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Oct 18, 2023

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Volume de médecine BMC

BMC Medicine volume 21, Numéro d'article : 161 (2023) Citer cet article

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Détails des métriques

Le taux de réponse objectif des patients atteints d'un cancer colorectal métastatique (mCRC) à instabilité microsatellite élevée (MSI-H) avec une monothérapie de première ligne anti-protéine de mort cellulaire programmée-1 (PD-1) n'est que de 40 à 45 %. Le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) permet une analyse impartiale de toute la variété de cellules constituant le microenvironnement tumoral. Ainsi, nous avons utilisé scRNA-seq pour évaluer les différences entre les composants du microenvironnement entre les groupes résistants à la thérapie et les groupes sensibles à la thérapie dans le mCRC MSI-H/mismatch repair-deficient (dMMR). Les types de cellules et les gènes liés à la résistance identifiés par cette analyse ont ensuite été vérifiés dans des échantillons cliniques et des modèles de souris pour révéler davantage le mécanisme moléculaire de la résistance anti-PD-1 dans le MSI-H ou le dMMR mCRC.

La réponse des lésions primaires et métastatiques à la monothérapie anti-PD-1 de première ligne a été évaluée par radiologie. Les cellules des lésions primaires de patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR ont été analysées à l'aide de scRNA-seq. Pour identifier les gènes marqueurs dans chaque cluster, des clusters de cellules distincts ont été identifiés et soumis à une analyse de sous-cluster. Ensuite, un réseau d'interaction protéine‒protéine a été construit pour identifier les gènes clés. L'immunohistochimie et l'immunofluorescence ont été appliquées pour vérifier les gènes clés et les molécules marqueurs cellulaires dans les échantillons cliniques. L'immunohistochimie, la PCR quantitative en temps réel et le transfert Western ont été réalisés pour examiner l'expression de l'IL-1β et de la MMP9. De plus, une analyse quantitative et un tri des cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et des lymphocytes T CD8 + ont été effectués à l'aide de la cytométrie en flux.

Les réponses tumorales chez 23 patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR ont été évaluées par radiologie. Le taux de réponse objective était de 43,48 % et le taux de contrôle de la maladie était de 69,57 %. L'analyse ScRNA-seq a montré que, par rapport au groupe résistant au traitement, le groupe sensible au traitement a accumulé plus de lymphocytes T CD8+. Des expériences avec des échantillons cliniques et des souris ont indiqué que l'infiltration de MDSC pilotées par IL-1β et l'inactivation des lymphocytes T CD8 + contribuent à la résistance anti-PD-1 dans le CRC MSI-H / dMMR.

Les cellules T CD8 + et l'IL-1β ont été identifiées comme le type de cellule et le gène, respectivement, avec la corrélation la plus élevée avec la résistance anti-PD-1. L'infiltration de MDSC induites par l'IL-1β était un facteur important dans la résistance aux anti-PD-1 dans le CCR. Les antagonistes de l'IL-1β devraient être développés en tant que nouveau traitement de la résistance aux inhibiteurs anti-PD-1.

Rapports d'examen par les pairs

Le cancer colorectal (CCR) est l'une des tumeurs malignes du tube digestif les plus courantes et a le deuxième taux de mortalité le plus élevé et le troisième taux d'incidence le plus élevé parmi toutes les tumeurs malignes [1]. Bien que les stratégies de diagnostic et de traitement du CCR se soient rapidement améliorées ces dernières années, le pronostic est défavorable pour de nombreux patients atteints de CCR. De nombreux patients ne sont diagnostiqués qu'à un stade avancé de la maladie, ce qui constitue un obstacle important à un traitement efficace.

L'expression de protéines liées au déficit de réparation des mésappariements (dMMR) et au statut d'instabilité élevée des microsatellites (MSI-H) a été largement reconnue comme précieuse pour prédire l'efficacité de l'immunothérapie chez les patients atteints de CCR. Par rapport aux thérapies anticancéreuses traditionnelles, l'immunothérapie a amélioré dans une certaine mesure le taux de réponse objective (ORR) du CCRm MSI-H [2, 3]. Cependant, l'ORR des patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR avec une monothérapie anti-protéine de mort cellulaire programmée-1 (PD-1) en première intention n'était que de 43,8 % [4]. Ainsi, plus de la moitié des patients ne bénéficient pas d'une immunothérapie ou d'une chimiothérapie ± thérapie ciblée en raison du phénotype MSI-H [5]. Compte tenu de cela, cette étude vise à explorer le mécanisme de résistance anti-PD-1 chez les patients atteints de CCRm MSI-H.

ScRNA-seq a contribué à une meilleure compréhension du paysage immunitaire chez les patients atteints de MSI-H, ce qui a offert de nouvelles informations sur les mécanismes de l'immunothérapie. Des études antérieures se sont principalement concentrées sur le mécanisme de résistance immunitaire dans le mCRC microsatellite stable (MSS). Plusieurs études ont révélé le mécanisme moléculaire de la thérapie antagoniste CD40 et CD73 au niveau unicellulaire, fournissant une base théorique possible pour leur traitement combiné avec des inhibiteurs de points de contrôle immunitaires pour le CCRm du MSS [6,7,8]. Cependant, le mécanisme de résistance à PD-1 chez les patients atteints de CCRm MSI-H n'est toujours pas clair. Par conséquent, la comparaison du microenvironnement immunitaire entre les groupes résistants aux anti-PD-1 et les groupes sensibles aux anti-PD-1 par scRNA-seq pourrait aider à élucider les mécanismes sous-jacents à la résistance à l'immunothérapie chez les patients atteints de CCRm MSI-H.

Dans la présente étude, des échantillons de tissus ont été prélevés au cours d'une coloscopie dans des groupes sensibles au traitement et résistants au mCRC MSI-H traités avec un bloqueur PD-1 (tislelizumab). Ensuite, nous avons analysé de manière exhaustive les sous-types cellulaires et les gènes clés des deux groupes à l'aide de scRNA-seq. Des expériences de suivi ont été réalisées à l'aide d'échantillons cliniques et de modèles de souris pour vérifier le mécanisme potentiel de résistance anti-PD-1 induit par les types de cellules clés ou les gènes indiqués par scRNA-seq.

23 patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR ont été traités avec une monothérapie anti-PD-1 au Yunnan Cancer Hospital (The Third Affiliated Hospital of Kunming Medical University) entre le 1er août 2020 et le 31 mai 2022. Un bloqueur de PD-1 (200 mg, tislelizumab, Bei Gene Ltd., Chine) a été injecté par voie intraveineuse le 1er jour de chaque cycle de 21 jours. L'efficacité a été évaluée radiologiquement après chaque troisième cycle de traitement. Les patients étaient considérés comme sensibles au traitement anti-PD-1 s'ils montraient une réponse complète (RC) ou une réponse partielle (RP), et les patients étaient considérés comme résistants au traitement anti-PD-1 s'ils avaient une maladie évolutive (PD) ou une maladie stable (SD). Des tissus tumoraux intestinaux frais (2 à 4 mm) ont été prélevés pendant la coloscopie. Des échantillons de tissus provenant d'un total de 23 patients (10 sensibles et 13 résistants) ont été analysés par immunohistochimie (IHC) et immunofluorescence (IF). Six patients (3 PR et 3 PD) ont été sélectionnés au hasard pour scRNA-seq. Tous les participants ont fourni un consentement éclairé écrit avant de commencer l'étude. De plus, le comité d'éthique du Yunnan Cancer Hospital a approuvé tous les protocoles d'étude impliquant des sujets humains conformément aux principes éthiques décrits dans la Déclaration d'Helsinki. Les critères d'inclusion étaient les suivants : adénocarcinome colorectal primitif confirmé par biopsie coloscopie et métastase à distance confirmée par CT/MR ; Statut MSI-H/dMMR confirmé par multiplex qPCR ou IHC ; sous monothérapie anti-PD-1 de première ligne. Les patients étaient exclus si nous n'étions pas en mesure d'obtenir un échantillon par coloscopie en raison de contre-indications ou si nous n'étions pas en mesure d'effectuer un séquençage unicellulaire en raison d'une activité ou d'une quantité insuffisante de cellules.

Siemens (SOMATOM Définition AS +) 128 tomodensitogrammes en spirale ont été utilisés pour la numérisation simple et améliorée. Les patients étaient à jeun et avaient effectué une préparation intestinale comme indiqué. La plage de balayage couvrait toute la cavité abdominale. La couche de balayage avait une épaisseur de 1,0 mm avec un intervalle de 0,6 mm. L'iohexol (300 mg/ml, 100 ml) a été utilisé comme agent de contraste. Le temps de retard du balayage de la phase artérielle était de 35 à 40 s et celui du balayage de la phase veineuse était de 70 à 80 s. L'IRM a été réalisée à l'aide d'un Philips Elision 3.0 T et la séquence de balayage comprenait T1WI_Tse transversal, T2WI_Tse sagittal et coronal, T2WI_Tse haute résolution, imagerie pondérée en diffusion et amélioration dynamique multiphase. Le gadolinium diamine a été utilisé comme agent de contraste. La coloscopie a été réalisée à l'aide de l'Olympus CV-290 et les tissus ont été prélevés par des médecins ayant au moins cinq ans d'expérience.

Des tissus tumoraux frais obtenus à partir de patients atteints de CCR ont été immédiatement transférés dans des tubes C MACS (Miltenyi Biotec) avec des enzymes digestives. Ensuite, la digestion a été effectuée par un gentleMACS Octo Dissociator (Miltenyi Biotec) (30 min à 37 ° C). Les cellules individuelles ont été traitées par Chromium Controller (10X Genomics) selon le protocole du fabricant. En bref, les cellules ont été lavées avec 20 ml de RPMI 1640 (Gibco), filtrées à travers une passoire en nylon de 70 μm (BD Falcon), collectées par centrifugation (330 × g, 10 min, 4 ° C) et remises en suspension dans une solution basique contenant 0, 2% de sérum bovin fœtal (FBS; Gibco).

Un système 10 × Chromium (10 × Genomics) et une préparation de bibliothèque par LC Sciences ont été utilisés pour analyser les cellules individuelles selon le protocole recommandé pour le kit de réactifs Chromium Single Cell 30 (v2 Chemistry). L'Illumina HiSeq4000 a été utilisé pour le séquençage et un package 10 × Cell Ranger (v1.2.0 ; 10 × Genomics) a été utilisé pour le post-traitement et le contrôle qualité des bibliothèques.

Toutes les données de séquençage unicellulaire ont été analysées par Cell Ranger V6.1.1. Les résultats sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : tableau S1. Les échantillons de CCR de 3 patients résistants (nommés R1, R2, R3) et de 3 patients sensibles (nommés S1, S2, S3) contenaient un total de 56 092 cellules ; le nombre de gènes détectés dans chaque échantillon variait de 17 564 à 18 093 ; le nombre médian d'identifiants moléculaires uniques cellulaires variait de 3 403 à 6 915 ; et la saturation du séquençage variait de 47 à 63 %. Ces résultats indiquent que, dans l'ensemble, la qualité du séquençage était suffisante pour être utilisée dans une analyse de corrélation ultérieure.

Au total, cette analyse a inclus 56 092 cellules du groupe sensible et du groupe résistant. Le package Seurat en R (version 4.0.5) a été utilisé pour l'analyse et le contrôle qualité [9]. Les cellules de faible qualité (n = 3 071) ont été supprimées si les gènes n'étaient détectés que dans < 3 cellules ou s'il y avait < 200 gènes totaux détectés par les matrices gène-cellule. Ensuite, la méthode de mise à l'échelle globale LogNormalize a été effectuée pour normaliser les valeurs d'expression génique pour les 53 021 cellules restantes. Ensuite, la fonction FindVariableFeatures combinée à la méthode vst dans R studio a été utilisée pour identifier les gènes les plus variables, qui ont été utilisés pour la réduction de la dimensionnalité. Après analyse en composantes principales, 2000 gènes très variables ont été identifiés. Les fonctions Jackstraw et ScoreJackStraw ont été appliquées pour déterminer les composants principaux les plus significatifs. Enfin, un clustering non supervisé basé sur des graphes a été réalisé et visualisé à l'aide d'un graphique non linéaire d'intégration de voisins stochastiques distribués en t (t-SNE), défini par les fonctions FindNeighbors et FindClusters.

Les identités des types de cellules ont été caractérisées à l'aide du package SingleR (V1.6.1) basé sur la base de données Celldex. La fonction FindMarkers du package R Seurat a été utilisée pour répertorier les marqueurs de chaque groupe de cellules avec min.pct = 0,5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0,3 et P < 0,05. Les marqueurs utilisés dans ce pipeline sont répertoriés dans le fichier supplémentaire 2 : tableau S2.

Pour étudier les mécanismes moléculaires impliqués dans chaque sous-type de cellule, le processus biologique (BP), la composition cellulaire (CC) et la fonction moléculaire (MF), l'analyse de l'enrichissement GO et l'analyse de la voie KEGG ont été effectuées à l'aide du package R clusterProfiler (version 3.14.3), avec le seuil de signification réglé sur ajusté (adj.) P < 0,05.

Les 2000 premiers gènes hautement variables ont été criblés à l'aide de la fonction FindVariableFeatures combinée à la méthode vst. La fonction FindMarkers du package R Seurat a été utilisée non seulement pour trouver les gènes marqueurs pour différents sous-types cellulaires (avec des seuils de paramètres de dépistage de min.pct = 0,5, logfc.threshold = 1, min.diff.pct = 0,3, P < 0,05) mais aussi pour identifier les DEG de chaque sous-type cellulaire entre les échantillons anti-PD-1 sensibles et anti-PD-1 résistants (avec le seuil défini sur |avg_log2FC| ≥ 0,5, P ≤ 0,05). Les gènes qui se chevauchent entre les gènes liés au pseudo-temps et les DEG liés à la résistance à PD-1 ont été considérés comme des gènes clés candidats.

Pour révéler les différences de cellules immunitaires dans les groupes sensibles et résistants, le logiciel Monocle (version 2.20.0) [10] a été utilisé pour analyser les trajectoires des échantillons et explorer le processus de différenciation. Tout d'abord, une méthode plus sophistiquée (dpFeature) a été créée sur la base de clusters et de gènes marqueurs de développement personnalisés de Monocle. Les gènes de signature avec un haut degré de dispersion (q < 0,01) ont été identifiés parmi les sous-types cellulaires qui ont été sélectionnés par dpFeature. Ensuite, DDRTree a été appliqué pour la réduction de la dimensionnalité et l'alignement pseudo-temporel des cellules le long de la trajectoire, et enfin, les trajectoires ont été visualisées sous forme de cartes t-SNE 2D. Les gènes liés au pseudo-temps ont été identifiés sur la base de q < 0,05 des gènes de signature mentionnés ci-dessus.

L'outil de recherche pour la récupération des gènes en interaction (STRING ; http://string.embl.de/) a été utilisé pour effectuer une analyse de l'interaction protéine‒protéine (PPI) sur les gènes clés candidats. La base de données STRING peut être utilisée pour évaluer les associations directes (physiques) et indirectes (fonctionnelles) des protéines [11]. Cytoscape 3.6.1 a été utilisé pour établir un modèle de réseau des résultats d'analyse PPI. Sur la base de l'outil en ligne STRING, le réseau PPI des gènes clés candidats a été construit avec un niveau de confiance moyen = 0,4. Les quatre premiers gènes ont été sélectionnés comme gènes clés dans cette étude en fonction de la connectivité (degré) de chaque nœud du réseau PPI.

La lignée cellulaire de cancer colorectal CT26 a été sélectionnée pour cette étude. Le plasmide utilisé pour la transfection cellulaire a été synthétisé par Ono Company. Dix-huit à vingt-quatre heures avant l'infection par le lentivirus, 3 x 105 cellules adhérentes/puits ont été étalées dans des plaques à 6 puits. Le nombre de cellules transfectées avec le lentivirus était d'environ 6 x 105/puits. Lorsque les cellules ont adhéré aux puits et étaient confluentes à 70 %, le milieu de culture d'origine a été remplacé par 2 ml de milieu de culture frais contenant 8 μg/ml de polyzoaire et une quantité appropriée de suspension virale. Les cellules ont ensuite été incubées à 37 ° C pendant 8 h, après quoi le milieu contenant le virus a été remplacé par du milieu frais. Si la transfection était réussie, la protéine fluorescente était visible après 48 à 72 h. Si aucune fluorescence n'était observée, le protocole d'infection était répété. La puromycine a été ajoutée pour dépister la surexpression du lentivirus pendant un mois.

Toutes les expérimentations animales ont été approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Université médicale de Kunming. Dans le processus de fonctionnement expérimental, nous suivons strictement les directives ARRIVE. Tout au long de l'expérience, les chercheurs ne savaient pas à quel groupe seraient affectés les animaux sortis de la cage, les responsables des animaux et les chercheurs réalisant l'expérience ne connaissaient pas la séquence d'affectation, et les chercheurs évaluant, testant ou quantifiant les résultats de l'expérience ne connaissaient pas les moyens d'intervention.

Des souris BALB/c (mâles, âgés de 6 à 8 semaines, 20 à 30 g) ont été achetées auprès de Beijing Sipeifu Biotechnology Co., Ltd. Toutes les souris ont été maintenues dans une salle SPF dans les installations d'hébergement des animaux de l'Université médicale de Kunming avec de la nourriture et de l'eau fournies à volonté. L'expérience a été réalisée après 1 semaine d'alimentation adaptative. Sur la base du degré de liberté (E) de l'analyse de la variance proposée par Mead, nous avons estimé la taille de l'échantillon d'animaux de laboratoire dont nous avons besoin [12]. La taille totale de l'échantillon de souris dans cette étude était de 25, et elles ont été réparties au hasard en 5 groupes avec 5 souris dans chaque groupe. Toutes les souris ont été réparties au hasard en 5 groupes à l'aide d'une méthode d'échantillonnage aléatoire simple, définie comme les groupes OE-NC, OE-IL-1β, OE-IL-1β + Diacerein, OE-IL-1β + Nivolumab et OE-IL-1β + Diacerein + Nivolumab, respectivement. Pour le modèle du groupe témoin (groupe OE-NC), 1 × 106 cellules stabilisées par un vecteur vide dans 100 ul de PBS ont été injectées par voie sous-cutanée dans le flanc des souris. Pour le modèle de traitement, 1 × 106 cellules transfectées de manière stable avec IL-1β surexprimé dans 100 ul de PBS ont été injectées par voie sous-cutanée dans le même site de souris. Lorsque le volume tumoral a atteint 40 mm3 (soit le 7e jour), le groupe OE-IL-1β + Diacerein a commencé l'injection intrapéritonéale (ip) de l'antagoniste de l'IL-1β (Diacerein, 0,07 mg/kg), le groupe OE-IL-1β + Nivolumab a reçu l'injection ip d'anticorps anti-PD-1 (Nivolumab, 2 mg/kg) ; Le groupe OE-IL-1β + Diacerein + Nivolumab a été traité avec une combinaison de diacereine et de Nivolumab par voie intrapéritonéale. Les souris du groupe OE-NC et du groupe OE-IL-1β ont reçu le même volume de PBS. Diacerein et Nivolumab ont été injectés par voie intrapéritonéale tous les 3 jours à partir du 7ème jour d'inoculation des cellules tumorales.

Le poids des souris et le volume de la tumeur ont été mesurés à 0d, 7d, 10d, 12d, 14d et 16d dans chaque groupe, respectivement. Le volume de la tumeur a été calculé comme ½ (Longueur × Largeur2). Au 16ème jour après l'inoculation des cellules tumorales, toutes les souris ont été sacrifiées avec une injection intrapéritonéale de pentobarbital sodique (200 mg/kg). Déterminer la mort des souris en fonction de la disparition du réflexe cornéen et de l'émission des pupilles. Les tissus tumoraux ont été dépouillés et pesés, et une expérience de biologie moléculaire ultérieure a été réalisée. La sélection de 16d comme paramètre expérimental est basée sur les résultats pré-expérimentaux. La sélection de 16d comme paramètre expérimental est basée sur les résultats pré-expérimentaux. Tout au long de l'expérience, la longueur de la tumeur ne doit pas dépasser 20 mm et le poids de la tumeur ne doit pas dépasser 10 % du poids de la souris [13].

L'ARN total a été extrait de la lignée cellulaire cultivée CT26 ou des tissus à l'aide du réactif TRIzol (Ambion) et transcrit en ADNc par le kit de synthèse d'ADNc premier brin SureScript (Servicebio) conformément aux instructions du fabricant. 2xUniversal Blue SYBR Green qPCR Master Mix (Servicebio) et le système de détection de séquence CFX96 (Bio-Rad, Hercules, CA, USA) ont été utilisés pour la qPCR, et les amorces suivantes ont été utilisées : IL-1β (humain), sens : 5'- AATCTCCGACCACCACTACA-3' et sens inverse : 5'-GACAAATCCGCTTTTCCATCT-3' ; MMP9 (humain), sens avant : 5'-ATGAGCTCTGGCAGCCCCTGGTCC-3' et sens inverse : 5'-GGACCAGGGGCTGCCAGAGGGCTCAT-3'; GAPDH (humain), sens avant : 5'-CCCATCACCATCTTCCAGG-3' et sens inverse : 5'-CATCACGCCACAGTTTCCC-3'; IL-1β (souris), sens avant : 5'- CCTATGTCTTGCCCGTGG-3' et sens inverse : 5'- GTGGGTGTGCCGTCTTTC-3'; MMP9 (souris), sens avant : 5'-GTTGTTCCCGTTCATCTTT-3' et sens inverse : 5'-GCCGTCTATGTCGTCTTTAT-3'; GAPDH (souris), sens avant : 5' - CCTTCCGTGTTCCTACCCC-3' et sens inverse : 5'-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3'. GAPDH a été utilisé comme contrôle endogène standardisé et 2−△△CT a été utilisé pour calculer l'expression relative de l'ARNm.

Des échantillons de protéines ont été isolés à partir de tissus ou de cellules à l'aide d'un tampon de lyse RIPA (Servicebio, Wuhan, Chine) contenant 1 % d'inhibiteurs de protéase et de phosphatase (PMSF ; Servicebio). Un kit de dosage des protéines BCA (Biyuntian Biotechnology) a été utilisé pour la quantification des protéines. L'électrophorèse sur gel de dodécylsulfate de sodium‒polyacrylamide a été appliquée pour séparer les protéines de différents poids moléculaires, et les protéines ont été transférées sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (Servicebio). La membrane a été bloquée avec du lait écrémé à 5 % pendant 90 min à température ambiante, puis incubée avec des anticorps primaires (Proteintech ; IL-1β 1 : 1 000 ; MMP9 1 : 1 000 ; β-actine 1 : 25 000) à 4 °C pendant la nuit, suivie d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 2 h à température ambiante.

Des coupes de tissus en paraffine ont été déparaffinées et réhydratées. Ensuite, un tampon de citrate de sodium a été utilisé pour extraire les antigènes à détecter, et la récupération de l'antigène a été complétée par induction thermique. Les tissus sectionnés ont été incubés avec 3 % de H2O2 pendant 15 min pour bloquer l'activité de la peroxydase endogène (IF a procédé sans cette étape), puis bloqués avec du PBS contenant 5 % de sérum bovin fœtal pendant 30 min. Les tissus ont été incubés avec des anticorps primaires pendant une nuit à 4 degrés C, suivis d'une incubation dans l'obscurité avec les anticorps secondaires conjugués à température ambiante pendant encore 2 h. Le DAB a été utilisé comme marqueurs nucléaires pour l'IHC. DAPI (EX : 330-380 nm, Em : 420 nm) a été utilisé pour colorer les noyaux cellulaires (bleu), Alexa Fluor 488 (EX : 495 nm, Em : 519 nm) a été utilisé pour colorer CD11b (vert), Alexa Fluor 555 (EX : 555 nm, Em : 565 nm) a été utilisé pour colorer CD14, CD15 et CD8 (rouge), Alexa Fluor 594 (EX : 590 nm, Em : 617 nm) a été utilisé pour colorer CD33 (orange).

Les polymorphonucléaires (PMN)-MDSC/monocytaires (M)-MDSC ont été colorées avec CD11b-FITC (Biolegend, 101 205, USA), Ly-6G-PE (Biolegend, 127 607, USA) et Ly-6C-APC (Biolegend, 128 016, USA), et les cellules T CD8+ ont été colorées avec CD3-FITC (Biolegen d, 100,203, USA) et CD8-PE (Biolegend, 100,707, USA) selon les instructions du fabricant. Les échantillons ont été analysés sur un cytomètre en flux Guava easyCyte 8HT (Millipore). Le déclenchement par diffusion vers l'avant et sur le côté a été effectué à l'aide de FlowJo_V10.

Les analyses bioinformatiques ont été réalisées à l'aide du logiciel R. L'outil en ligne varElect a été appliqué pour analyser la corrélation entre les gènes du réseau PPI et le CRC. Un score élevé indique une forte corrélation, avec un seuil de signification de P < 0,05 sauf indication contraire. Toutes les données sont présentées sous forme de moyenne ± erreur standard (SE) d'expériences indépendantes. Une analyse de variance unilatérale bilatérale (ANOVA) avec analyse post hoc à comparaison multiple a été utilisée, et les valeurs P < 0,05 (*), P < 0,01 (**), P < 0,001 (***) et P < 0,0001 (****) sont indiquées comme significatives. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism 9.0.

Au total, 23 patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR ont été traités par une monothérapie anti-PD-1 de première intention entre le 1er août 2020 et le 31 mai 2022. La réponse au traitement a été évaluée par examen radiologique tous les 3 cycles d'inhibiteur de PD-1. PR a été enregistré pour sept patients, CR a été enregistré pour trois patients, SD a été enregistré pour six patients et PD a été enregistré pour sept patients. L'ORR était de 43,48 % (10/23) et le taux de contrôle de la maladie (DCR) était de 69,57 % (16/23) (Fig. 1A). Les résultats radiologiques des lésions primaires et métastatiques chez six patients avant et après l'immunothérapie sont visibles sur les figures 1B et C. La figure 1B montre les modifications des lésions primaires et métastatiques chez 3 patients du groupe de résistance (R1, R2 et R3) après traitement anti-PD-1. La longueur des lésions primaires de R1 est passée de 2,1 cm à 3,2 cm, tandis que celle des lésions métastatiques est passée de 1,6 cm à 2,7 cm ; les lésions primaires et métastatiques de R2 sont passées de 0,5 cm à 1,9 cm et de 0,3 cm à 0,8 cm, respectivement ; la longueur des lésions primaires de R3 est passée de 1,5 cm à 1,9 cm et le nombre de lésions métastatiques est passé de 3 à plus de 20. Les réponses de R1, R2 et R3 ont été évaluées comme PD. De même, la Fig. 1C montre l'évolution des lésions primaires et métastatiques chez 3 patients du groupe sensible (S1, S2 et S3) après monothérapie anti-PD-1. La longueur de la tumeur primaire de S1 a diminué de 2,0 cm à 1,5 cm et celle de la tumeur métastatique a diminué de 2,1 cm à 1,2 cm ; les longueurs des lésions primaires et métastatiques de S2 ont diminué de 1,2 cm à 0,7 cm et de 5,3 cm à 4,4 cm, respectivement ; et les longueurs des lésions primaires et métastatiques de S3 ont diminué de 1,3 cm à 0,8 cm et de 2,1 cm à 0,5 cm, respectivement. Les réponses de S1, S2 et S3 ont été évaluées comme PR.

Évaluation de l'efficacité du CCRm MSI-H après monothérapie PD-1 de première ligne. Un organigramme pour le dépistage de 23 patients recevant une monothérapie PD-1 de première ligne. Les images des lésions primaires et métastatiques avant et après l'immunothérapie sont présentées pour (B) trois patients résistants et (C) trois patients sensibles

Un total de six patients (trois PR et trois PD) ont été sélectionnés au hasard pour scRNA-seq. 10 ensembles de données de séquençage d'ARNsc Genomics ont été obtenus à partir de tissus frais de CCR provenant de trois patients résistants (nommés R1, R2, R3) et de trois patients sensibles (nommés S1, S2, S3). Après avoir retiré 3071 cellules de mauvaise qualité, un total de 53 021 cellules ont été utilisées dans l'analyse finale (Fig. 2A); plus précisément, il y avait 7679 cellules de R1, 10 797 cellules de R2, 9020 de R3, 7880 cellules de S1, 9369 cellules de S2 et 8276 cellules de S3. La figure 2B montre les 2000 principaux gènes hautement variants, avec les dix gènes les plus variables marqués. Le PCA des 2000 gènes hautement variables n'a démontré aucune séparation significative dans les cellules CRC entre les groupes résistants et sensibles (Fig. 2C). Vingt composants principaux ont été sélectionnés sur la base d'une analyse de réduction de dimensionnalité linéaire (Fig. 2D). La réduction de dimensionnalité non linéaire des données en fonction de la valeur de dimension 20 combinée à la fonction RunMap a révélé une distribution plus uniforme des cellules dans chaque échantillon (Fig. 2E). Par la suite, ces cellules ont été classées en 23 groupes de cellules en fonction des niveaux d'expression génique par t-SNE, et la distribution de ces taxons cellulaires s'est avérée presque identique dans les groupes sensibles et résistants (Fig. 2F).

Des grappes de cellules dans six échantillons de CRC ont été identifiées par séquençage d'ARNsc. A Nombre de cellules dans différents échantillons. B Affichage des 2000 principaux gènes variants. C PCA des 2000 principaux gènes variants. D Analyse de réduction dimensionnelle linéaire des composantes principales. E Analyse des distributions de cellules par réduction de dimensionnalité non linéaire combinée à la fonction RunMap. F Analyse des distributions de clusters cellulaires dans les groupes sensibles et résistants via t-SNE

À l'aide des packages R SingleR et celldex, 23 groupes de cellules ont été annotés en neuf sous-types de cellules : cellules T CD8 +, cellules épithéliales, cellules B, cellules dendritiques (DC), cellules souches hématopoïétiques, monocytes, fibroblastes, myocytes et cellules endothéliales (Fig. 3A). Combiné avec la figure 2F, l'agrégation des cellules T CD8 + et des monocytes dans le groupe sensible était significativement plus élevée que celle du groupe résistant. Le nombre de cellules de chaque sous-type cellulaire dans chaque échantillon est indiqué dans le fichier supplémentaire 3 : Tableau S3. Un total de 679 gènes marqueurs ont été obtenus pour les neuf sous-types cellulaires (Fichier supplémentaire 2 : Tableau S2) : il y avait 176 marqueurs pour les fibroblastes, 143 marqueurs pour les cellules endothéliales, 131 marqueurs pour les myocytes, 67 marqueurs pour les CD, 65 marqueurs pour les monocytes, 40 marqueurs pour les cellules souches hématopoïétiques, 27 marqueurs pour les cellules épithéliales, 17 marqueurs pour CD8 + lymphocytes T et 13 marqueurs pour les lymphocytes B (Fig. 3B). Le gène supérieur pour chaque sous-type de cellule est illustré à la figure 3C. La carte thermique de ces gènes illustrait que chaque groupe présentait des caractéristiques d'expression génique distinctes (Fig. 3D).

Annotation des sous-types cellulaires et analyse d'enrichissement fonctionnel des gènes marqueurs. A Annotation des sous-types de cellules selon le package R SingleR et celldex. B Nombre de gènes marqueurs pour chaque sous-type cellulaire. C Nuage de points montrant le marqueur de gène supérieur pour chaque sous-type. D Heatmap montrant le meilleur fabricant de gènes pour chaque sous-type

L'analyse GO a montré que ces gènes marqueurs étaient principalement enrichis en processus biologiques liés au système immunitaire tels que la différenciation des lymphocytes et des monocytes et la régulation positive des leucocytes. De plus, ils étaient également associés de manière significative à la "voie de signalisation médiée par les cytokines" (fichier supplémentaire 4 : Figure S1A-C). L'analyse d'enrichissement KEGG (Fichier supplémentaire 4 : Figure S1D) a indiqué que les gènes marqueurs étaient significativement corrélés aux réponses immunitaires/inflammatoires (par exemple, "interaction cytokine - récepteur de cytokine", "voie de signalisation Fc epsilon RI", "voie de signalisation AGE - RAGE", "molécules d'adhésion cellulaire"). Les voies liées au cancer, y compris la "voie de signalisation PI3K-Akt" et les "protéoglycanes dans le cancer", ont également été considérablement enrichies.

Les trajectoires de développement ont été simulées pour les neuf sous-types de cellules et 1623 gènes caractéristiques se sont révélés être exprimés de manière différentielle parmi les sous-populations de cellules (fichier supplémentaire 5 : tableau S4). La figure 4A illustre la dispersion relativement élevée de ces gènes caractéristiques. Les cellules individuelles ont ensuite été classées par ces gènes caractéristiques à l'aide du package R Monocle, et une structure arborescente de l'ensemble du spectre des trajectoires de différenciation a été construite (Fig. 4B). Du point de vue du typage cellulaire, dans l'ensemble, la tendance évolutive temporelle proposée des sous-types cellulaires était une transition progressive des cellules épithéliales aux cellules intermédiaires (par exemple, les fibroblastes, les cellules souches hématopoïétiques, les monocytes, les cellules B) et éventuellement aux cellules T CD8 + (Fig. 4C). Un total de 1 454 gènes liés au pseudo-temps ont été identifiés à partir des 1 623 gènes caractéristiques (P < 0,05 ; Fichier supplémentaire 6 : Tableau S5). L'analyse KEGG (fichier supplémentaire 7 : Figure S2A) a révélé que ces gènes étaient impliqués dans « l'interaction cytokine-récepteur de cytokine », « l'interaction de la protéine virale avec la cytokine et le récepteur de la cytokine » et le « cycle cellulaire » ; ils étaient également inextricablement liés aux voies associées aux tumeurs "voie de signalisation NF-kappa B", "voie de signalisation p53" et "voie de signalisation PPAR". L'analyse GO-BP a révélé que ces gènes liés au pseudo-temps étaient liés à la réponse immunitaire, à la réponse inflammatoire, à la différenciation des cellules immunitaires, à la prolifération, à la migration et à la chimiotaxie (fichier supplémentaire 7 : figure S2B). De plus, ces gènes remplissaient également des fonctions moléculaires telles que "liaison à l'antigène", "liaison au récepteur d'immunoglobuline" et "constituant structurel de la matrice extracellulaire" (fichier supplémentaire 7 : figure S2C) dans des fractions cellulaires telles que "complexe d'immunoglobuline", "face externe de la membrane plasmique" et "complexe d'immunoglobuline, circulant" (fichier supplémentaire 7 : figure S2D).

Construction de trajectoires développementales d'amas cellulaires et identification de gènes clés. A Dispersion relative des gènes caractéristiques. B Construction de l'arborescence du spectre des trajectoires de différenciation. C Tendance évolutive temporelle des sous-types cellulaires. D Identification de gènes communs par analyse de chevauchement. Réseau EA PPI basé sur 130 gènes communs

Pour observer les différences d'expression génique pour chaque sous-type de cellule entre les groupes sensibles et résistants, nous avons effectué une analyse différentielle à l'aide de la fonction FindMarkers du package Seurat. Un total de 155 DEG ont été obtenus ; 97 ont été régulés à la hausse et 98 ont été régulés à la baisse (fichier supplémentaire 8 : tableau S6). L'analyse d'enrichissement fonctionnel a indiqué que ces gènes étaient liés à des réponses immunitaires et inflammatoires. Les DEG du sous-type de lymphocytes T CD8 + étaient principalement impliqués dans la réponse liée à l'IFN et le transport de l'oxygène, tandis que les DEG des sous-types DC et fibroblastes étaient associés à la réponse liée à la chimiokine et à la migration des neutrophiles (Fichier supplémentaire 9 : Figure S3A et B). Les résultats d'enrichissement pour GO-CC et GO-MF sont présentés dans le fichier supplémentaire 9 : Figure S3B et C. L'analyse d'enrichissement KEGG a montré que les DEG des sous-types de cellules B et de monocytes étaient impliqués dans des voies similaires et étaient enrichis dans le traitement et la présentation de l'antigène ; Les DEG des sous-types DC et fibroblastes étaient impliqués dans les voies liées au cancer, y compris la signalisation des chimiokines et de l'IL-17 (fichier supplémentaire 9 : figure S3D).

Grâce à une analyse de chevauchement, 130 gènes communs ont été identifiés parmi 1454 gènes liés au pseudo-temps et 155 gènes (dédupliqués) liés à la résistance à PD-1 (Fig. 4D; Fichier supplémentaire 10: Tableau S7). Un réseau PPI contenant 109 nœuds et 435 arêtes a été dessiné sur la base des 130 gènes communs à l'aide de la base de données STRING (Fig. 4E). L'analyse VarElect des 130 gènes communs a identifié les deux gènes avec la connectivité la plus élevée dans le réseau PPI comme étant IL-1β (score = 17,72) et MMP9 (score = 13,45), indiquant que ces deux gènes sont les plus étroitement associés au CCR (Fichier supplémentaire 11 : Tableau S8 ; Fichier supplémentaire 12 : Figure S4). L'analyse d'enrichissement de la voie KEGG de ces deux gènes clés a montré qu'ils sont impliqués dans l'interaction cytokine‒récepteur de cytokine (IL-1β) et les voies de signalisation MAPK et PI3K-Akt (IL-1β et MMP9). Les cartes des voies de signalisation spécifiques sont présentées dans le fichier supplémentaire 12 : Figure S5.

IL-1β et MMP9 ont été identifiés comme les deux principaux gènes présentant la plus forte corrélation avec la résistance anti-PD-1 via scRNA-seq. Nous avons utilisé l'IHC pour détecter l'expression de l'IL-1β et de la MMP9 dans 10 tissus tumoraux sensibles et 13 résistants de patients MSI-H/dMMR. Le grade IHC de l'IL-1β dans les tissus IL-1β-positifs était significativement plus élevé que celui des tissus tumoraux IL-1β-négatifs (P <0, 001; Fig. 5A). Ensuite, les 23 patients ont été classés en groupes IL-1β-négatifs ou IL-1β-positifs en fonction du grade IHC de l'IL-1β. Sur les 13 tissus de patients résistants, onze tissus présentaient une expression élevée d'IL-1β ; sur les 10 tissus de patients sensibles, un seul tissu présentait une expression élevée (Fig. 5B). Une tendance d'expression similaire a été observée pour un autre gène clé, MMP9 (P <0, 0001; Fig. 5C). L'expression de MMP9 était positivement corrélée à l'expression d'IL-1β (R = 0, 6945, P <0, 0001; Fig. 5D).

Relation entre l'IL-1β et les MDSC ou les lymphocytes T CD8+ chez les patients atteints de CCR MSI-H/dMMR. Une coloration IHC pour IL-1β dans les tissus CRC. B Proportion de tissus IL-1β-positifs et IL-1β-négatifs dans les groupes sensibles et résistants. Coloration C IHC pour MMP9 dans les groupes positifs et négatifs à l'IL-1β. D Corrélation entre MMP9 et IL-1β selon les scores IHC. Examen IF et quantification des PMN-MDSC (E), des M-MDSC (F) et des lymphocytes T CD8+ (G) dans les groupes IL-1β-négatifs et positifs. Analyse de corrélation de Pearson des scores IF entre IL-1β et (H) PMN-MDSC, (I) M-MDSC et (J) CD8.+ Cellules T. ****P < 0,0001

Les MDSC sont des cellules hétérogènes dérivées de la moelle osseuse qui conduisent à l'inactivation des lymphocytes T CD8+ et à la résistance immunitaire. Plusieurs études ont montré que l'IL-1β pourrait jouer un rôle crucial dans l'agrégation et la différenciation des MDSC. Nous avons en outre examiné la relation entre l'expression de l'IL-1β et les MDSC en utilisant IF. L'intensité de fluorescence des fabricants dans les PMN-MDSC et les M-MDSC dans les tissus des patients IL-1β-positifs était significativement plus élevée que celle des patients IL-1β-négatifs (P <0, 0001; Fig. 5E-F). Les cellules T CD8 + ont été identifiées comme l'un des groupes de cellules les plus significativement différents entre le groupe sensible et le groupe résistant par scRNA-seq. Les lymphocytes T CD8+ dans le microenvironnement tumoral (TME) sont essentiels pour les effets antitumoraux de l'immunothérapie. Nous avons utilisé IF pour détecter l'expression du marqueur des lymphocytes T CD8+ dans les tissus et évalué la corrélation entre l'IL-1β et les lymphocytes T CD8+. L'intensité de fluorescence de CD8 dans le tissu positif à l'IL-1β était significativement inférieure à celle du tissu négatif à l'IL-1β (P <0, 0001; Fig. 5G). Il y avait une corrélation significative entre l'IL-1β et les PMN-MDSC (R = 0,8168, P <0,0001; Fig. 5H), les M-MDSC (R = 0,7604, P <0,0001; Fig. 5I) ou les lymphocytes T CD8 + (R = 0,7684, P <0,0001; Fig. 5J).

Pour démontrer davantage l'influence de l'IL-1β sur la résistance à PD-1 dans le cancer colorectal, un modèle de xénogreffe in vivo a été utilisé. Le gène IL-1β humain a été transfecté de manière stable dans des lignées cellulaires CT26 pour augmenter l'expression de l'IL-1β, comme vérifié par qPCR et Western blot (Fichier supplémentaire 12 : Figure S6). Des cellules CT26 témoins surexprimant IL-1β ou non transfectées ont ensuite été injectées par voie sous-cutanée à des souris mâles BALB / c (n = 5 dans chaque groupe; Fig. 6A et B). Après 7 jours d'inoculation des cellules tumorales, une croissance tumorale progressive a été observée. Comme le montre la figure 6C-D, la régulation à la hausse de l'IL-1β a entraîné une augmentation substantielle du volume de la tumeur et il n'y avait pas de différence significative dans le poids des souris entre les cinq groupes. Nous avons traité les trois groupes avec de la diacéréine, du nivolumab ou les deux et avons observé la croissance des tumeurs pour déterminer si l'antagoniste de l'IL-1β coopère avec l'agent immunitaire pour inhiber la croissance des tumeurs. L'élévation induite par l'IL-1β du volume tumoral du CCR (745,74 ± 188,34) et du poids (0,73 ± 0,16) a été fortement atténuée par la diacéréine (619,59 ± 127,03, 0,49 ± 0,09) ou le nivolumab (540,47 ± 90,92, 0,49 ± 0,10, P < 0,05), et le traitement avec les deux médicaments a entraîné la plus grande atténuation de la croissance tumorale (355,49 ± 39,89, 0,32 ± 0,08, P < 0,001). La diacéréine et le nivolumab ont montré des effets synergiques marqués. Les coupes de tumeurs des souris inoculées sont présentées sur la figure 6E.

L'antagoniste de l'IL-1β et l'inhibiteur de PD-1 ont un effet antitumoral synergique. Un diagramme de la chronologie expérimentale. B Tumeurs xénogreffées de souris BALB/c 16 jours après inoculation avec des cellules CT26 contenant un vecteur vide ou un vecteur de surexpression d'IL-1β (n = 5). C Poids de la tumeur (n = 5). D Poids corporel moyen et volume tumoral moyen des souris BALB/c dans chaque groupe de traitement (n = 5). E Coloration à l'hématoxyline-éosine des tumeurs de souris BALB/c inoculées (n = 5). *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001

Pour examiner si l'efficacité du traitement à la diacéréine contre la résistance au nivolumab induite par l'IL-1β était médiée par les MDSC, une cytométrie en flux a été réalisée à l'aide de biomarqueurs pour les PMN-MDSC, les M-MDSC et les lymphocytes T CD8 +. Comme le montre la Fig. 7, l'IL-1β a entraîné une augmentation significative du nombre de PMN-MDSC (17,62 ± 5,56 contre 4,64 ± 0,84, P < 0,0001) et de M-MDSC (5,61 ± 1,35 contre 1,26 ± 0,33, P < 0,0001) dans le TME, a diminué la proportion de lymphocytes T CD8+ (2 0,94 ± 1,17 contre 4,35 ± 1,37, P < 0,01) dans les tissus tumoraux de souris et une immunosuppression accrue. Ensuite, nous avons également évalué si la diacéréine et le nivolumab présentaient des effets synergiques similaires en inversant l'effet médié par l'IL-1β dans les PMN-MDSC, les M-MDSC et les lymphocytes T CD8+. La monothérapie avec la diacéréine ou le nivolumab a supprimé la différenciation des PMN-MDSC (11,15 ± 2,90 vs 17,621 ± 5,561, 12,0 ± 1,88 vs 17,621 ± 5,561, P < 0,01) et des M-MDSC (3,21 ± 0,77 vs 1,26 ± 0,33, 4,09 ± 0,90 vs 1,26 ± 0,33, P < 0,01) et augmenté le nombre de lymphocytes T CD8+ (4,16 ± 0,76 vs 2,94 ± 1,17, 4,81 ± 1,07 vs 2,94 ± 1,17, P < 0,01). Les figures 7B et C suggèrent que par rapport au nivolumab seul, le traitement combiné a réduit de manière significative le nombre de PMN-MDSC (8,79 ± 2,98 contre 12,0 ± 1,89, P < 0,01) et de M-MDSC (2,26 ± 0,72 contre 4,09 ± 0,90, P < 0,001). La figure 7D montre que le degré d'agrégation des lymphocytes T CD8+ dans les groupes de monothérapie avec nivolumab (4,81 ± 1,07 contre 5,695 ± 0,90, P < 0,05) était considérablement réduit par rapport à celui du groupe de thérapie combinée.

L'IL-1β stimule l'agrégation des MDSC et inhibe la prolifération des lymphocytes T CD8+ dans les tumeurs. Une cytométrie en flux a été réalisée pour détecter les PMN-MDSC, les M-MDSC et les lymphocytes T CD8 + (n = 5). Diagramme statistique quantitatif pour l'expression de (B) PMN-MDSC, (C) M-MDSC, (D) CD8. + cellules T dans chaque groupe (n = 5). *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001

En tant que l'un des gènes clés liés à la résistance identifiée par séquençage unicellulaire, MMP9 est considérée comme ayant de fortes fonctions antivasculaires et immunosuppressives. Cependant, la corrélation entre MMP9 et IL-1β reste incertaine. MMP9 a été détecté dans le tissu CRC de souris à l'aide de la qPCR, du Western Blot et de l'IHC. Comme le montre la Fig. 8, le traitement à l'IL-1β a augmenté de manière significative l'expression de MMP9 dans les tissus tumoraux de souris sur la base des résultats de la qPCR (9, 57 ± 0, 26 contre 1, 08 ± 0, 44, P <0, 0001) et du Western blot (1, 13 ± 0, 07 contre 0, 21 ± 0, 04, P <0, 0001). Ensuite, nous avons évalué si la diacéréine pouvait coopérer avec le nivolumab pour réduire l'expression de MMP9. La monothérapie avec la diacéréine (4,21 ± 0,60 contre 9,57 ± 0,26, P < 0,01) ou le nivolumab (6,36 ± 1,10 contre 9,57 ± 0,26, P < 0,01) a atténué la régulation à la hausse induite par l'IL-1β de MMP9 par analyse qPCR. La thérapie combinée a réduit l'expression de MMP9 plus puissamment que la monothérapie avec la diacéréine (1,62 ± 0,59 contre 4,21 ± 0,60, P < 0,0001) ou le nivolumab (1,62 ± 0,59 contre 6,36 ± 1,10, P < 0,0001). L'expression de MMP9 dans le tissu tumoral était presque positivement corrélée à celle de l'IL-1β (la valeur de R2 est représentée sur la figure 8I).

Corrélation entre IL-1β et MMP9 dans le modèle de xénogreffe de souris. qPCR de (A) IL-1β et (B) expression d'ARNm de MMP9 dans chaque groupe de traitement (n = 3). C Analyse Western blot (n = 3). Analyse en niveaux de gris de (D) IL-1β et (E) protéine MMP9 (n = 3). Coloration IHC et scores d'expression (F, G) IL-1β et (H, I) MMP9 (n = 5). (J) Analyse de corrélation de Pearson de l'expression de MMP9 et IL-1β (n = 5). *P < 0,05 ; **P < 0,01 ; ***P < 0,001 ; ****P < 0,0001

Par rapport à la chimiothérapie traditionnelle ou à la thérapie ciblée, l'immunothérapie a un mécanisme moléculaire unique par lequel elle rétrécit les tumeurs. Il est généralement considéré que les inhibiteurs de points de contrôle immunitaires renforcent l'immunité générale de l'organisme en induisant l'activation des lymphocytes T et en "relâchant le frein immunitaire" dans le TME [14, 15]. Dans une étude précédente de notre centre, 29 patients atteints d'un cancer colorectal localement avancé MSI-H/dMMR ont reçu une immunothérapie néoadjuvante avec un inhibiteur de PD-1 en monothérapie, et l'ORR était de 100 % (29/29), conformément aux résultats de l'étude NICHE [16, 17]. Dans la présente étude, 23 patients atteints de CCRm MSI-H/dMMR ont reçu un traitement de première intention par un inhibiteur de PD-1, mais l'ORR n'était que de 43,5 % (10/23). Ces réponses divergentes du CCRm MSI-H à la monothérapie anti-PD-1 sont probablement causées par des différences dans la composition des TME [18, 19, 20].

Dans cette optique, grâce au scRNA-seq, nous avons défini divers sous-types cellulaires, criblé des gènes clés et révélé les voies de signalisation TME qui diffèrent entre les groupes sensibles et résistants au traitement anti-PD-1. Ensemble, les résultats suggèrent que les proportions de sous-ensembles de lymphocytes T CD8+ dans le groupe sensible étaient significativement plus élevées que celles dans le groupe résistant [21,22,23,24]. Plusieurs sous-ensembles de cellules T CD8 + dans le TME peuvent affecter le taux de réponse des nouvelles thérapies ciblant le système immunitaire [21, 22]. Les MDSC sont des cellules hétérogènes dérivées de la moelle osseuse qui favorisent l'angiogenèse et l'immunosuppression [25]. Des études récentes ont montré que la diminution de l'agrégation des MDSC dans le TME peut augmenter de manière significative l'infiltration des lymphocytes T CD8 + et renforcer les effets antitumoraux de l'inhibition de PD-1 [26, 27]. L'effet immunosuppresseur des MDSC pourrait être lié à la sécrétion de diverses cytokines, telles que l'oxyde nitrique synthase inductible, l'arginase 1, l'interleukine-6 ​​et le facteur de croissance transformant-β [28].

Dans cette étude, l'IL-1β s'est classée première en termes de connectivité dans le chevauchement des gènes liés au pseudo-temps et des gènes liés à la résistance à PD-1. Les macrophages dérivés de monocytes sont une source majeure de production d'IL-1β au cours de la réponse immunitaire à une infection pathogène [29, 30]. Des études antérieures ont suggéré que l'IL-1β pourrait favoriser l'invasion et la croissance des cellules cancéreuses du côlon humain [31], et les polymorphismes de l'IL-1β sont associés à la récidive du CCR [32]. Il a été démontré que le blocage de l'IL-1β inverse l'immunosuppression et présente une synergie avec les inhibiteurs de PD-1 pour favoriser l'élimination de plusieurs types de tumeurs, notamment les tumeurs du sein [32], du pancréas [18] et du rein [33]. Néanmoins, le rôle précis de l'IL-1β dans l'immunothérapie du CCR n'a pas encore été élucidé. Plusieurs études ont suggéré que l'IL-1β pouvait induire l'infiltration des MDSC en produisant du facteur de stimulation des colonies de granulocytes, diverses chimiokines CXC et des molécules d'adhésion vasculaire [34]. Cependant, le rôle de l'agrégation de MDSC médiée par l'IL-1β dans l'immunothérapie du CCR reste incertain.

La MMP9 est une métalloprotéinase matricielle qui a été identifiée comme un composant du commutateur angiogénique au cours de la carcinogenèse [35, 36]. MMP9 médie l'invasion tumorale, les métastases et l'évasion immunitaire par une voie de signalisation pro-oncogène [37,38,39] et est associée à une rechute et à un mauvais pronostic chez les patients atteints de CCR [40]. La combinaison de l'inhibition de MMP9 avec l'inhibition du point de contrôle immunitaire a amélioré l'efficacité de l'immunothérapie dans des modèles murins de mélanome [41] et de cancer du sein [42]. La MMP9 s'est également révélée prometteuse dans la stratification du pronostic et de la réactivité au traitement du point de contrôle immunitaire chez les patients atteints de carcinome hépatocellulaire [43]. Les résultats de l'analyse KEGG actuelle pour 130 gènes clés ont révélé que l'IL-1β et la MMP9 étaient fortement corrélées aux voies de signalisation MAPK et PI3K-Akt. Des études récentes ont également indiqué que l'IL-1β régule à la hausse l'expression de MMP9 par différentes voies de signalisation dans différentes maladies [44,45,46]. L'infiltration de MDSC pourrait stimuler davantage la sécrétion de MMP9 [47], et l'accumulation de MDSC induite par l'IL-1β pourrait être l'une des principales sources de MMP9. Cependant, la fonction de la régulation à la hausse de MMP9 médiée par l'IL-1β dans l'immunothérapie du CCR doit faire l'objet d'études plus approfondies.

Dans la présente étude, nous avons décrit le paysage cellulaire des groupes résistants à l'immunothérapie et sensibles à l'immunothérapie au niveau unicellulaire. Le degré d'agrégation des lymphocytes T CD8+ et des monocytes dans le groupe sensible était significativement plus élevé que celui du groupe résistant. IL-1β et MMP9 ont été identifiés comme les deux gènes les plus corrélés avec la résistance anti-PD-1. De plus, l'infiltration des MDSC par l'IL-1β a amélioré la résistance anti-PD-1 dans le CRC MSI-H/dMMR.

Dans la présente étude, l'ORR et le DCR du CCRm MSI-H/dMMR traité avec la monothérapie PD-1 de première intention étaient de 43,75 % (7/16) et 68,75 % (11/16), respectivement. Les cellules T IL-1β et CD8 + se sont avérées avoir la corrélation la plus élevée avec la résistance anti-PD-1 parmi les gènes et les types de cellules, respectivement. Des expériences sur des souris ont démontré que l'infiltration de MDSC induite par l'IL-1β supprimait l'accumulation de lymphocytes T CD8 +, ce qui améliorait la résistance anti-PD-1 du CRC MSI-H / dMMR. Ensemble, ces résultats suggèrent que les antagonistes de l'IL-1β pourraient s'avérer prometteurs en tant que nouveaux médicaments pour inverser la résistance aux inhibiteurs de PD-1.

Les ensembles de données scRNA-seq générés et analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le référentiel NCBI [https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra/PRJNA932556].

Processus biologique

Composition cellulaire

Réponse complète

Cancer colorectal

Taux de contrôle de la maladie

Cellules dendritiques

Gènes différentiellement exprimés

Réparation de mésappariement déficient

Immunohistochimie

Immunofluorescence

Cellules suppressives dérivées de myéloïdes

Cancer colorectal métastatique

Cellules suppressives myéloïdes monocytaires

Instabilité élevée des microsatellites

Microsatellite stable

Taux de réponse objectif

Une maladie progressive

Protéine de mort cellulaire programmée-1

Cellules suppressives polymorphonucléaires dérivées de myéloïdes

Réponse partielle

Effectuer une interaction protéine-protéine

Fonction moléculaire

Séquençage d'ARN unicellulaire

Maladie stable

Outil de recherche pour la récupération de gènes en interaction

Microenvironnement tumoral

Incorporation voisine stochastique distribuée en T

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N'est pas applicable.

Ce sujet a été financé par des subventions du projet technologique de l'équipe d'innovation de la province du Yunnan (n° 2019HC009), du projet de construction du centre provincial du cancer colorectal du Yunnan (n° 2020YZ001), du fonds de recherche scientifique du département provincial de l'éducation du Yunnan (n° 2022J0227) et du projet de planification scientifique et technologique de la province du Yunnan (n° 202201AY070001-149).

Tao Wu, Xuan Zhang et Xinxing Liu sont co-premiers auteurs et ont contribué à parts égales à ce travail.

Département de chirurgie colorectale, Hôpital du cancer du Yunnan, Troisième hôpital affilié de l'Université médicale de Kunming, n ° 519, route de Kunzhou, district de Xishan, Kunming, 650118, Chine

Tao Wu, Xuan Zhang, Xinxing Liu, Xinyi Cai, Tao Shen, Dingguo Pan, Ruixi Hu, Jianhua Dong, Shilei Gen, Zhaoyu Yang et YunFeng Li

Collège de bioingénierie, Université de Chongqing, Chongqing, Chine

Rui Liang

Département d'intervention mini-invasive, Hôpital du cancer du Yunnan, Troisième hôpital affilié de l'Université médicale de Kunming, Kunming, Chine

Rong Ding

Département de gastro-entéroscopie, Hôpital du cancer du Yunnan, Troisième hôpital affilié de l'Université médicale de Kunming, Kunming, Chine

Furong Li et Jinsha Li

Département d'oncologie, Hôpital du cancer du Yunnan, Troisième hôpital affilié de l'Université médicale de Kunming, Kunming, Chine

Lin Xie

Département de radiologie, Hôpital du cancer du Yunnan, Troisième hôpital affilié de l'Université médicale de Kunming, Kunming, Chine

Chunlong Wang

Département de dermatologie, Hôpital pour enfants de Kunming, Kunming, Chine

Lu Xing

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YL et LX2 ont conçu l'article. TW, XZ et XL ont rédigé le manuscrit et étaient responsables de l'analyse des données scRNA-seq. XC était responsable de l'expérimentation animale. DP et RD étaient responsables du recrutement des patients et de la collecte des échantillons. RL et TS ont effectué l'immunohistochimie et l'immunofluorescence. RH et JD ont modifié le manuscrit. FL et JL ont effectué la coloscopie. CW a effectué l'examen radiologique. LX1 et SG ont effectué l'analyse statistique. ZY a terminé la qPCR et le Western Blot. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance avec Lu Xing ou Yun Feng Li.

Tous les participants avaient un consentement éclairé écrit avant l'étude. De plus, le comité d'éthique de l'hôpital du cancer du Yunnan a approuvé les protocoles d'étude qui ont été conçus sur la base des principes éthiques de la recherche médicale impliquant des sujets humains de la déclaration d'Helsinki (numéro d'approbation : KYLX202127). Les souris appliquées dans cette étude proviennent toutes du département des animaux expérimentaux de l'Université médicale de Kunming, et le schéma expérimental a été approuvé par le comité d'éthique des animaux expérimentaux de l'Université médicale de Kunming (numéro d'approbation : kmmu20221065).

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun conflit d'intérêt potentiel.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Tableau S1. Données de séquençage de cellules individuelles d'échantillons cliniques de 6 patients atteints de MSI-H/dMMR.

Tableau S2. Marqueurs utilisés dans le pipeline d'analyse des sous-types cellulaires.

Nombre de cellules de 9 sous-types de cellules dans chaque échantillon.

Figure S1. Analyse GO et KEGG des gènes marqueurs.

Tableau S4. 1623 gènes différentiellement exprimés dans 9 sous-ensembles de cellules.

Tableau S5. 1454 gènes liés au pseudo-temps ont été identifiés à partir de 1623 gènes caractéristiques.

Figure S2. Analyse KEGG et GO des gènes liés au pseudo-temps.

Tableau S6. 155 DEG dans l'expression génique de chaque sous-type cellulaire entre le groupe sensible et le groupe résistant.

Figure S3. Analyse GO et KEGG des DEG liés à la résistance PD-1.

Tableau S7. 130 gènes communs parmi 454 gènes liés au pseudo-temps et 155 (déduplication) gènes liés à la résistance PD-1.

Tableau S8. Analyse VarElect de 130 gènes communs.

Figure S4. Résultats de l'analyse VarElect de 130 gènes communs dans 454 gènes liés au pseudo-temps et 155 (déduplication) gènes liés à la résistance PD-1 DEG. Figure S5. (A) L'interaction récepteur cytokine-cytokine et (B) les cartes des voies de signalisation MAPK et PI3K-Akt de l'IL-1β et de la MMP9. Figure S6. Construction d'une lignée cellulaire CT26 stable surexprimant IL-1β. (A) Lignée cellulaire de cancer colorectal CT26 utilisée dans cette expérience. (B) Carte plasmidique du vecteur de surexpression de l'IL-1β. (C) Criblage des colonies positives par l'ampicilline après transformation plasmidique. (D) Carte de gel d'électrophorèse plasmidique. (E) Western blot a été appliqué pour détecter l'expression de l'IL-1β dans des lignées cellulaires transformées de manière stable. (F) La qPCR a été utilisée pour détecter l'expression de l'IL-1β dans des lignées cellulaires transformées de manière stable.

Images des taches originales.

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Réimpressions et autorisations

Wu, T., Zhang, X., Liu, X. et al. Le séquençage unicellulaire révèle le paysage du microenvironnement immunitaire lié à la résistance anti-PD-1 dans le cancer colorectal métastatique avec une instabilité microsatellite élevée. BMC Med 21, 161 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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Reçu : 08 décembre 2022

Accepté : 14 avril 2023

Publié: 27 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12916-023-02866-y

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