponses des lymphocytes T, les corrélations avec les cytokines représentatives des populations Th17 et Treg (IL-10 et IL17A), connues sous le nom de biomarqueurs de l'inflammation intestinale35, pourraient indiquer des changements spécifiques dans la composition du microbiote. Alors que le mécanisme exact par lequel l'immunisation HTI induirait des changements dans le milieu intestinal et favoriserait une augmentation de bactéries spécifiques reste incertain, la signalisation des cytokines après l'immunité innée et l'activation des lymphocytes T par la vaccination est une hypothèse plausible. En fait, l'administration intramusculaire du vaccin peut induire un effet « dépôt » local. Celle-ci consiste en une libération prolongée d'antigènes au site d'injection, qui induit une stimulation persistante du système immunitaire et le recrutement de macrophages qui, à leur tour, déclenchent l'activation de médiateurs inflammatoires36. Il convient de noter que l'administration de vecteurs vaccinaux viraux riches en modèles moléculaires associés aux pathogènes (PAMP), tels qu'utilisés dans cette étude, peut également déclencher l'activation des récepteurs de reconnaissance des pathogènes (PRR), stimulant la production de cytokines pro-inflammatoires, telles que l'IL-1 et le TNF-α par les cellules dendritiques et les macrophages37. Les médiateurs de l'inflammation peuvent alors migrer à travers la circulation sanguine et les vaisseaux lymphatiques pour atteindre les tissus intestinaux et favoriser des changements locaux dans la réponse immunitaire et, à leur tour, modifier la structure du microbiote associé38. De plus, les cellules immunitaires, telles que les cellules dendritiques ou les cellules T régulatrices, activées au site de l'infection, peuvent médier la signalisation inflammatoire vers les ganglions lymphatiques, y compris les ganglions lymphatiques mésentériques ou les plaques de Peyer39.

Notamment, les bactéries corrélées aux cytokines pro-inflammatoires (telles que IL-6, IL-27 et IFNγ) dans notre étude (Roseburia, Ruminococcus et Eubacterium) sont connues comme les principaux contributeurs de métabolites anti-inflammatoires, principalement des acides gras à chaîne courte (AGCC), dans l'intestin40. Cette découverte peut sembler incompatible avec les preuves antérieures, comme dans les maladies inflammatoires de l'intestin, dans lesquelles les AGCC inhibent la production de cytokines pro-inflammatoires41 ; bien que plusieurs mécanismes par lesquels les bactéries commensales peuvent s'adapter à l'environnement intestinal enflammé ont été discutés ailleurs42. Par exemple, des composants spécifiques du microbiote intestinal ont été impliqués dans la production de cytokines pléiotropes par les cellules immunitaires innées, telles que l'IL-6, et l'expansion ultérieure des cellules Th1743, qui sont essentielles pour les réponses immunitaires mémoire induites par le vaccin44. De plus, la flagelline et les peptidoglycanes produits par les bactéries intestinales, telles que Ruminococcus spp.45, peuvent être détectés par les récepteurs de reconnaissance de formes (PRR) exprimés par les lymphocytes T et les lymphocytes B et agissent comme des adjuvants naturels des vaccins7. En fait, une plus grande abondance de bactéries avec des flagelles et des fimbriae, y compris des bactéries productrices de butyrate telles que Roseburia et Eubacterium, peut renforcer l'immunogénicité des vaccins en servant d'adjuvants par le biais d'agonistes TLR immunomodulateurs46.

Notamment, les membres de ces groupes bactériens, tels que Roseburia intestinalis et Eubacterium hallii, ont été répertoriés comme candidats probiotiques par l'International Scientific Association for Probiotics and Prebiotics47. En effet, il a été démontré que certaines bactéries productrices de butyrate, y compris celles identifiées dans cette étude, modulent le métabolome luminal du côlon, régulent les réponses des lymphocytes T et améliorent les fonctions de régulation des lymphocytes T48. Ensemble, ces données ont suscité l'hypothèse que les bactéries produisant des molécules anti-inflammatoires pourraient s'adapter à une inflammation locale accrue après la vaccination, coloniser le milieu intestinal et s'y développer, modulant et éteignant ainsi les processus inflammatoires. Cependant, des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comprendre comment l'inflammation induite par le vaccin favorise une augmentation des bactéries anti-inflammatoires dans l'intestin. Dans ce contexte, l'équilibre des cellules Th17/Treg, les profils de polarisation et d'activation des lymphocytes T, les réponses ILC et le rapport Kyn/Trp49 dans les tissus intestinaux sont des candidats prometteurs pour de futures validations. De plus, des approches omiques supplémentaires, y compris des mesures de métabolites et de SCFA ciblés, aideraient à identifier les voies anti-inflammatoires potentielles induites après la vaccination HTI. Nous reconnaissons pleinement la limitation de la petite taille de l'échantillon et le manque de contribution au niveau individuel dans cette étude. De plus, l'absence de mesure longitudinale des cytokines ne nous a pas permis d'identifier les variations temporelles des corrélats immunitaires avec des signatures bactériennes spécifiques à chaque étape du schéma vaccinal. Bien qu'un groupe de bactéries ait montré de fortes corrélations avec les réponses des lymphocytes T spécifiques au HTI, une autre limitation était que la conception expérimentale ne permettait pas de différencier dans quelle mesure les modifications du microbiote induites par le vaccin étaient dues à un effet adjuvant des vecteurs ou à des réponses spécifiques à l'insert. De futures expériences comprenant un bras témoin utilisant des vecteurs vides aideront à discriminer la contribution directe de l'insert vaccinal sur les modifications du microbiote intestinal. De plus, une autre limitation intrinsèque était l'incapacité du séquençage du gène de l'ARNr 16S à distinguer les organismes vivants de la colonisation transitoire par des micro-organismes50. Enfin, la spécificité de l'hôte du microbiote intestinal central peut limiter l'extrapolation potentielle de ces résultats d'un modèle de souris à l'homme. Ainsi, des essais cliniques comprenant la caractérisation du microbiote sont nécessaires pour valider ces résultats dans le microbiote intestinal humain.

En résumé, nos données suggèrent que les bactéries intestinales peuvent s'adapter à l'inflammation induite par le vaccin. En outre, ils établissent un cadre pour les études futures afin de saisir pleinement la dynamique des changements microbiens vers la vaccination par les lymphocytes T et, finalement, de fournir de nouvelles cibles potentielles pour optimiser l'efficacité du vaccin.

Des souris C57BL/6JOlaHsd âgées de six semaines (n = 40, 20 femelles et 20 mâles), cultivées dans le même établissement d'élevage, ont été achetées chez Envigo et hébergées dans des conditions spécifiques sans pathogène (SPF) au Center for Comparative Medicine and Bioimage (CMCiB) animalerie de l'IGTP à Badalona, ​​en Espagne. Les souris ont été réparties au hasard dans des cages en fonction d'une combinaison de sexe (femelle/mâle) et de groupe de traitement (simulé/immunisé), avec un maximum de 5 animaux par cage (Fig. 1 supplémentaire) et autorisées à s'acclimater pendant une semaine avant le traitement initial.

Pour réduire les différences de base potentielles dans la composition du microbiote, le microbiote intestinal des souris a été homogénéisé par conditionnement antibiotique suivi d'une FMT de souris à souris (1 semaine après l'arrivée et 2 semaines avant la vaccination). Le traitement antibiotique consistait en une combinaison d'ampicilline, d'amikacine, de métronidazole et de vancomycine (10 mg/ml de chaque antibiotique), administrée par gavage oral (200 µl/animal) pendant 5 jours avant la FMT. Des selles mixtes de cinq souris donneuses mâles et cinq femelles (cages MF1 et MM1, Fig. 1 supplémentaire) ont été utilisées pour la FMT chez tous les animaux de l'étude. En bref, les matières fécales des donneurs ont été collectées, regroupées, aliquotées (flacons de 350 mg) et conservées à -80 ° C jusqu'à leur utilisation. Le jour du transfert fécal, les fèces décongelées ont été remises en suspension dans du sérum physiologique stérile (2,3 ml par flacon), homogénéisées, centrifugées (500 × g, 1 min) et le surnageant administré par gavage oral (100 µl/animal). La charge bactérienne dans le FMT a été mesurée à l'aide du kit de viabilité et de comptage bactériens LIVE/DEAD® BacLight™ (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA).

Les animaux ont été vaccinés avec l'immunogène des cellules T du VIH (HTI), une protéine synthétique conçue comme la fusion de différents fragments de protéines du VIH-1 associés au contrôle par les cellules T de l'infection par le VIH20. En bref, la séquence HTI code pour un immunogène de 529 acides aminés, conçu comme la concaténation de fragments de protéines Gag, Pol, Vif et Nef consensus du VIH de 16 clade B, qui étaient préférentiellement ciblés par les personnes montrant un contrôle naturel de l'infection par le VIH, liés par des triplets d'alanine. La séquence d'acides aminés a été rétro-traduite en nucléotides, l'utilisation des codons a été optimisée pour l'expression chez l'homme et le cadre de lecture ouvert (ORF) résultant a été synthétisé pour être inséré dans différents vecteurs22. Plus précisément, il a été inséré dans un ADN plasmidique sous le contrôle d'un promoteur CMV (DNA.HTI, D) et dans deux vecteurs viraux : Chimpanzee Adenovirus Ox1 (ChAdOx1.HTI, C) et Modified Vaccinia Ankara (MVA.HTI, M)22. L'immunogénicité du vaccin HTI a déjà été testée sur un modèle murin C57BL/6 et sur des primates non humains22 ainsi que sur des humains23. Dans cette étude, vingt souris (10 femelles et 10 mâles) ont été immunisées par voie intramusculaire (muscle caudal de la cuisse) avec un régime de rappel hétérologue composé de trois vecteurs vaccinaux différents exprimant le HTI : (i) trois amorces DNA.HTI (100 μg/animal), (ii) un rappel avec ChAd.HTI (1 × 109 VP/animal) et (iii) un deuxième rappel avec MVA.HTI (1 × 106 pfu/ animale). Les vaccinations DNA.HTI ont été administrées aux semaines 0, 3 et 6, suivies de ChAd.HTI et MVA.HTI, séparées par un intervalle de 6 semaines (semaines 9 et 15, respectivement) (Fig. 1 et Fig. 1 supplémentaire). Les souris du groupe factice (n = 20, 10 femelles et 10 mâles) ont été vaccinées avec du PBS comme groupe témoin, suivant le même schéma d'immunisation.

Les données sur le microbiote ont été générées en deux lots (échantillons extraits et séquencés en 2019 et 2020), comme illustré dans les Figs supplémentaires. 1 et 2. Le premier lot de séquençage comprenait des échantillons fécaux regroupés collectés longitudinalement dans des cages, tandis que le deuxième lot comprenait des pools longitudinaux de matières fécales provenant de cages et des échantillons fécaux individuels obtenus à partir de différentes sections du tractus intestinal au dernier moment de l'étude. Des échantillons fécaux longitudinaux ont été prélevés (un pool par cage, n = 5) à l'arrivée des animaux (semaine 3), après conditionnement antibiotique avant FMT (semaine 2) et avant chaque vaccination (semaines 0, 3, 6, 9 et 15). Un échantillon fécal de pool de donneurs (semaine 1) a également été prélevé et séquencé dans le lot 1. Trois semaines après la dernière immunisation (semaine 18), les souris ont été euthanasiées et le contenu luminal de trois sections intestinales (petit, caecum et gros intestin), le sang total et la rate ont été récoltés. Le sérum a été séparé du sang total par centrifugation (10 000 × g, 5 min) dans des tubes Serum Gel S/1.1 (Sarstedt) et congelé à -80 °C jusqu'à utilisation. Les splénocytes ont été isolés par rupture mécanique et pressés à travers un tamis cellulaire (Falcon) en utilisant un piston en caoutchouc de seringue de 5 ml. Après la lyse des globules rouges, les splénocytes ont été lavés, remis en suspension dans du R10 (RPMI 1640 additionné de 10 % de sérum bovin fœtal, 2 mM de L-glutamine, 100 U/ml de pénicilline et 100 µg/ml de streptomycine) et cryoconservés dans du N2 liquide jusqu'à utilisation.

L'ADN génomique des échantillons fécaux et du contenu intestinal a été extrait à l'aide du kit QIAamp DNA Stool, conformément aux instructions du fabricant, et stocké à -80 ° C jusqu'au séquençage. L'amplification de la région hypervariable V3–V4 du gène de l'ARNr 16S a été réalisée à l'aide d'amorces universelles flanquées d'adaptateurs directs et inverses standard (16S_F 5′-TCG TCG TCG GCA GCG TCA GAT GTG TAT AAG AGA CAG CCT ACG GGN GGC WGC AG-3′; 16S_R 5′-GTC TCG TGG GCT CGG AGA TGT GTA T AA GAG ACA GGA CTA CHV GGG TAT CTA ATC C-3′) décrit dans le protocole de séquençage d'amplicon d'ARNr Illumina MiSeq (San Diego, Californie, États-Unis). La PCR a été réalisée dans un volume de réaction de 25 μL, contenant 2,5 μL de matrice d'ADN, 12,5 μL de KAPA HiFi HotStart Ready Mix (KAPA HiFi HotStart DNA Polymerase, tampon, MgCl2 et dNTP, KAPA Biosystems Inc., Wilmington, MA, USA) et 5 μL de chaque amorce à 1 μM. Les conditions de thermocyclage étaient les suivantes : étape de dénaturation initiale à 95 °C pendant 3 min, suivie de 30 cycles de dénaturation à 95 °C pendant 30 s, recuit à 55 °C pendant 30 s, extension à 72 °C pendant 30 s et une étape finale d'extension à 72 °C pendant 10 min. Une fois que la taille d'amplicon attendue a été confirmée sur une électrophorèse sur gel d'agarose à 1, 0% (~ 460 paires de bases), les produits de PCR ont été stockés à -30 ° C jusqu'à la préparation de la bibliothèque de séquençage. Des contrôles négatifs d'extraction et de PCR (contrôles à blanc utilisant de l'eau sans ADN comme matrice) ont été chargés pour évaluer la contamination potentielle et traités dans les mêmes conditions que tout autre échantillon. Les matrices d'ADN amplifiées ont été nettoyées avec le réactif AMPure XP (Beckman Coulter Life Sciences, Indianapolis, États-Unis) pour les molécules non ADN et les adaptateurs de séquençage Illumina et les doubles indices ont été attachés à l'aide du kit d'index Nextera XT (Illumina Inc.), suivi d'un programme d'amplification PCR correspondant tel que décrit dans le protocole de séquençage d'amplicon d'ARNr MiSeq 16 S (Illumina Inc., San Diego, CA, États-Unis). Après le deuxième cycle de nettoyage, les bibliothèques d'amplicons ont été quantifiées à l'aide d'un kit de test d'ADNdb Quant-iTTM PicoGreen® (Invitrogen, Carlsbad, MA, USA) et diluées à des concentrations équimolaires (4 nM) pour un regroupement supplémentaire. Les bibliothèques regroupées ont été séquencées sur une plate-forme Illumina MiSeqTM (Illumina Inc., San Diego, Californie, États-Unis) au centre de génomique du campus de recherche Germans Trias i Pujol (Badalona, ​​Espagne) à l'aide d'un protocole de longueur de 300 bases appariées.

La qualité des données de séquençage brutes a été estimée à l'aide de FastQC51 et l'analyse des séquences d'ARNr 16 S réalisée à l'aide du pipeline DADA2 (v1.10.1)52. Le pipeline a été exécuté selon les paramètres par défaut en utilisant maxEE = 4.10 dans l'étape de filtrage. Après la suppression des lectures chimériques, des variants de séquence d'amplicon uniques (ASV) ont été assignés à une taxonomie et alignés sur la base de données des gènes ARNr SILVA53. Des analyses en aval ont été menées dans l'environnement R (v3.5.2)54 à l'aide de plusieurs packages, notamment phyloseq (v1.26.1)55, vegan (v2.5-5)56 ade4 (v1.7-13)57 et ggplot2 (v3.2.0)58. Les comptages d'ASV ont été normalisés et transformés en abondance relative à l'aide de la fonction phyloseq transform_sample_counts (100 × (x/sum(x))). La diversité alpha (indice d'entropie de Shannon) a été évaluée à l'aide de l'estimation_richesse sur les comptages d'ASV raréfiés. La diversité bêta a été calculée sur la base des distances Bray-Curtis (données normalisées) et de la matrice de distance utilisée pour effectuer une analyse des coordonnées principales d'ordination (PCoA).

Les tests ELISPOT ont été effectués à l'aide du kit ELISPOT IFNγ de souris (ALP) (Mabtech AB, Stockholm, SE), en suivant les instructions du fabricant avec des modifications mineures. En bref, les splénocytes ont été décongelés, lavés, comptés (NucleoCounter® NC-3000, Chemometec), la densité cellulaire ajustée avec R10 à 4 × 105 cellules/puits et étalées dans des plaques de polyvinylidène à 96 puits (Millipore Corp., Bedford, MA), préalablement revêtues d'anticorps de capture IFNγ (clone AN-18). Les cellules ont été stimulées avec 17 pools de peptides spécifiques au HTI (concentration finale de 14 μg/ml pour chaque peptide) pendant 16 h à 37 °C dans 5 % de CO2. Un ensemble de 147 peptides chevauchants (OLP) de 15 acides aminés de long, se chevauchant de 11 acides aminés et couvrant toute la séquence HTI, a été conçu à l'aide de l'algorithme PeptGen (base de données Los Alamos HIV) et synthétisé (Synepeptide). Pour évaluer les réponses au HTI, les OLP ont été assemblés en 17 pools de peptides séparés composés de 7 pools pour Gag (8-11 peptides/pool), 7 pour Pol (11 ou 5 peptides/pool), 2 pour Vif (8 et 6 peptides/pool) et 1 pour Nef (2 peptides/pool). La concanavaline A (Sigma-Aldrich Corp., Saint Louis, MO), à 5 ug/ml, a été utilisée comme témoin positif et R10 en triple comme témoin négatif. Après stimulation, des cellules formant des taches (SFC) ont été révélées en ajoutant un anticorps de détection IFNγ biotinylé (clone R4-6A2), de la streptavidine conjuguée à de la phosphatase alcaline (AP) et un kit de substrat conjugué AP (Bio-Rad Laboratories, Inc., Irvine, CA). Les SFC par puits ont été comptés à l'aide d'un système de lecteur ELISPOT automatisé (CTL Analyzers LLC, Cleveland, OH) avec le logiciel ImmunoSpot et l'amplitude des réponses exprimée en SFC pour 106 splénocytes. Le seuil pour les réponses positives a été défini comme des réponses qui étaient au moins 50 cellules spléniques SFC/106, la moyenne des cellules spléniques SFC/106 dans les puits de contrôle négatif plus 3 écarts-types des puits de contrôle négatif, ou trois fois la moyenne des puits de contrôle négatif, selon la valeur la plus élevée. Les résultats ont été donnés sous forme d'amplitude totale (réponse cumulée à tous les pools ; PBMC SFC/106) et d'étendue (nombre de pools positifs).

Concentrations de ligand CD40 (CD154), GM-CSF, IFN γ, IL-1ß, IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-12 (p70), IL-13, IL-15, IL-17A, IL-17E/IL-25, IL-21, IL-22, IL-23, IL -27, IL-31, IL-33, TNFα, TNFß à la fin de l'étude (semaine 21 wpi) ont été dosés simultanément dans des sérums de souris, en un seul lot. En bref, les échantillons de sérum ont été décongelés, vortexés et centrifugés à 10 000 xg pendant 10 minutes avant de collecter 25 µl de sérum pour des tests supplémentaires. La concentration sérique des 22 cytokines a été mesurée simultanément à l'aide de doubles d'échantillons dans un kit de panneaux de billes magnétiques Th17 de souris personnalisé (Milliplex) et un lecteur Luminex® 200 (Luminex Corp), en suivant les instructions du fabricant.

Les différences de diversité alpha et d'abondance des taxons entre les groupes expérimentaux ont été évaluées à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon et du test de Kruskal-Wallis (bilatéral). Pour la diversité bêta, la signification statistique a été évaluée à l'aide du test d'analyse de variance multivariée par permutation par paires (PERMANOVA, adonis). La taille de l'effet de l'analyse discriminante linéaire (LEfSe)59 a été réalisée pour identifier les signatures bactériennes discriminantes entre les groupes Mock et Immunisé (α = 0,05 et score LDA > 2,0). Les associations entre les cytokines, la réponse immunitaire et les bactéries ont été calculées sur la base des coefficients de corrélation de Spearman en combinaison avec la correction des tests multiples de Benjamini-Hochberg à l'aide de la fonction rcorr dans le package R/hmisc. Les analyses statistiques ont été effectuées dans l'environnement R et le niveau de signification bilatéral de 5 % (valeur de p ≤ 0,05) a été considéré comme significatif, sauf indication contraire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les lectures brutes de séquençage de l'ARNr 16 S utilisées dans cette étude ont été déposées au référentiel Sequence Read Archive (SRA) (Bioproject No. PRJEB52963).

Les scripts d'analyse R et les données associées à cet article sont disponibles sur https://doi.org/10.5281/zenodo.7017193.

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Le projet a reçu un financement du programme de recherche et d'innovation Horizon 2020 de l'Union européenne dans le cadre de la convention de subvention n° 847943 (MISTRAL) et a été parrainé en partie par Grifols.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Alex Olvera, Roger Paredes.

Institut de recherche sur le sida IrsiCaixa, Badalona, ​​​​Espagne

Alessandra Borgognone, Aleix Elizalde-Torrent, Maria Casadellà, Luis Romero, Tuixent Escribà, Mariona Parera, Francesc Català-Moll, Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Université autonome de Barcelone (UAB), Barcelone, Catalogne, Espagne

Luis Romero et Roger Paredes

Université de Vic-Université centrale de Catalogne (UVic-UCC), Vic, Espagne

Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Ciber des maladies infectieuses CIBERINFEC, ISCIII, Madrid, Espagne

Marc Noguera-Julian, Christian Brander, Alex Olvera & Roger Paredes

Institut catalan de recherche et d'études avancées (ICREA), Barcelone, Espagne

chrétien brûleur

AELIX Therapeutics, Barcelone, Espagne

chrétien brûleur

Center for Global Health and Diseases, Department of Pathology, Case Western Reserve University, Cleveland, OH, États-Unis

Roger Paredes

Fondation Fight Against Infections, Hôpital universitaire Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​​​Catalogne, Espagne

Roger Paredes

Département des maladies infectieuses, Hôpital universitaire Germans Trias i Pujol, Badalona, ​​​​Catalogne, Espagne

Roger Paredes

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MN-J., CB, AO et RP ont conçu l'étude et supervisé la recherche. AB a analysé les données et rédigé le manuscrit. AE-T. contribué à l'interprétation des données et à la rédaction du manuscrit. AE-T., MC et AO ont mis en place les expérimentations animales et collecté des échantillons. AE-T., MC et MP ont effectué l'extraction de l'ADN fécal, la préparation de la bibliothèque et le séquençage. LR, TE et AO ont effectué le profilage des cytokines et les déterminations de la réponse immunitaire. FC-M., MN-J. et AB a contribué au traitement, à la gestion et au stockage des données. AB et AE-T. sont co-premiers auteurs du manuscrit. AO et RP sont co-auteurs correspondants du manuscrit. Tous les auteurs ont révisé les brouillons de manière critique, révisé le manuscrit et approuvé la version finale telle que soumise.

Correspondance à Alex Olvera ou Roger Paredes.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Toutes les expériences impliquant des animaux ont été approuvées par le comité d'éthique de l'expérimentation animale de l'hôpital allemand Trias i Pujol (IGTP) et la Generalitat de Catalunya (numéro de projet : 10559).

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Réimpressions et autorisations

Borgognone, A., Elizalde-Torrent, A., Casadellà, M. et al. La vaccination avec un immunogène des lymphocytes T du VIH induit des altérations du microbiote intestinal de la souris. npj Biofilms Microbiomes 8, 104 (2022). https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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Reçu : 25 août 2022

Accepté : 12 décembre 2022

Publié: 30 décembre 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41522-022-00368-y

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