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Oct 16, 2023

Le microbiote intestinal contribue à la pathogenèse de l'anorexie mentale chez l'homme et la souris

Nature Microbiologie volume 8,

Nature Microbiology volume 8, pages 787–802 (2023)Citer cet article

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L'anorexie mentale (AN) est un trouble du comportement alimentaire avec une mortalité élevée. Environ 95 % des cas sont des femmes et sa prévalence dans la population est d'environ 1 %, mais il manque un traitement fondé sur des données probantes. La pathogenèse de l'AN implique probablement la génétique et divers facteurs environnementaux, et un microbiote intestinal altéré a été observé chez des individus atteints d'AN en utilisant le séquençage des amplicons et des cohortes relativement petites. Ici, nous avons étudié si un microbiote intestinal perturbé contribue à la pathogenèse de l'AN. La métagénomique et la métabolomique du fusil de chasse ont été réalisées sur des échantillons de matières fécales et de sérum, respectivement, d'une cohorte de 77 femmes atteintes d'AN et de 70 femmes en bonne santé. Plusieurs taxons bactériens (par exemple, les espèces de Clostridium) ont été modifiés dans l'AN et corrélés avec les estimations du comportement alimentaire et de la santé mentale. Le virome intestinal a également été modifié dans l'AN, y compris une réduction des interactions virales-bactériennes. Les modules fonctionnels bactériens associés à la dégradation des neurotransmetteurs ont été enrichis en AN et diverses variantes structurelles des bactéries ont été liées aux caractéristiques métaboliques de l'AN. La métabolomique sérique a révélé une augmentation des métabolites associée à une réduction de l'apport alimentaire (par exemple, l'acide indole-3-propionique). Les analyses d'inférence causale impliquaient que les métabolites bactériens sériques médiaient potentiellement l'impact d'un microbiote intestinal altéré sur le comportement de l'AN. En outre, nous avons effectué une transplantation de microbiote fécal à partir de cas d'AN sur des souris sans germes dans le cadre d'une alimentation restreinte en énergie pour refléter le comportement alimentaire d'AN. Nous avons constaté que la réduction de la prise de poids et l'expression induite des gènes des tissus hypothalamiques et adipeux étaient liées à un métabolisme énergétique et à un comportement alimentaire aberrants. Nos études «omiques» et mécanistes impliquent qu'un microbiome intestinal perturbateur peut contribuer à la pathogenèse de l'AN.

L'anorexie mentale (AN) est une maladie mentale grave et un trouble de l'alimentation caractérisés par une image corporelle déformée, des pensées obsessionnelles sur la nourriture, des schémas de comportement rituels, notamment une réduction de l'apport alimentaire, une perte de poids corporel, une activité physique accrue et une rigidité émotionnelle1. L'AN touche principalement les femmes dans environ 95 % des cas et sa prévalence dans la population est d'environ 1 %2. Il peut être classé en deux sous-types, le type commun restrictif (AN-RS) et le type moins répandu de frénésie alimentaire ou de purge (AN-BP)1. La base de preuves pour le traitement fait défaut3 et bien qu'un traitement multidisciplinaire spécialisé puisse réduire la mortalité4, moins de la moitié des cas d'AN obtiennent une rémission complète5. Le taux de mortalité global est estimé à 5,6 % par décennie, bien plus élevé que dans la population générale6.

Malgré les recherches pour déterminer l'étiologie de l'AN, celle-ci reste un syndrome, c'est-à-dire un ensemble de symptômes sans cause unificatrice bien définie. Des études jumelles ont rapporté des estimations d'héritabilité de 50 à 60%7 et des études d'association à l'échelle du génome ont identifié huit loci génomiques montrant des corrélations avec des troubles psychiatriques, l'activité physique et des traits métaboliques et anthropométriques. Ceci est indépendant des variantes courantes associées à l'indice de masse corporelle8,9. Au niveau physiopathologique, l'AN se caractérise par de multiples changements endocriniens10 et une signalisation perturbée des neurotransmetteurs dans diverses parties du cerveau11.

Le tube digestif humain contient des assemblages complexes de micro-organismes qui peuvent avoir un impact sur le métabolisme, l'immunité et la neurobiologie de l'hôte via des métabolites et d'autres voies12. Cela peut inclure l'axe intestin-microbiote-cerveau, qui peut affecter les fonctions cérébrales, notamment la régulation de l'appétit, du comportement et des émotions13. Par exemple, le métabolite bactérien caséinolytique peptidase B (ClpB), principalement produit par les entérobactéries, est un mime antigénique de l'hormone α-mélanocytaire, qui peut exercer des effets anorexigènes14,15.

Il a été émis l'hypothèse qu'un microbiote intestinal aberrant pourrait être impliqué dans la pathogenèse de l'AN. Plusieurs petites études qui ont utilisé le séquençage des amplicons pour caractériser le microbiote intestinal au niveau du genre dans l'AN ont été publiées16,17,18,19, montrant une dysbiose du microbiote bactérien intestinal (voir la note complémentaire 1). De plus, dans un modèle murin d'anorexie, des modifications du microbiote intestinal se sont avérées associées à des modifications du comportement alimentaire et de l'expression de neuropeptides hypothalamiques20.

Ici, nous avons exploré l'hypothèse selon laquelle un microbiote intestinal intestinal perturbé et un métabolome sérique contribuent à la pathogenèse complexe de l'AN. Pour ce faire, nous avons effectué une métagénomique en fusil de chasse sur des échantillons fécaux de 77 cas féminins d'AN et de 70 femmes témoins appariées selon l'âge, permettant des analyses approfondies du microbiote bactérien et archéen intestinal aux niveaux taxonomique, fonctionnel et génétique, ainsi que des analyses du microbiote intestinal viral. Nous avons également caractérisé le métabolome sérique, qui a été analysé avec les données du métagénome intestinal en relation avec des marqueurs individuels du comportement alimentaire et psychologique. Les mécanismes causaux ont été explorés in silico à l'aide d'analyses de médiation bidirectionnelles et in vivo grâce à la transplantation de microbiote fécal (FMT) du microbiote intestinal de cas d'AN à des femelles sans germes. Nos résultats appuient l'hypothèse selon laquelle un microbiote intestinal AN perturbé et les métabolites bactériens associés contribuent à la pathogenèse de l'AN (Extended Data Fig. 1).

Les statistiques résumées des caractéristiques cliniques des 77 femmes inscrites atteintes d'AN et des 70 femmes témoins appariées selon l'âge considérées comme ayant un poids santé (HC) sont présentées dans le tableau supplémentaire 1. évaluation du modèle éostatique pour la résistance à l'insuline (HOMA-IR) et la protéine C-réactive sérique inférieure. Les caractéristiques de base détaillées des participants à l'étude sont présentées dans le tableau supplémentaire 2. De plus, dans les cas d'AN, les cas de type AN-RS étaient caractérisés par des valeurs plus élevées d'insuline sérique et une sensibilité à l'insuline plus faible que les individus AN-BP (tableau supplémentaire 1). En comparant les échantillons de selles de AN et HC, il n'y avait aucune différence significative dans le nombre de cellules bactériennes entre AN et HC ou au sein des sous-types de AN (PWilcoxon> 0, 05, tableau supplémentaire 1).

Au niveau du phylum, les échantillons de microbiote AN ont été caractérisés par une réduction des Bacteroidota et Actinobacteriota (Extended Data Fig. 2a). Au niveau de la famille, les Bacteroidaceae étaient dominantes dans les deux groupes (Extended Data Fig. 2b). Parmi les 20 familles les plus abondantes, l'abondance des Christensenellales CAG-138 était plus élevée chez AN comme nouvelle observation pour cette cohorte, tandis que l'abondance des Ruminococcaceae et des Lachnospiraceae était plus élevée chez HC. Parmi les 89 familles bactériennes identifiées, les Christensenellaceae étaient les plus significativement enrichies en AN (Extended Data Fig. 2c). Nous avons observé une plus grande diversité β du microbiome AN ​​au niveau du genre (données étendues Fig. 2d), les Bacteroides étant le phylotype dominant dans les deux groupes (données étendues Fig. 2e). Parmi les 30 principaux genres, Faecalibacterium, Agathobacter, Gemmiger, Lachnospiraceae G non classé, Ruminococcus 2, Roseburia, Dysosmobacter - Oscillibacter, Coprococcus, Oscillospirales 4 CAG-103 et Eisenbergiella étaient plus abondants dans HC, tandis que Christensenellales CAG-138 non classé était plus abondant dans AN (Extended Data Fig. 2e). De plus, parmi les 225 genres bactériens identifiés, Lactobacillus était le plus significativement enrichi en AN (Extended Data Fig. 2f). Malgré la différence de genres majeurs entre AN et HC, nous avons constaté que la richesse des pangénomes d'espèces métagénomiques (MSP, ci-après appelées espèces) était similaire entre les deux groupes (Extended Data Fig. 2g). Dans les analyses d'entérotypes22, nous avons trouvé une prévalence plus élevée de l'entérotype Ruminococcacea (entérotype R) dans AN par rapport à HC, et une prévalence plus élevée du même entérotype dans AN-BP que dans le sous-type AN-RS (Extended Data Fig. 2h).

Au niveau de l'espèce (tableau supplémentaire 3), nous avons observé que le microbiote intestinal AN est caractérisé par une diversité β plus élevée (Fig. 1a). Au sein des sous-groupes AN, le sous-type AN-BP avait une communauté bactérienne plus hétérogène au niveau de l'espèce que le sous-type AN-RS (Fig. 1b). Dans la comparaison entre les cas d'AN hospitalisés et ambulatoires, nous avons constaté que la diversité β des patients hospitalisés était plus élevée que celle des patients ambulatoires au niveau de l'espèce (Fig. 1 et données supplémentaires). Le changement récent de poids corporel dans les 4 semaines n'était pas associé à la composition bactérienne de l'intestin (tableau supplémentaire 4). Les espèces dont la distribution d'abondance était significativement différente entre AN et HC après les interférences déconcertantes de plusieurs médicaments (inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, antipsychotiques et benzodiazépines, spécifiés dans le tableau supplémentaire 2) sont présentées à la Fig. 1c. Parmi les espèces appauvries en AN figuraient Roseburia intestinalis et Roseburia inulinivorans, des espèces qui ont une capacité élevée de digestion des polysaccharides végétaux et sont considérées comme faisant partie du microbiote intestinal lié à la santé23. Dans une analyse de réseau non dirigée de co-abondance (Extended Data Fig. 3), nous avons identifié une communauté bactérienne constituée d'Eisenbergiella, bactérie productrice de butyrate SS3/4 - (Clostridium) sp. CAG:81, Faecalibacterium prausnitzii 3, (Oscillibacter) sp. Bactérie ER4/Firmicutes CAG : 129_59_24, Oscillibacter sp. 57_20, (Clostridium) sp. 2789STDY5834924, Lachnospiraceae non classée et Dysosmobacter – Oscillibacter non classée, qui était plus abondante chez HC. Une communauté fortement enrichie en AN comprenait Erysipelatoclostridium ramosum, Enterocloster bolteae, (Clostridium) innocuum et Blautia sp. CAG:257.

a,b Boîte à moustaches (ligne, médiane ; boîte, intervalle interquartile (IQR) ; moustaches, 1,5 × IQR) de la diversité β du microbiote intestinal AN (n = 77) et HC (n = 70) (a) et de deux sous-types AN (AN-RS n = 56, AN-BP n = 21) et du microbiote intestinal HC (b) au niveau de l'espèce bactérienne (distance de Canberra). La signification statistique des différences entre les deux groupes a été déterminée par le test de somme des rangs de Wilcoxon (bilatéral). c, espèces bactériennes significativement contrastées entre AN et HC. Les différences d'abondance ont été détectées à l'aide du pipeline metadeconfoundR où les covariables telles que l'âge, l'IMC, le tabagisme et la consommation de plusieurs médicaments ont été corrigées. Les valeurs delta de Cliff donnent des estimations de la taille de l'effet. Pour chaque MSP contrasté, la prévalence dans l'ensemble de la cohorte, HC, AN et Padj sont données à côté de l'annotation MSP. d, carte thermique montrant que les espèces bactériennes intestinales sont liées aux scores de troubles de l'alimentation dans les cas d'AN, en utilisant un modèle de régression linéaire où l'âge, l'IMC, le tabagisme et la prise de plusieurs médicaments ont été définis comme covariables et ajustés. Les variables de l'échelle spécifique des troubles de l'alimentation sont marquées en bleu et l'échelle psychologique générale est marquée en rouge. Le panneau de droite de la carte thermique indique la direction de chaque variable. Pour chaque MSP, la prévalence dans l'AN est donnée à côté de l'annotation MSP. +, Padj < 0,05 par la méthode de Benjamini-Hochberg (voir pour les valeurs P exactes).

Données source

Nous avons étudié les covariations numériques entre l'abondance absolue des bactéries au niveau du genre et de l'espèce et les variables biocliniques dans la cohorte combinée HC et AN. Nous avons utilisé un modèle de régression linéaire ajusté pour les facteurs de confusion, notamment l'âge, le tabagisme et la consommation de plusieurs médicaments (Méthodes et note complémentaire 3, Fig. 2 et données).

Fait intéressant, certains taxons bactériens étaient liés aux scores de troubles de l'alimentation et aux conditions psychologiques après ajustement pour de multiples facteurs de confusion, notamment l'âge, l'indice de masse corporelle (IMC), les antécédents de tabagisme et les médicaments. Au niveau des espèces, nous avons constaté que les espèces de Clostridium étaient positivement corrélées aux scores de troubles de l'alimentation (Fig. 1d), indiquant un rôle potentiel de ces espèces dans la régulation du comportement alimentaire et des symptômes neuropsychiatriques24. De plus, parmi les espèces bactériennes inversement corrélées aux scores de troubles alimentaires, nous avons constaté que les abondances absolues de Lactococcus acidophilus25 et de Faecalibacterium prausnitzii26, toutes deux associées à des symptômes dépressifs, étaient liées à un score d'aliénation interpersonnelle (Fig. 1d). De plus, l'abondance absolue de Parasutterella était positivement corrélée à l'insatisfaction corporelle et l'abondance absolue de Bifidobacterium était corrélée à un marqueur de perfectionnisme. Malgré une abondance absolue similaire de Brachyspira dans AN et HC, ce genre était positivement corrélé avec les marqueurs de « pulsion de minceur » dans AN (Extended Data Fig. 4). Comme le montre la figure 5 des données étendues, nous n'avons trouvé aucune différence dans les niveaux circulants de ClpB14 anorexigène entre les groupes AN et HC (note complémentaire 4).

Nous avons estimé la dynamique de croissance du microbiote intestinal bactérien à partir des données métagénomiques en calculant le rapport pic à creux (PTR)27 pour 50 espèces bactériennes. Trente-cinq d'entre eux étaient présents dans plus de 20 échantillons. Les valeurs médianes de PTR différaient nettement entre AN et HC (PWilcoxon = 2, 0 × 10−4, données étendues Fig. 6), ce qui pourrait être lié à la réduction sévère de la consommation alimentaire chez les patients AN. On prévoyait que six bactéries auraient un taux de croissance significativement plus faible dans l'AN (PWilcoxon <0, 05, données étendues Fig. 6). Il s'agissait d'Akkermansia muciniphila, d'Alistipes finegoldii, de Coprococcus catus, d'Eubacterium siraeum, d'Odoribacter splanchnicus et de la bactérie productrice de butyrate SS3/4.

Nous avons observé une richesse virale (Chao1, Fig. 2a) et une diversité (Shannon, Fig. 2b) plus élevées dans les échantillons fécaux AN par rapport à HC. Le changement récent de poids corporel dans les 4 semaines n'était pas associé à la composition virale intestinale (tableau supplémentaire 4). Après déconfusion pour les covariables (âge, tabagisme et prise de médicaments), nous avons identifié 31 espèces virales enrichies ou diminuées en AN (Fig. 2c). D'un intérêt majeur, 25 des 30 espèces virales accrues dans l'AN étaient des phages de Lactococcus avec des hôtes connus de Lactococcus lactis - des bactéries qui ont été largement utilisées dans la production de produits alimentaires fermentés.

a, b, Box plot (ligne, médiane ; boîte, IQR ; moustaches, 1,5 × IQR) des modifications de la richesse en Chao1 (a) et de la diversité de Shannon (b) du microbiote intestinal viral entre AN (n = 77) et HC (n = 70) au niveau de l'espèce virale. La signification a été examinée par le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon (a, b). c, valeurs delta de Cliff des espèces virales intestinales contrastées entre AN et HC avec Padj < 0, 05 par correction de Benjamini-Hochberg (données à côté de l'annotation virale). Les espèces différentielles ont été identifiées par le pipeline metadeconfoundR où les impacts des cofacteurs tels que l'âge, le tabagisme et la consommation de plusieurs médicaments ont été déconfondus. d, Différence du nombre de corrélations écologiques trans-royaumes entre le microbiote intestinal viral et bactérien dans AN (n = 77) par rapport à HC (n = 70) et entre deux sous-types AN (AN-RS n = 56, AN-BP n = 21) en utilisant l'algorithme SparCC.

Données source

L'analyse des corrélations virales-bactériennes au sein du microbiote intestinal AN et HC a révélé une diminution remarquable du nombre d'interactions virales-bactériennes dans l'AN (219 pour HC contre 84 pour AN, test exact de PFisher = 8,8 × 10−15, Fig. 2d). Cela était principalement dû à des interactions affaiblies entre les espèces virales et les producteurs bactériens d'acides gras à chaîne courte, tels que Roseburia inulinivorans, Faecalibacterium prausnitzii et Roseburia hominis (Fig. 3 et données supplémentaires). Nous n'avons observé aucune interaction entre les phages Lactococcus et les bactéries Lactococcus dans l'analyse trans-royaume (Figs. 3 et 4 supplémentaires et données).

Dans les analyses des sous-groupes AN, l'analyse des coordonnées principales (PCoA) sur la distance de Canberra n'a montré aucune altération remarquable de la composition virale intestinale (PPERMANOVA = 0, 571, Fig. 5 et données supplémentaires). Cependant, en comparant le nombre de corrélations virales-bactériennes dans le microbiote intestinal AN-RS et AN-BP, nous avons constaté une réduction du nombre et un rapport beaucoup plus faible de corrélations positives dans AN-RS (164 pour AN-BP contre 44 pour AN-RS, test exact de PFisher <2,2 × 10−16) (Fig. 2d et Fig. 4 supplémentaire). Cela suggère que le microbiote intestinal dans l'AN-RS a affaibli les interactions virales-bactériennes intestinales.

En utilisant les modules métaboliques intestinaux (GMM) 28 et les modules cérébraux intestinaux (GBM) 29 pour prédire les potentiels fonctionnels bactériens intestinaux, nous avons identifié 159 modules fonctionnels. Notamment, l'abondance de GBM pour la biosynthèse de la sérotonine et la dégradation de la dopamine, du glutamate et du tryptophane, qui sont des métabolites ayant des effets sur l'humeur et l'appétit, ont été enrichies en AN (Fig. 3a). À l'inverse, l'abondance des voies de synthèse du glutamate II et de la vitamine K2 était plus élevée chez HC (Fig. 3a)30. De plus, nous avons constaté que la synthèse de la sérotonine et les voies de dégradation du glutamate étaient inversement corrélées aux concentrations circulantes de glucose et d'insuline, ou à la sensibilité à l'insuline (Fig. 3b). Bien que nous ayons observé des différences dans les GBM, nous n'avons pas identifié de différences dans les GMM entre AN et HC (tableau supplémentaire 5).

a, taille de l'effet delta de Cliff des modules fonctionnels contrastés entre AN (n = 77) et HC (n = 70) en utilisant le pipeline metadeconfoundR où les interférences des covariables telles que l'âge, l'IMC, le tabagisme et la prise de plusieurs médicaments ont été corrigées. Les lingots d'or, modules fonctionnels plus abondants en AN ; barres bleues, modules fonctionnels plus abondants en HC. Pour chaque module contrasté, la valeur P après correction de Benjamini-Hochberg est donnée à côté de l'annotation du module. b, Carte thermique des associations entre les variables cliniques et les potentiels fonctionnels du bactériome intestinal par modèle de régression linéaire où les impacts des covariables, notamment l'âge, le tabagisme et la prise de plusieurs médicaments, ont été déconfondus. + indique P < 0,05 par correction de Benjamini-Hochberg (voir pour les valeurs P exactes).

Données source

Les génomes bactériens peuvent avoir des variantes structurelles (SV) qui interfèrent potentiellement avec les gènes fonctionnels ayant un impact sur l'interaction entre les microbes et leur hôte31. Par conséquent, des différences dans la présence ou l'abondance de SV entre des souches bactériennes par ailleurs identiques peuvent sous-tendre des différences phénotypiques et fonctionnelles critiques31,32. Ici, nous avons profilé les SV dans tous les échantillons et identifié 5 056 SV de délétion et 2 423 SV variables sur 56 espèces bactériennes (Fig. 4a, b). Pour certaines espèces, nous avons observé des différences marquées dans la variation du nombre de copies. Nous avons identifié 87 SV de délétion et 18 SV variables chez Bacteroides uniformis chez 134 individus, 78 délétions et 15 SV variables chez Faecalibacterium prausnitzii chez 124 individus, et 110 SV de délétion et 55 SV variables chez Parabacteroides distasonis chez 121 individus. Pour le microbiote archéen, nous n'avons identifié des SV chez Methanobrevibacter smithii que chez 13 individus (Fig. 4a et Fig. 6 et données supplémentaires). Pour explorer les différences potentielles dans la génétique bactérienne, nous avons en outre calculé la distance de Canberra des profils SV bactériens entre les 147 échantillons (Fig. 4c). Les échantillons AN et HC étaient significativement différents dans la diversité β de la composition SV (PWilcoxon < 2, 2 × 10−16). Collectivement, ces résultats suggèrent que la composition des SV bactériennes diffère entre les deux groupes.

a, Nombre de SV de chaque espèce bactérienne ou archée chez 147 (77 cas et 70 témoins) participants à l'étude. Pour chaque espèce, le nombre de délétions et les SV variables sont donnés. b, Diagramme circulaire montrant le nombre total de SV identifiés. c, boîte à moustaches (ligne, médiane ; boîte, IQR ; moustaches, 1,5 × IQR) de la diversité β (distance de Canberra) de la composition génétique basée sur SV dans les bactériomes AN (n = 77) et HC (n = 70). La valeur P a été déterminée par le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon. d, Diagramme d'accord montrant des associations significatives entre les scores de troubles de l'alimentation et les SV bactériennes après ajustement pour l'âge, l'IMC, le tabagisme et la prise de plusieurs médicaments. e, Carte thermique montrant les associations entre les SV de Bacteroides uniformis et les scores EDI-3 à l'aide d'un modèle de régression linéaire où les impacts de l'âge, de l'IMC, du tabagisme et de la consommation de plusieurs médicaments ont été déconfondus. + indique P < 0,05 corrigé par Benjamini-Hochberg (voir pour les valeurs P exactes). En d et e, les variables de l'échelle des troubles alimentaires sont colorées en bleu, l'échelle psychologique générale est en rouge et les SV bactériennes sont en noir. f, le taux de délétion du SV à délétion de 10 kpb hébergeant la thiamine-monophosphate kinase dans le génome de B. uniformis dans le groupe AN. g, Boîte à moustaches (ligne, médiane ; boîte, IQR ; moustaches, 1,5 × IQR) montrant les scores EDI-3 chez les personnes anorexiques avec (n = 49) et sans (n = 28) la suppression de 10 kpb. La signification a été déterminée par le test de somme des rangs de Wilcoxon (bilatéral).

Données source

En explorant les relations entre les SV bactériennes intestinales et les marqueurs du comportement alimentaire, nous avons constaté que dans les cas d'AN, les SV bactériennes étaient significativement associées aux scores de trouble de l'alimentation après déconfusion pour plusieurs covariables (Fig. 4d). À titre d'exemple remarquable, dans l'analyse d'association entre les SV du génome de B. uniformis et les scores d'alimentation de l'hôte, nous avons constaté qu'une délétion de 10 kbp était directement associée à des marqueurs de boulimie et d'abnégation, indiquant que cette délétion SV peut être impliqué dans la régulation des troubles de l'alimentation et des traits psychologiques dans l'AN (Fig. 4e). En effet, l'analyse génétique a montré que le début de cette région génomique spécifique chez B. uniformis code pour une thiamine-monophosphate kinase (Fig. 4f et Tableau supplémentaire 6), qui est l'enzyme distale impliquée dans la voie de biosynthèse de la thiamine (vitamine B1). La carence en thiamine a été associée à la santé mentale, notamment la perte de mémoire, l'anxiété, la dépression, l'irritabilité, l'insomnie ainsi que la perte d'appétit et les troubles gastro-intestinaux33. Environ un tiers des cas d'AN peuvent souffrir d'une carence en thiamine34. Nous avons constaté que les cas d'AN dépourvus de cette région génomique bactérienne présentaient des scores plus élevés de boulimie (une caractéristique clé du sous-type AN-BP) et d'abnégation (Fig. 4g), un schéma également suggéré par nos analyses de corrélation (Fig. 4e). Un autre exemple reliant la génétique bactérienne à des variables biocliniques liées au métabolisme est donné dans (Extended Data Fig. 7) et dans la note complémentaire 5.

Nous avons effectué un profilage métabolomique non ciblé du sérum de cas d'AN et de témoins. Cela a révélé un profil de métabolome sérique composé de 28 métabolites polaires et de 35 métabolites liés au microbiote, qui était significativement différent entre AN et HC (Fig. 5a), alors que légèrement modifié entre les deux sous-types AN (Extended Data Fig. 8a). Nous avons identifié 25 métabolites sériques avec des différences de concentration entre les cas et les témoins après ajustement pour les facteurs de confusion (valeur P ajustée (Padj) <0,05) (Fig. 5b).

a, Analyse en composantes principales (ACP) du profil du métabolome sérique des cas d'AN et des participants au HC. b, Valeurs du delta de Cliff des métabolites contrastés entre AN (n = 77) et HC (n = 70) après ajustement sur l'âge, l'IMC, le tabagisme et la prise de plusieurs médicaments. Les sucettes dorées sont des métabolites enrichis en AN et les sucettes bleues présentent des métabolites sériques enrichis en HC. c, flux de travail pour l'analyse de médiation bidirectionnelle pour les caractéristiques microbiennes intestinales, les métabolites sériques et les phénotypes de l'hôte. d, diagramme de Sankey montrant le réseau de relations causales inférées de la direction 1 où les caractéristiques microbiennes intestinales, y compris les espèces bactériennes, les modules cérébraux/métaboliques intestinaux et la génétique bactérienne, ont été traitées comme des facteurs causaux, les métabolites sont des médiateurs et les scores EDI-3 sont des résultats. e, Exemples de relations causales déduites entre les caractéristiques microbiennes, les métabolites et les scores EDI-3. La direction 1 signifie les caractéristiques microbiennes → les scores des troubles de l'alimentation médiés par les métabolites, illustrés par une ligne noire ; direction 2 signifie caractéristiques microbiennes → métabolites médiés par les scores EDI-3, illustrés par une ligne rouge en pointillés. Les proportions des effets de médiation sont indiquées au centre des graphiques circulaires. FFA, acide gras libre.

Données source

Concentrations sériques des acides biliaires primaires (acide cholique (CA), acide glycocholique (GCA)) et secondaires (acide glycohyocholique (GHCA), acide 7-oxo-hyocholique (7-oxo-HCA), acide glycohyodésoxycholique (GHDCA), acide 7-oxo-désoxycholique (7-oxo-DCA), acide ω/α-muricolique (ω/α-MCA), acide ursodésoxycholique (UDCA)) étaient plus élevés dans l'AN, indiquant un rôle potentiel du microbiote intestinal dans les changements liés à l'AN dans la synthèse et le métabolisme des acides biliaires secondaires, et la régulation de la satiété35. De plus, les concentrations sériques d'acide indole-3-acétique et d'acide indole-3-propionique (IPA), deux métabolites du tryptophane, étaient plus élevées dans l'AN que dans l'HC. Fait intéressant, l'IPA est associée à la sécrétion du peptide 1 de type glucagon, qui peut stimuler la satiété et ralentir la vidange gastrique36,37. Une dérégulation de la valine, des acides gras saturés et insaturés à longue chaîne a également été observée dans le groupe AN (Fig. 5b et note complémentaire 6).

Pour explorer le rôle des métabolites sériques dans l'interaction entre le microbiote intestinal et les phénotypes de l'hôte, nous avons construit des modèles de médiation bidirectionnelle. Pour la direction 1, nous avons émis l'hypothèse que les métabolites sériques (y compris les métabolites liés au microbiote) en tant que variables médient l'effet causal des caractéristiques microbiennes intestinales (espèces bactériennes, modules cérébraux intestinaux et génétique bactérienne) sur les phénotypes de l'hôte (Eating Disorder Inventory-3 (EDI-3) scores et traits métaboliques). Pour la direction 2, nous avons traité les phénotypes comme des médiateurs et les altérations des métabolites comme des résultats de changements dans les caractéristiques microbiennes (Fig. 5c). Cette analyse bidirectionnelle in silico nous a permis de quantifier la mesure dans laquelle un médiateur hypothétique (un métabolite) participe à l'interaction entre une cause (caractéristiques microbiennes) et son effet (caractéristiques phénotypiques de l'hôte).

Nous avons d'abord effectué l'inférence causale des caractéristiques bactériennes sur les scores du questionnaire EDI-3 dans les cas d'AN (Extended Data Fig. 8b). Les relations causales déduites dans la direction 1 consistaient en 13 caractéristiques microbiennes en tant qu'initiateurs, 11 métabolites en tant que médiateurs et 7 scores EDI-3 en tant que résultats (Fig. 5d). À titre d'exemple notable, nous avons identifié la « pulsion de minceur » comme un résultat de l'espèce bactérienne enrichie en AN C. paraputrificum (Fig. 1c), qui était liée à des modifications des taux sériques d'IPA, également enrichie dans le groupe AN. C. paraputrificum est un producteur de multiples catabolites du tryptophane, dont l'IPA, l'acide indoleacrylique, l'acide indoleacétique et la tryptamine, qui sont tous impliqués dans la régulation de l'appétit et de la santé mentale24 (Fig. 5e).

Dans un autre exemple, le sulfate d'indoxyle, qui a été enrichi chez les patients AN, a été identifié comme un médiateur de l'AN enrichi (Clostridium) sp. CAG:269 dans le score d'insatisfaction corporelle (Fig. 5e). Le sulfate d'indoxyle est une toxine cardio- et urémique et il a été démontré qu'il induisait des comportements anxieux ou dépressifs chez les humains et les modèles animaux38,39. Clostridium est un genre de bactéries productrices d'indole qui peuvent coder pour la tryptophanase40, l'enzyme critique convertissant le tryptophane en indole, pyruvate et ammoniac41.

Ensuite, nous avons analysé l'inférence causale entre les caractéristiques microbiennes et les caractéristiques métaboliques de l'hôte dans l'ensemble de la cohorte (données étendues, Fig. 8c). Le réseau causal dans la direction 1 consistait en 14 caractéristiques microbiennes, 10 métabolites et 5 traits métaboliques en tant que traitements causaux, médiateurs et résultats, respectivement (données étendues Fig. 8d). Notamment, nous avons constaté que le module de synthèse de la sérotonine affectait de manière causale l'IMC de l'hôte via l'acide biliaire secondaire glycoursodésoxycholique, qui est régulé à la hausse par la sérotonine42 (données étendues Fig. 8e). Enfin, conformément à nos découvertes précédentes, la leucine sérique a médié l'impact de B. vulgatus sur l'homéostasie du glucose43 (données étendues Fig. 8e). Nous n'avons observé aucune relation causale unidirectionnelle entre les modifications du comportement alimentaire et l'état psychologique, les caractéristiques microbiennes intestinales et les métabolites (tableau supplémentaire 7).

Pour étudier les relations causales potentielles entre un microbiote intestinal altéré dans l'AN et les phénotypes pertinents, nous avons transplanté le microbiote fécal de trois cas d'AN-RS choisis au hasard (pour atteindre l'uniformité car l'AN-BP a un phénotype plus hétérogène que le sous-type AN-RS) et trois participants HC appariés selon l'âge à trois portées indépendantes de souris femelles sans germes (GF) (données étendues Fig. 9a). Pour minimiser les variations du patrimoine génétique, nous avons inclus des compagnons de portée comme souris témoins. Dans chaque étude de portée, 8, 6 et 6 compagnons de portée, respectivement, ont été assignés au hasard comme receveurs de microbiote fécal AN ou HC. Après la transplantation de selles, les souris receveuses ont été logées individuellement et ont reçu un régime hypocalorique à 30% pendant 3 semaines pour imiter la réduction de l'apport alimentaire chez l'AN humain (données étendues Fig. 9b). L'alimentation ad libitum chow n'a généré aucune altération phénotypique chez les souris GF44, une observation cohérente avec un rapport précédent sur le kwashiorkor45 (Extended Data Fig. 10a).

Après 21 jours, les souris GF transplantées avec des selles provenant de cas d'AN ont montré une diminution initiale plus importante du poids corporel et un gain de poids plus lent au fil du temps par rapport aux souris ayant reçu HC FMT (Fig. 6a et Extended Data Fig. 10b; voir la note complémentaire 7 pour discussion).

a, changement de poids corporel (BW) par rapport au poids corporel au jour 0 après un régime hypocalorique (AN-T n = 10, HC-T, n = 10 examinés sur 3 expériences indépendantes). La signification a été calculée par une analyse de variance à deux voies (ANOVA), suivie d'un test post hoc de Benjamini-Hochberg. b,c, niveaux d'ARNm des gènes de souris indiqués dans l'hypothalamus (b) et le tissu adipeux blanc inguinal (c) chez les souris receveuses de microbiote fécal (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, examinées sur 3 expériences indépendantes). La signification entre les deux groupes a été testée à l'aide du test t de Student bilatéral non apparié. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± sem (a–c). d, diagramme de Venn des ASV identifiés et transférés entre les donneurs humains et les receveurs de souris GF. e, à gauche : carte thermique des 84 ASV conservés chez les donneurs humains. Milieu : différences dans les 84 ASV conservés dérivés du contenu caecal entre les receveurs de souris AN-T et HC-T GF (AN-T n = 10, HC-T, n = 10, examinés sur 3 expériences indépendantes). Les altérations microbiennes transférées sont marquées en bleu. À droite : informations taxonomiques sur les ASV.

Données source

Nous avons effectué une analyse de l'expression des gènes hypothalamiques après FMT. Les receveurs transplantés AN et transplantés HC différaient dans l'expression de plusieurs gènes hypothalamiques impliqués dans le contrôle du comportement alimentaire et de la dépense énergétique (Fig. 6b). Cela comprenait une expression accrue des suppresseurs d'appétit Bdnf46 et Cartpt47, et du récepteur de la sérotonine, Htr1b (impliqué dans la régulation en aval de la sérotonine), chez les receveurs d'AN FMT. L'expression de Snca, qui code pour la protéine neuronale alpha-synucléine associée à plusieurs maladies neurodégénératives, était plus élevée chez les souris transplantées AN48. De plus, nous avons analysé les niveaux d'ARN messager (ARNm) des gènes codant pour les protéines régulant la thermogenèse du tissu adipeux. Nous avons constaté que les abondances d'ARNm Ucp1, Elovl3 et Pgc1α étaient augmentées dans la graisse inguinale des souris transplantées AN, indiquant une amélioration de la thermogenèse du tissu adipeux dans ce groupe de souris (Fig. 6c).

Le séquençage de l'amplicon du gène de l'acide ribonucléique ribosomal (ARNr) 16S des selles de donneurs humains et du contenu caecal du receveur de souris GF a identifié 85 variants de séquence d'amplicon se chevauchant (ASV; Fig. 6d), dont 45 (53%) ASV modifiés chez les donneurs ont été transférés aux receveurs (Fig. 6e). Le profilage du métabolome sérique a détecté 31 métabolites conservés entre les donneurs et les receveurs, et les altérations de 19 d'entre eux (61%) ont été transférées de l'homme à la souris (données étendues Fig. 10c). Nous avons identifié trois ASV : ASV_021, ASV_229 et ASV_002 qui ont été annotés comme Bacteroides au niveau du genre. L'abondance relative de ces ASV et l'expression des gènes de brunissement, y compris Ucp1 (Extended Data Fig. 10d), étaient fortement corrélées positivement, indiquant un rôle potentiel de ces ASV dans la perte de poids corporel ou la diminution du gain de poids grâce à un brunissement adipeux accru. La corrélation inverse entre l'abondance relative d'ASV_122, annotée comme genre Akkermansia, et le gène hypothalamique suppresseur d'appétit Htr1b est également notable et suggère un rôle potentiel d'ASV_122 dans la régulation de l'appétit (Extended Data Fig. 10d). Pris ensemble, les altérations de l'expression génique des tissus hypothalamiques et adipeux et les changements de poids corporel au fil du temps chez la souris suggèrent qu'un microbiote intestinal perturbé dans l'AN humain peut contribuer à certains des éléments de la pathogenèse complexe de l'AN.

En utilisant une combinaison de séquençage et de métabolomique pour caractériser le microbiome intestinal et le métabolome chez l'homme et la souris, nous montrons que les composants bactériens et viraux du microbiome et du métabolome sérique sont altérés chez les personnes atteintes d'AN par rapport aux individus sains. Nous constatons également que les SV des espèces bactériennes sont différentes entre l'AN et les témoins sains, et les analyses d'inférence causale in silico impliquent que les métabolites bactériens interviennent dans certains effets d'un microbiote intestinal altéré sur le comportement de l'AN. Enfin, les souris GF transplantées avec des selles AN suivant un régime hypocalorique perdent initialement plus de poids et ont un gain de poids plus lent au fil du temps par rapport aux souris transplantées avec des selles provenant d'individus en bonne santé. Cela a été associé à une expression plus élevée de gènes suppresseurs d'appétit dans l'hypothalamus et à une expression plus élevée de gènes liés à la thermogenèse dans le tissu adipeux de souris transplantées AN.

Dans les expériences FMT et les analyses d'inférence in silico, nous avons observé des changements dans les taux circulants d'acide glycine-chénodésoxycholique, d'acide indole-3-propionique, d'acide taurine-α-muricholique et d'acide taurine-hyodésoxycholique. Nous proposons que ces métabolites peuvent agir en tant que médiateurs potentiels de certains des phénotypes AN. Par exemple, l'acide indole-3-propionique est un métabolite du tryptophane, qui est impliqué dans l'activité de la sérotonine49, et l'acide hyodésoxycholique est un acide biliaire 6α-hydroxylé, également appelé acide muricholique, qui réduit le gain de poids corporel50. Cet acide biliaire est impliqué dans la régulation de la satiété51. L'activité de la sérotonine ainsi que la régulation de l'appétit pourraient être impliquées dans le développement et/ou le maintien du syndrome AN. Les études futures devront explorer les effets individuels et combinés de ces métabolites sur le métabolisme énergétique. Pourtant, de nombreuses autres espèces bactériennes intestinales et métabolites dérivés peuvent médier les traits AN observés chez l'homme et la souris, comme indiqué dans un modèle d'anorexie basé sur l'activité20,52.

Les analyses de la délétion et des SV variables chez les espèces bactériennes intestinales ont indiqué que la génétique bactérienne peut influencer les traits comportementaux et la physiopathologie pertinents pour l'AN. Une suppression de 10 kpb dans le génome de B. uniformis qui a été associée à des estimations de boulimie et d'abnégation est particulièrement intéressante. Nous avons prédit que cette délétion entraînerait la perte d'un gène codant pour la thiamine-monophosphate kinase, ce qui pourrait entraîner une déficience relative en thiamine produite par le microbiote. Ceci est intéressant dans le contexte de la pathologie AN puisque divers problèmes de santé mentale et intestinale sont connus pour être liés à une carence en thiamine33.

Nos études du microbiote intestinal viral dans l'AN ont montré un découplage partiel des interactions écologiques entre les espèces virales et les espèces bactériennes productrices de chaînes courtes avec un impact sur la biologie cérébrale53. De plus, les échantillons d'AN ont été enrichis en phages Lactococcus avec des hôtes bactériens L. lactis connus. L'enrichissement associé à l'AN dans les phages de Lactococcus peut entraîner une perturbation de la fermentation des aliments et suggérer l'utilisation possible d'aliments fermentés dans le traitement futur de l'AN. La raison de cet enrichissement en phages de Lactococcus n'est pas établie, mais notre découverte peut justifier le test d'un probiotique multisouche contenant L. lactis chez des adolescents AN54.

Notre étude a des limites : (1) l'utilisation d'une cohorte AN danoise transversale limite la généralisabilité des résultats à d'autres ethnies ; (2) la même limitation s'applique à l'utilisation de patients AN en traitement dans un centre spécialisé, car ces patients peuvent ne pas être représentatifs de formes plus légères d'AN ; et (3) bien que les effets de plusieurs covariables aient été déconfondus, nous n'avions aucune information sur le régime alimentaire et l'activité physique, des comportements qui ont un impact sur le microbiote intestinal.

En conclusion, la présente étude multi-omique révèle des perturbations profondes et complexes du microbiote intestinal chez les personnes atteintes d'AN, avec des implications fonctionnelles et des métabolites sériques altérés. Ces composés peuvent agir via la circulation sanguine ou via les voies de signalisation neuronales intestin-microbiote-cerveau affectant la régulation cérébrale de l'appétit, des émotions et du comportement. La FMT de donneurs humains d'AN à des souris GF sous alimentation restreinte en énergie a entraîné une diminution du gain de poids corporel et un certain nombre de changements dans l'expression des gènes des tissus hypothalamiques et adipeux impliqués dans le contrôle du comportement et de l'homéostasie énergétique. La combinaison d'expériences multi-omiques et in vivo complète nos analyses d'inférence causale pour permettre l'identification de métabolites bactériens spécifiques qui interviennent potentiellement dans les traits AN de l'hôte humain. Nos résultats appuient l'hypothèse selon laquelle un microbiote intestinal gravement perturbé contribue à certaines des étapes de la pathogenèse de l'AN.

Les patients AN ont tous été diagnostiqués par un psychiatre consultant expérimenté et ils répondaient aux critères du DSM-5 pour les sous-types de restriction ou de frénésie/purge d'AN1. Étant donné que 90 à 95 % des personnes atteintes d'AN diagnostiquée sont des femmes, nous avons décidé d'inclure uniquement des femmes dans la présente étude et puisque l'origine ethnique peut influencer le microbiote intestinal, nous n'avons inclus que des femmes danoises de race blanche avec des cas d'AN, recrutées dans trois centres spécialisés au Danemark du 1er septembre 2014 au 31 juillet 2016. (Hôpital universitaire d'Aalborg). Les critères d'exclusion comprenaient un traitement antibiotique ou antifongique dans les 3 mois précédents, toute maladie ou infection somatique aiguë ou chronique. Tous les patients inclus ont été pris en charge dans des centres spécialisés, et ils ont été entendus par un psychologue ou un psychiatre expérimenté et spécialisé au début de leur traitement. L'inventaire validé des troubles de l'alimentation (EDI, détails donnés dans la note complémentaire 2) a été utilisé pour l'entretien et comme questionnaire rempli par des professionnels de la santé qualifiés21. Les critères d'exclusion pour les femmes témoins en bonne santé appariées selon l'âge étaient un IMC inférieur à 18,5 ou supérieur à 25 kg m-2, des médicaments réguliers de toute nature à l'exception des pilules contraceptives et des antibiotiques au cours des 3 derniers mois. Les participants témoins ont été recrutés par annonce publique et par contact direct avec le personnel de santé, les étudiants en médecine et leurs proches. L'IMC et d'autres caractéristiques cliniques des témoins sains sont répertoriés dans le tableau supplémentaire 2.

Le protocole de l'étude a été enregistré sur ClinicalTrials.gov (NCT02217384) et l'étude a été menée conformément à la déclaration d'Helsinki et approuvée par le Comité d'éthique scientifique régional pour le sud du Danemark (dossier n° 42053 S-20140040). Tous les participants impliqués dans cette étude ont fourni un consentement éclairé écrit.

Patients hospitalisés. Toutes les mesures décrites ci-dessous ont été réalisées pendant le traitement de routine dans l'unité spécialisée pour la stabilisation somatique et psychologique des patients atteints d'AN sévère. Une restauration de poids sûre et efficace de 2,0 à 3,0 % par semaine est l'objectif du traitement dans l'unité d'hospitalisation. Les soins ont été prodigués par une équipe multidisciplinaire et sont conformes aux directives internationales. Des repas personnalisés ont été donnés sous la supervision d'infirmières ou de diététistes qualifiés à des heures fixes. Si les repas ne pouvaient être consommés dans les délais prédéfinis (15 min pour une collation et 30 min pour un repas principal), des boissons nutritives complémentaires étaient ajoutées soit par voie orale, soit par sonde duodénale. Pour tenir compte des préférences individuelles, un choix de trois repas différents a été proposé. La teneur en macronutriments était constante et se situait dans les plages de pourcentage énergétique recommandées : 40 à 50 % de glucides (maximum de 10 % de sucre), 30 à 40 % de matières grasses et 20 à 25 % de protéines. L'apport énergétique quotidien a été individualisé en fonction de l'évolution du poids. Si un patient n'atteignait pas 2% de gain de poids hebdomadaire, le contenu énergétique du menu quotidien était augmenté. Tous les repas étaient suivis d'un repos supervisé variant de 30 à 60 min en position assise. Entre les repos, une activité physique légère telle qu'une marche était autorisée; cependant, aucune forme d'entraînement physique n'était autorisée. Pour les patients ayant un besoin d'exercice excessif ou autrement un manque de respect des règles de comportement, la surveillance du comportement a été étendue et si nécessaire, à 24 h par jour.

Ambulatoires. Les patients AN ont effectué des visites régulières dans des unités de soins ambulatoires où les soins étaient dispensés par une équipe multidisciplinaire composée de médecins, d'infirmières, de psychologues et d'éducateurs en comportement de santé.

Ils ont reçu un régime alimentaire individuel, qui avait la même composition en macronutriments que celle mentionnée ci-dessus pour les patients hospitalisés. Comme pour les patients hospitalisés, tous les patients externes ont également été inscrits à des cours de traitement thérapeutique cognitivo-comportemental.

La taille a été mesurée sur un stadiomètre mural et le poids a été mesuré le matin avant le petit déjeuner sur une balance à plate-forme calibrée. L'IMC a été calculé en divisant le poids par le carré de la taille (=kg/m2).

Des échantillons de sang ont été prélevés le matin après une nuit de jeûne. Les échantillons de sang ont été prélevés sur de la glace et traités pour obtenir du sérum et du plasma, puis stockés à -80 ° C. Les concentrations sériques de sodium, de potassium, d'albumine et de créatinine ont été mesurées par des dosages enzymatiques sur un système Roche/Hitachi cobas c. Les concentrations sériques de cholestérol total, de cholestérol à lipoprotéines de haute densité et de cholestérol à lipoprotéines de basse densité ont été déterminées à l'aide de la méthode de précipitation au chlorure de magnésium à l'acide phosphotungstique. Les taux sériques d'insuline immunoréactive ont été mesurés à l'aide d'un dosage immuno-enzymatique, tandis que la concentration sérique d'alanine aminotransférase a été analysée à l'aide d'une méthode coulométrique enzymatique comprenant l'activation du phosphate de pyridoxal.

L'analyse du ClpB plasmatique a été effectuée comme décrit précédemment55.

Les selles ont été collectées conformément aux directives de l'International Human Microbiome Standards (IHMS) (SOP 03 V1) dans des kits par des cas AN et HC à domicile et immédiatement congelées à -20 ° C jusqu'à ce qu'elles soient transportées sur de la neige carbonique et congelées 4 à 24 h plus tard à -80 ° C dans des tubes en plastique aux biobanques. L'extraction d'ADN à partir d'aliquotes d'échantillons fécaux a été effectuée conformément à la procédure IHMS SOP P7 V256.

Pour le comptage des cellules bactériennes (Fig. 7 supplémentaire), 0, 08 à 0, 12 g d'échantillons fécaux congelés (-80 ° C) ont été dilués 15 fois dans une solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) à pH 7, 2 (Sigma-Aldrich), homogénéisé mécaniquement à l'aide d'un lyseur de tissus (40 min, 12, 5 agitations par seconde; QIAGEN) et fixé avec du paraformaldéhyde à 2% (10 min , température ambiante ; Biotum). Ensuite, les échantillons ont été dilués 120 fois dans un tampon de coloration filtré (EDTA 1 mM, Tween20 0,01 %, DPBS pH 7,2, BSA 1 % (Sigma-Aldrich)). Pour minimiser les amas, les échantillons ont été filtrés à travers un tamis cellulaire (taille des pores 5 μm; pluriSelect), pré-humidifiés dans le tampon de coloration. Ensuite, la suspension de cellules bactériennes a été colorée avec du SYBR Green I (1: 200 000; Thermo Fisher) dans du DMSO (Sigma-Aldrich) et incubée dans l'obscurité pendant 30 min. Pour une détermination précise du nombre de cellules bactériennes, une concentration connue d'eBeads 123count (Invitrogen) a été ajoutée aux échantillons avant l'analyse. Les mesures ont été effectuées à l'aide d'un cytomètre en flux BD Fortessa LSRII (BD Biosciences) et les données ont été acquises à l'aide du logiciel BD FACSDiVaTM. Une valeur seuil de 200 a été appliquée sur le canal FITC (530/30 nm). L'intensité de fluorescence aux canaux de fluorescence verte (530/30 nm, FITC), bleue (450/50 nm, Pacific Blue), jaune (575/26 nm, PE) et rouge (695/40 nm, PerCP-Cy5-5) ainsi que les intensités lumineuses diffusées vers l'avant et latéralement (FSC et SSC) ont été recueillies. Les mesures ont été effectuées à un débit prédéfini de 0,5 μl s-1. Les données ont été traitées dans R à l'aide du package flowcore (v1.11.20)57 dans R (v4.1.2). La stratégie de déclenchement fixe a séparé les événements fluorescents microbiens de l'arrière-plan de l'échantillon fécal.

L'ADN a été quantifié à l'aide de la quantification fluorométrique Qubit (Thermo Fisher) et qualifié à l'aide du profilage de la taille de l'ADN sur un analyseur de fragments (Agilent). De l'ADN de haut poids moléculaire (> 10 kbp; 3 µg) a été utilisé pour construire la banque. Le cisaillement de l'ADN en fragments d'environ 150 pb a été réalisé à l'aide d'un ultrasonateur (Covaris) et la construction de la bibliothèque de fragments d'ADN a été réalisée à l'aide des kits Ion Plus Fragment Library et Ion Xpress Barcode Adapters (Thermo Fisher). Les bibliothèques de fragments d'ADN purifiés et amplifiés ont été séquencées à l'aide du séquenceur Ion Proton (Thermo Fisher), avec un minimum de 20 millions de lectures de haute qualité de 150 pb (en moyenne) générées par bibliothèque.

Pour construire le tableau de comptage des gènes, le logiciel METEOR a été utilisé58 : tout d'abord, les lectures ont été filtrées pour une faible qualité par AlienTrimmer59. Après suppression des lectures de faible qualité et des lectures d'ADN humain, 75,7 % ± 2,7 % de lectures de séquençage métagénomique de haute qualité de l'ADN fécal ont été cartographiées sur le Integrated Gut Catalog 2 (IGC2)60, comprenant 10,4 millions de gènes, à l'aide de Bowtie2 (réf. 61). Les lectures mappées à un gène unique dans le catalogue ont été attribuées à leurs gènes correspondants. Ensuite, les lectures cartographiées avec le même score d'alignement sur plusieurs gènes du catalogue ont été attribuées en fonction du rapport entre leur nombre de cartographies uniques et les gènes capturés. La table de comptage résultante a ensuite été traitée à l'aide du package R MetaOMineR v1.3162. Il a été réduit à 14 millions de lectures cartographiées pour tenir compte des différences de profondeur de séquençage et de taux de cartographie entre les échantillons. Ensuite, la matrice réduite a été normalisée pour la longueur du gène et transformée en une matrice de fréquence par fragments par kilobase de transcription par million de fragments cartographiés normalisation. Le nombre de gènes a été calculé comme le nombre de gènes présents (abondance strictement positive) dans la matrice de fréquence.

IGC2 était auparavant organisé en 1 990 MSP avec MSPminer63 en utilisant un ensemble de données MSP mis à jour accessible au public64. L'abondance relative de MSP a été calculée comme l'abondance moyenne de ses 100 gènes «marqueurs» (c'est-à-dire les gènes qui sont le plus corrélés ensemble). Si moins de 10 % de gènes « marqueurs » étaient observés dans un échantillon, l'abondance du MSP était fixée à 0. Cette approche a été utilisée dans les consortiums MetaHIT62 et Metacardis65. Pour les 4 MSP avec moins de 100 gènes core, tous les gènes core disponibles ont été utilisés.

Les abondances aux rangs taxonomiques supérieurs ont été calculées comme la somme des MSP appartenant à un taxon donné. Le nombre de MSP a été évalué comme le nombre de MSP présents dans un échantillon (c'est-à-dire dont l'abondance est strictement positive). Le profilage des entérotypes a été effectué comme démontré précédemment66.

Les gènes du catalogue IGC2 ont été cartographiés avec du diamant67 sur des orthologues KEGG (KO) de la base de données KEGG68 (v8.9). Chaque gène a été attribué au KO le mieux classé parmi les hits avec une valeur e < 10 × 10−5 et un score de bit > 60. Ensuite, nous avons évalué la présence et l'abondance des GMM28 et GBM29 dans un échantillon métagénomique par le pipeline mis en œuvre dans le package R omixerRpm (v0.3.2) comme décrit précédemment28,29.

Nous avons utilisé le pipeline informatique pour déduire la dynamique de croissance bactérienne intestinale à partir d'échantillons métagénomiques, comme décrit précédemment27. Les lectures de séquençage ont été cartographiées sur une base de données qui contient des références génomiques complètes de 2 991 souches appartenant à 1 509 espèces microbiennes. Pour chaque espèce bactérienne, une souche de référence avec une prévalence de 100 % dans les échantillons a été sélectionnée. Une carte de couverture a ensuite été assemblée sur la base de lectures alignées sur le génome de référence. Les segments génomiques ont été regroupés en régions de 10 kpb et la couverture des bacs résultants a été calculée et lissée. L'emplacement de l'origine et de l'extrémité de la réplication a été prédit par des ajustements de la même souche sur plusieurs échantillons. Enfin, les PTR ont été calculés pour chaque espèce bactérienne dans chaque échantillon en tant que couverture de séquençage lissée de la souche représentative à l'emplacement du pic prévu, divisée par celle à l'emplacement du creux prévu.

Avant la classification des SV, le pipeline avec un algorithme d'attribution de lecture basé sur la couverture itérative a été exécuté pour réattribuer les lectures ambiguës à la référence la plus probable avec une grande précision31,32. Les génomes de référence fournis dans la base de données proGenomes (http://progenomes1.embl.de/) ont été concaténés puis divisés en bacs génomiques de 1 kpb et appliqués pour la détection de segments génomiques hautement variables. Le pipeline SGV-Finder31 a été utilisé pour détecter les SV qui sont soit (1) avec un pourcentage de délétion du segment génomique dans la population de <25 % (SV variables, vSV), (2) avec un pourcentage de délétion entre 25 % et 75 % (délétion SV, dSV ; l'absence ou la présence de ce segment génomique particulier a été conservé) ou (3) avec un pourcentage de délétion > 75 % (ce segment génomique a été exclu de l'analyse). Toutes les espèces bactériennes à appel SV étaient présentes dans au moins 10 % du total des échantillons et ont été utilisées pour une analyse ultérieure.

Le package R « médiation 69 » (v4.5.0) a été utilisé pour déduire les relations causales entre les caractéristiques microbiennes intestinales, les métabolites polaires et liés au microbiote, les traits métaboliques et les scores de troubles de l'alimentation. Pour réduire le nombre de tests, nous n'avons conservé que les groupes de candidats constitués de variables fortement associées entre elles ; c'est-à-dire que pour un groupe causal variable caractéristique microbienne-métabolite-phénotypique candidat, l'association entre la caractéristique microbienne intestinale et le métabolite sérique était significative (Padj < 0,1); l'association entre métabolite et variable phénotypique était significative (Padj < 0,1) ; et l'association entre la caractéristique microbienne et la variable phénotypique était significative (Padj < 0,1). Après avoir effectué une analyse de médiation, seuls les groupes candidats significatifs dans la direction 1 ont été conservés pour la visualisation du diagramme de Sankey.

Nous avons profilé le microbiote intestinal viral à l'aide de MiCoP70, car cette méthode est optimisée pour appeler les virus directement à partir des lectures de séquençage métagénomique en vrac et calculer l'abondance relative dans l'ensemble de données du virome. En tant qu'ensemble de données de référence, MiCoP s'appuie sur la base de données virale RefSeq du NCBI71. Nous avons identifié un total de 209 espèces virales avec une prévalence > et = 10 % et une abondance relative > et = 0,01 % pour 147 (77 AN contre 70 HC) individus inclus dans l'ensemble de données. La richesse, la diversité alpha et beta ont été calculées avec le package R 'fossil'72 et 'vegan'73. Le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon a été utilisé pour déterminer les différences statistiquement significatives dans les indices de richesse et de diversité alpha entre les groupes. Une analyse multivariée permutationnelle de la variance (PERMANOVA) à n = 999 a été réalisée pour la distance de Canberra. Les interactions virales-bactériennes dans les données de microbiome AN-RS et AN-BP ont été calculées à l'aide de l'algorithme Sparse Correlations for Compositional (SparCC)74. Avant l'analyse SparCC, les ensembles de données sur le microbiote bactérien et viral AN étaient sous-ensembles aux ensembles de données AN-RS et AN-BP, qui ont ensuite été soumis séparément pour l'analyse SparCC.

Les métabolites répertoriés comme métabolites liés au microbiote intestinal étaient basés sur l'exploration de la littérature75,76. Les échantillons de sérum ont été randomisés et la préparation des échantillons a été effectuée comme décrit précédemment43,77. En bref, 400 µl de méthanol (MeOH) contenant des standards internes (acide heptadécanoïque, dl-valine marquée au deutérium, acide succinique marqué au deutérium et acide glutamique marqué au deutérium, 1 µg ml-1) ont été ajoutés à 30 µl des échantillons de sérum, qui ont ensuite été mélangés au vortex et incubés sur de la glace pendant 30 min. Les échantillons ont ensuite été centrifugés (9 400 × g, 3 min) et 350 µl du surnageant ont été collectés après centrifugation. Le solvant a été évaporé à sec, 25 µl de réactif MOX ont été ajoutés et l'échantillon a été incubé pendant 60 min à 45 °C. Du N-méthyl-N-(triméthylsilyl)trifluoroacétamide (25 µl) a été ajouté et après 60 min d'incubation à 45 °C, 25 µl du mélange standard d'indice de rétention (n-alcanes, 10 µg ml-1) ont été ajoutés.

Les analyses ont été réalisées à l'aide d'un chromatographe en phase gazeuse Agilent 7890B couplé à un spectromètre de masse à temps de vol quadripolaire Agilent 7200. Les paramètres suivants ont été utilisés : le volume d'injection était de 1 µl avec une répartition 100:1 sur PTV à 70 °C, chauffage à 300 °C à 120 °C min-1 ; colonne : Zebron ZB-SemiVolatiles d'une longueur de 20 m, diamètre interne de 0,18 mm, épaisseur de film de 0,18 µm, avec un débit d'hélium initial de 1,2 ml min-1, augmentant à 2,4 ml min-1 après 16 min. Programme de température du four : 50 °C (5 min), puis à 270 °C à 20 °C min−1 puis à 300 à 40 °C min−1 (5 min). Source EI : 250 °C, énergie électronique 70 eV, émission 35 µA, délai de solvant 3 min. Gamme de masse 55 à 650 amu, taux d'acquisition 5 spectres par seconde, temps d'acquisition 200 ms par spectre. Quad à 150 °C, 1,5 ml min-1 flux de collision N2, température aux-2 280 °C.

Les courbes d'étalonnage ont été construites en utilisant l'alanine, l'acide citrique, l'acide fumarique, l'acide glutamique, la glycine, l'acide lactique, l'acide malique, l'acide 2-hydroxybutyrique, l'acide 3-hydroxybutyrique, l'acide linoléique, l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide stéarique, le cholestérol, le fructose, la glutamine, l'acide indole-3-propionique, l'isoleucine, la leucine, la proline, l'acide succinique, la valine, ainsi que paragine, acide aspartique, acide arachidonique, glycérol-3-phosphate, lysine, méthionine, ornithine, phénylalanine, sérine et thréonine achetés auprès de Sigma-Aldrich à une concentration de 0,1 à 80 μg ml-1. Une aliquote de chaque échantillon a été prélevée, regroupée et utilisée comme échantillons de contrôle qualité, avec un échantillon de sérum CRM1950 du National Institute of Standards and Technology (NIST), un échantillon de sérum regroupé en interne. L'écart-type relatif des concentrations était en moyenne de 16 % pour les échantillons de contrôle de qualité regroupés et de 10 % pour les échantillons du NIST.

La procédure de préparation des échantillons a été effectuée comme décrit précédemment78. La plaque a été préconditionnée avec 450 µl d'acétonitrile avant l'ajout de 100 µl d'échantillon et de 10 µl de mélange d'étalon interne de substances polyfluoroalkylées (PFAS) et d'acides biliaires (BA) (200 ng ml-1 et 1 000 ng ml-1, respectivement). Ensuite, 450 µl d'acétonitrile contenant 1 % d'acide formique ont été ajoutés à chaque puits et les échantillons ont été extraits à l'aide d'un collecteur à vide de 10 pouces. L'éluat a été évaporé à sec sous un courant d'azote gazeux et reconstitué en 80 pl de MeOH/éthanoate d'ammonium aqueux 2 mM.

La séparation chromatographique a été réalisée à l'aide d'une colonne Acquity UPLC BEH C18 (diamètre intérieur 100 mm × 2,1 mm, granulométrie 1,7 µm), équipée d'une précolonne C18 (Waters). La phase mobile A consistait en H2O:MeOH (v/v 70:30) et la phase mobile B en MeOH avec les deux phases contenant 2 mM d'acétate d'ammonium comme agent d'ionisation. Le débit a été fixé à 0,4 ml min-1 avec le gradient d'élution suivant : 0-1,5 min, la phase mobile B a été augmentée de 5 % à 30 % ; 1,5 à 4,5 min, la phase mobile B a été augmentée à 70 % ; 4,5 à 7,5 min, la phase mobile B a été portée à 100 % et maintenue pendant 5,5 min. Un post-temps de 5 min a été utilisé pour retrouver les conditions initiales pour l'analyse suivante. Le temps d'exécution total par échantillon était de 18 min. Les paramètres de la source d'ionisation à double électropulvérisation étaient les suivants : la tension capillaire était de 4,5 kV, la tension de la buse de 1 500 V, la pression de N2 dans le nébuliseur était de 21 psi et le débit et la température de N2 sous forme de gaz de gaine étaient de 11 l min-1 et 379 °C, respectivement. Pour obtenir des spectres de masse précis dans le balayage de spectrométrie de masse (MS), la plage m / z a été définie sur 100 à 1 700 en mode ions négatifs. Le logiciel MassHunter B.06.01 (Agilent) a été utilisé pour toutes les acquisitions de données.

L'identification des composés a été effectuée avec une bibliothèque spectrale interne utilisant MS (et le temps de rétention), des informations de spectrométrie de masse en tandem. La quantification était basée sur une courbe d'étalonnage appariée à la matrice dopée avec des composés natifs. La courbe d'étalonnage consistait en des concentrations allant de 0 à 1 600 ng ml-1 pour les BA. L'écart type relatif pour les BA était en moyenne de 17,8 % pour les échantillons de contrôle qualité et de 19,4 % pour les échantillons NIST.

Les protocoles animaux ont été approuvés par les comités d'éthique scientifique de la région capitale de Copenhague, au Danemark. Des souris femelles sans germe Swiss Webster ont été élevées et maintenues dans des isolateurs gnotobiotiques à film flexible jusqu'au début des expériences au Département de médecine expérimentale de l'Université de Copenhague. Les souris ont été nourries avec un régime alimentaire autoclavé (7 % de sucres simples, 3 % de matières grasses, 50 % de polysaccharides, 15 % de protéines (p/p), énergie 3,5 kcal g-1) et de l'eau à volonté sous un cycle de 12 h de lumière/12 h d'obscurité (lumière allumée à 7h30) et à température (21-22 °C) et humidité (55 ± 5 %).

Des échantillons fécaux provenant de sous-groupes sélectionnés au hasard de trois patients atteints d'AN (femmes âgées de 20, 22 et 20 ans avec un IMC de 10,3, 11,5 et 11,7 kg m-2, respectivement) et de trois HC (femmes âgées de 20, 22 et 21 ans avec un IMC de 22,6, 21,1 et 21,2 kg m-2, respectivement) qui étaient des représentants des cas et des témoins ont été utilisés pour coloniser les femelles GF de 6 semaines. Brièvement, 250 mg d'échantillons fécaux ont été mis en suspension avec 5 ml de milieu LYBHI (complété avec 0, 05% de cystéine et 0, 2% d'hémine comme agents réducteurs) dilué dans 20% de glycérol (20 ml g-1 de fèces) dans un cryovial anaérobie; ces échantillons d'inoculum ont ensuite été vortexés pendant 5 min, suivis de 5 min de repos pour précipiter les particules. Les boues fécales ont ensuite été transférées dans des cryovials de 1 ml et immédiatement congelées à -80 ° C. Au premier jour, les deux groupes de souris ont été logés dans des cages autoclavées ventilées individuellement où ils ont reçu la première dose (200 µl) de boues fécales. Les souris ont ensuite reçu un régime alimentaire autoclavé et de l'eau à volonté pendant 2 jours et leur consommation de nourriture a été enregistrée. Au jour 3, les souris ont été gavées avec une deuxième dose de matières fécales provenant des mêmes donneurs d'AN et de HC appariés qu'auparavant. Par la suite, les souris des deux groupes ont été logées individuellement et soumises à un régime alimentaire autoclavé à 30 % d'énergie (la quantité de nourriture donnée a été fixée à 70 % de l'apport alimentaire ad libitum pour chaque souris) pendant 3 semaines où de l'eau a été donnée ad libitum. Les souris transplantées anorexiques (AN-T) et les souris normales transplantées témoins (HC-T) ont été pesées tous les 5 jours après le début du régime hypocalorique.

À la fin de l'étude, les souris ont été anesthésiées à l'isoflurane et le sang de la veine cave a été recueilli dans des tubes contenant de l'EDTA. Les échantillons de sang ont été centrifugés pendant 6 min à 4 032 g à 4 °C. Le plasma a été isolé et stocké à -80 ° C pour des tests biochimiques ultérieurs. Le tissu adipeux blanc sous-cutané inguinal, le caecum et l'hypothalamus de chaque souris ont été précisément disséqués et collectés pour une analyse PCR quantitative. Aucun animal ou point de données n'a été exclu de la présente étude.

L'ARN total a été extrait des tissus à l'aide du réactif Trizol (Invitrogen) conformément aux instructions du fabricant, suivi d'une mesure de la concentration. Un µg d'ARN a été transcrit en ADN complémentaire en utilisant le système de transcription inverse (Promega). La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide du système de détection LC480 (Roche Diagnostics) et du SYBR Green I Supermix (Takara). Tous les qPCR ont été exécutés sur les cycles thermiques à 95 ° C pendant 10 min, suivis de 45 cycles de 0, 01 s à 95 ° C et de 20 s à 60 ° C. Les données ont été normalisées par rapport au gène domestique Rpl36 pour le tissu adipeux et au gène Rplp079 pour l'hypothalamus et analysées selon la méthode delta-delta CT. Les séquences d'oligonucléotides utilisées dans cette étude sont fournies dans le tableau supplémentaire 8.

Les ADN microbiens ont été isolés et purifiés à partir d'échantillons de selles (~ 250 mg) de donneurs humains et de receveurs de souris à l'aide du mini kit de sol NucleoSpin (MACHEREY-NAGEL). L'ADN a ensuite été amplifié à l'aide du mélange maître PCR haute fidélité Phusion (New England Biolabs) par PCR ciblant la région V3-V4 du gène de l'ARNr 16S (séquences d'amorce fournies dans le tableau supplémentaire 8). Le programme PCR suivant a été utilisé : 98 °C pendant 30 s, 25 × (98 °C pendant 10 s, 55 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 20 s), 72 °C pendant 5 min. L'amplification a été vérifiée en faisant passer les produits sur un gel d'agarose. Des indices ont été ajoutés dans une PCR ultérieure à l'aide d'un kit Illumina Nextera avec le programme PCR suivant : 98 °C pendant 30 s, 8 × (98 °C pendant 10 s, 55 °C pendant 20 s, 72 °C pendant 20 s), 72 °C pendant 5 min. La fixation des indices a été vérifiée en faisant passer les produits sur un gel d'agarose. Les produits de la PCR nichée ont été regroupés sur la base de l'intensité de la bande et la bibliothèque résultante a été nettoyée avec des billes magnétiques. La concentration d'ADN des bibliothèques regroupées a été mesurée par fluorimétrie. Le séquençage a été effectué sur un séquenceur de bureau Illumina MiSeq à l'aide du kit de réactifs MiSeq V3 (Illumina) pour un séquençage apparié de 2 × 300 pb. Les lectures appariées ont ensuite été découpées, fusionnées et analysées à l'aide du pipeline DADA2 (v1.16.0)80.

Aucune donnée n'a été exclue avant l'analyse statistique dans la présente étude. Aucune répartition ni randomisation n'ont été incluses car l'étude est observationnelle. Cette étude inclut tous les échantillons disponibles (n = 147) de patients souffrant d'anorexie et d'individus sains. Bien qu'aucune méthode statistique n'ait été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, nos tailles d'échantillon sont similaires à celles rapportées dans les publications précédentes43,81. Les échantillons ont été répartis au hasard entre les lots de métagénomique et de métabolomique. Les enquêteurs ont été aveuglés à l'attribution des groupes lors de la collecte de données dans les analyses métagénomiques, biochimiques et métabolomiques. Toutes les analyses d'échantillons humains ont été effectuées à l'aide de R (v4.1.2). Les analyses d'expression génique et les comparaisons de poids corporel pour les études animales ont été effectuées à l'aide de GraphPad Prism (v9.3.0).

Analyse différentielle

Nous avons effectué l'analyse différentielle à l'aide du pipeline metadeconfoundR mis en œuvre dans le package R metadeconfoundR (v0.1.8 ; voir https://github.com/TillBirkner/metadeconfoundR ou https://doi.org/10.5281/zenodo.4721078) où nous avons évalué dans quelle mesure les différences observées entre les participants AN et HC dans les analyses du microbiome ou du métabolome sont confondues par des covariables telles que l'âge, l'IMC, le tabagisme et les médicaments. . Ce pipeline a initialement utilisé des statistiques univariées pour trouver des associations entre les caractéristiques du microbiome et l'état de la maladie, suivies de tests post hoc de comparaison de modèles linéaires imbriqués pour vérifier les effets de confusion des covariables potentielles et enfin, renvoyer une étiquette d'état.

Analyse des associations

Pour l'analyse d'association et de médiation entre les caractéristiques omiques et le comportement alimentaire et les traits psychologiques au sein du groupe AN, nous avons d'abord vérifié la normalité des variables continues avec le test de normalité de Shapiro-Wilk, trouvant que la plupart des variables n'étaient pas normalement distribuées. Par conséquent, avant l'analyse d'association, nous avons standardisé les variables continues en utilisant une transformation quantile normale empirique pour suivre une distribution normale standard (N ~ (0, 1)). Ensuite, nous avons mis en œuvre un modèle de régression linéaire pour évaluer les associations entre les caractéristiques omiques et le comportement alimentaire et les traits psychologiques en utilisant la formule suivante où des facteurs de confusion ont été ajoutés en tant que covariables.

Les médicaments comprenaient des inhibiteurs sélectifs de la recapture de la sérotonine, des antipsychotiques et des benzodiazépines.

Pour l'analyse d'association entre les caractéristiques omiques et les traits métaboliques de l'hôte, une vérification de la normalité et une normalisation des données ont également été effectuées avant l'analyse de régression linéaire. Dans le modèle de régression linéaire, les facteurs de confusion mentionnés ci-dessus ont été inclus en tant que covariables, à l'exception de l'IMC, car l'IMC extrêmement bas est le changement phénotypique le plus remarquable pour les patients AN par rapport aux individus HC.

Les différences de diversité microbienne intestinale (richesse en gènes, nombre d'espèces, composition taxonomique) entre AN et HC ont été calculées à l'aide des tests de Wilcoxon, et le test de Kruskal-Wallis a été utilisé pour évaluer l'importance des différences entre plusieurs groupes. Sauf indication contraire, toutes les valeurs P ont été corrigées à l'aide de la méthode Benjamini-Hochberg et Padj < 0,05 a été considéré comme statistiquement significatif.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données cliniques anonymisées qui sont stockées dans Sharepoint via Odense Patient Data Explorative (fichier no OP_153) peuvent être consultées en contactant [email protected] ou peuvent être trouvées dans le tableau supplémentaire 2. , respectivement. Les données de métabolomique sont disponibles dans le référentiel Metabolomics Workbench sous le lien https://doi.org/10.21228/M8KT5B. La base de données KEGG est disponible sur https://www.genome.jp/kegg/. Les données sources sont fournies avec ce document.

Les codes associés à l'analyse et à la visualisation des données sont disponibles sur https://github.com/fjw536/AnorexiaGutMicrobiome.git.

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YF a reçu la bourse individuelle Marie Skłodowska-Curie (797267) dédiée à la présente étude. Le Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research est une institution de recherche indépendante de l'Université de Copenhague, partiellement financée par un don sans restriction de la Novo Nordisk Foundation. RKS a été soutenu par le Fonds de recherche de l'hôpital universitaire d'Odense (R15-A800).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yong Fan, René Støving, Samar Berreira Ibraim.

Novo Nordisk Foundation Center for Basic Metabolic Research, Faculté de la santé et des sciences médicales, Université de Copenhague, Copenhague, Danemark

Yong Fan, Tulika Arora, Liwei Lyu, Evelina Stankevic, Tue Haldor Hansen, Fredrik Backhed et Oluf Pedersen

Center for Eating Disorders, Odense University Hospital, and Research Unit for Medical Endocrinology, Mental Health Services in the Region of Southern Denmark, Open Patient data Explorative Network (OPEN) and Clinical Institute, University of Southern Denmark, Odense, Danemark

René Klinkby Støving

Université Paris-Saclay, INRAE, MGP, Jouy-en-Josas, France

Samar Berreira Ibraim, Florence Thirion, Nicolas Pons, Nathalie Galleron, Benoît Quinquis, Florence Levenez, Hugo Roume & S. Dusko Ehrlich

École des sciences et de la technologie, Université d'Örebro, Örebro, Suède

Tuulia Hyötyläinen, Tim Sinioja & Oddny Ragnarsdottir

Département de médecine, Université de Copenhague et Hôpital universitaire Herlev-Gentofte, Copenhague, Danemark

Liwei Lyu et Oluf Pedersen

Unité de recherche INSERM U1073 et TargEDys, Université de Rouen, Rouen, France

Pierre Déchelotte

Laboratoire de bactériologie moléculaire, Département de microbiologie et d'immunologie, Institut Rega Ku Leuven, Louvain, Belgique

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva et Jeroen Raes

Centre de microbiologie, VIB, Louvain, Belgique

Gwen Falony, Sara Vieira-Silva et Jeroen Raes

Institut de microbiologie médicale et d'hygiène et centre de recherche en immunothérapie (FZI), Centre médical universitaire de l'Université Johannes Gutenberg de Mayence, Mayence, Allemagne

Gwen Falony & Sara Vieira-Silva

Institut de biologie moléculaire (IMB), Mayence, Allemagne

Gwen Falony & Sara Vieira-Silva

Département de psychiatrie de l'enfant et de l'adolescent, Hôpital universitaire d'Aarhus, Aarhus, Danemark

Très Clausen

Département de médecine clinique, Faculté de santé, Université d'Aarhus, Aarhus, Danemark

Très Clausen

Unité de recherche psychiatrique, Hôpital universitaire d'Aalborg, Aalborg, Danemark

Kjaersdam Telleus Jeux

Département de communication et de psychologie, Faculté des sciences sociales et humaines, Université d'Aalborg, Aalborg, Danemark

Kjaersdam Telleus Jeux

Laboratoire Wallenberg, Département de médecine moléculaire et clinique, Institut de médecine, Académie Sahlgrenska, Université de Göteborg, Göteborg, Suède

Fredrik Bäckhed

Département de physiologie clinique, Hôpital universitaire Sahlgrenska, Région Västra Götaland, Göteborg, Suède

Fredrik Bäckhed

École des sciences médicales, Université d'Örebro, Örebro, Suède

Matej Oresic

Turku Bioscience Centre, Université de Turku et Université Åbo Akademi, Turku, Finlande

Matej Oresic

Département des neurosciences cliniques et du mouvement, University College London, Londres, Royaume-Uni

S. Dusko Ehrlich

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OP a conçu et conçu le concept de l'étude, détaillé le protocole et supervisé toutes les phases du protocole de l'étude, y compris la rédaction du papier. YF, RKS, SBI et FT ont effectué l'analyse des données, interprété les résultats et contribué à la rédaction du document. TH, TS et OR ont soutenu le profilage du métabolome. YF a conçu et entrepris toutes les expériences sur les animaux avec le soutien de TA et LLLL et ES a effectué le comptage des cellules bactériennes. RKS et THH ont effectué le phénotypage des participants à l'étude. PD, NP, NG, BQ, FL, HR, GF, SV-S., JR, LC, GKT, FB, MO et SDE ont contribué au développement et à la supervision techniques du projet et ont révisé les versions préliminaires du document. Tous les auteurs ont contribué à la révision et à l'édition de l'article.

Correspondance à Oluf Pedersen.

FB est actionnaire d'Implexion Pharma. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Microbiology remercie Tom Hildebrandt et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Le flux de travail a été créé avec BioRender.com.

a,b,e Boîte à moustaches (ligne, médiane ; boîte, intervalle interquartile (IQR) ; moustaches, 1,5 × IQR) de comparaison entre AN (or, n = 77) et HC (bleu, n = 70) de l'abondance relative des 12 phylums bactériens détectés chez au moins 10 % des individus (a), les 20 familles bactériennes les plus abondantes (b) et les 30 premiers genres (e). Les entités sont triées par abondance moyenne décroissante. Les valeurs zéro sont définies sur 1e-10. Les éléments colorés en bleu sont enrichis en groupe HC et l'or est enrichi en groupe AN. La signification a été déterminée par un test de somme de rang Wilcoxon bilatéral, suivi d'une déconfusion médicamenteuse et d'une correction de tests multiples par la méthode Benjamini-Hochberg sur toutes les caractéristiques (a, b et e, voir les données sources pour les valeurs p exactes). c, f, Valeurs absolues de la taille de l'effet Delta de Cliff des familles (c) et des genres (f) contrastées entre AN et HC après déconfusion médicamenteuse (valeur p ajustée ≤ 0,1). Les diagrammes à barres dorés indiquent des caractéristiques plus abondantes dans AN ; les barplots bleus indiquent des caractéristiques plus abondantes dans HC (c,f). d,g, Box plot (ligne, médiane ; boîte, IQR ; moustaches, 1,5 × IQR) montrant la diversité β (distance de Canberra) du bactériome intestinal au niveau du genre (d) et la richesse des pan-génomes d'espèces métagénomiques (MSP) (g) entre AN (or, n = 77) et HC (bleu, n = 70). La signification a été déterminée par le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon (d, g). h, le panneau supérieur montre la prévalence de l'entérotype chez les patients AN (n = 77) et HC (n = 70), le panneau inférieur montre la prévalence de l'entérotype chez les patients HC et AN divisés en groupes AN-RS (n = 56) et AN-BP (n = 21).

Données source

La taille et la couleur des nœuds représentent respectivement l'abondance moyenne et le genre d'un MSP donné. Les genres représentés par un seul MSP sont colorés en gris. Les lignes rouges et bleues indiquent respectivement des corrélations positives et négatives. L'épaisseur de la ligne représente le coefficient de corrélation absolu. Seules les corrélations avec un coefficient absolu supérieur à 0,4 sont présentées ; Les MSP sans aucune corrélation au-dessus du seuil sont masqués.

Les variables de l'échelle spécifique des troubles de l'alimentation sont marquées en bleu et celles de l'échelle psychologique générale sont marquées en rouge. +, p ajusté < 0,05 (voir les données sources pour les valeurs p exactes).

Données source

a, Abondance relative de la famille des Enterobacteriaceae dans les groupes HC (n = 70) et AN (n = 77). b, Concentration de ClpB plasmatique à jeun transformée à l'échelle logarithmique entre les groupes HC (n = 70) et AN (n = 77). c, Concentration de ClpB plasmatique à jeun transformée à l'échelle logarithmique entre les sous-types AN restrictifs (AN-RS n = 56) et AN à purge excessive (AN-BP n = 21). La signification a été calculée par le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon entre deux groupes (ac). Les boîtes à moustaches indiquent l'intervalle médian et interquartile (IQR) et les moustaches représentent 1,5 × IQR (ac).

Données source

Les boîtes à moustaches indiquent la médiane et l'intervalle interquartile (IQR), les moustaches indiquent 1,5 × IQR. La signification a été déterminée par le test bilatéral de somme des rangs de Wilcoxon.

Données source

ac, diagramme de dispersion montrant, HOMA-IR, l'insuline plasmatique à jeun et la glycémie chez des individus présentant une variation de 1 kpb dans le génome d'A. putredinis (n = 147). Signification déterminée par le test de corrélation de Spearman bilatéral corrigé par le taux de fausses découvertes à l'aide de la méthode de Benjamini et Hochberg. La bande d'erreur est une ligne de régression linéaire avec une bande de confiance à 95 % (ac). Les points représentant les individus AN et HC ont été colorés respectivement en rouge et bleu. d, Panneau supérieur, variabilité standardisée (axe y) le long d'une région génomique d'A. putredinis (axe x). Panneau inférieur, emplacements (barre bleue) du gène d'intérêt.

Données source

a, Courbe d'analyse en composantes principales (PCA) du métabolome sérique des sous-types d'AN, AN-BP (anorexie excessive/purge), AN-RS (anorexie restrictive). b, Résumé du nombre de relations de médiation déduites pour la direction 1 (caractéristiques microbiennes intestinales → scores de troubles de l'alimentation médiés par les métabolites sériques), direction 2 (caractéristiques microbiennes intestinales → métabolites sériques médiés par les scores de troubles alimentaires). c, Résumé du nombre de relations de médiation déduites pour la direction 1 (caractéristiques microbiennes intestinales → phénotypes médiés par les métabolites sériques), direction 2 (caractéristiques microbiennes intestinales → métabolites sériques médiés par les phénotypes) pour l'ensemble de la cohorte. d, diagramme de Sankey montrant le réseau de relations causales inférées de la direction 1 où les caractéristiques microbiennes intestinales, y compris les espèces bactériennes, le cerveau intestinal et les modules métaboliques, et la génétique bactérienne ont été traitées comme des facteurs causaux, les métabolites sériques sont des médiateurs et les traits métaboliques sont des résultats. e, Exemples de relations causales inférées entre les caractéristiques microbiennes intestinales, les métabolites et les traits métaboliques de l'hôte. La direction 1 qui signifie les caractéristiques microbiennes → les traits métaboliques médiés par les métabolites sériques est illustrée par une ligne noire tandis que la direction 2 qui signifie les caractéristiques microbiennes → les métabolites sériques médiés par les traits métaboliques est illustrée par une ligne rouge stipulée. La proportion de l'effet de médiation est indiquée au centre des diagrammes circulaires. GDCA, acide glycodésoxycholique; GHCA, acide glycohyocholique ; GHDCA, acide glycohyodésoxycholique ; GUDCA, acide glycoursodésoxycholique; HCA, acide hyocholique ; Évaluation du modèle homéostatique HOMA-IR de la résistance à l'insuline ; P-, plasma ; S-, sérum.

Données source

a, Workflow pour la préparation du lisier de microbiote fécal. Les selles (250 mg) provenant à la fois de l'anorexie (AN) et du témoin (HC) ont été coupées sur de la neige carbonique, transférées dans une chambre anaérobie et remises en suspension avec 5 ml de milieu LYBHI dilué dans 20% de glycérol. Les boues fécales remises en suspension ont été aliquotées dans des cryotubes et recongelées rapidement à -80 ° C jusqu'à une utilisation ultérieure. Tous les échantillons de selles de donneurs AN et HC appariés ont été préparés le même jour et des aliquotes congelées ont été conservées congelées pour gavage aux souris. b, schéma expérimental pour l'étude de transplantation de souris GF. Dans chaque étude de portée indépendante, des femelles GF de la même portée à l'âge de six semaines ont été retirées de l'isolateur de reproduction et ont été assignées au hasard pour recevoir 200 µl de boues fécales de trois cas AN ou de trois sujets HC. Les deux groupes de souris ont été logés dans des cages autoclavées ventilées individuellement et ont reçu un régime alimentaire autoclavé et de l'eau à volonté pendant deux jours. Après deux jours, les souris ont été gavées avec une deuxième dose de matières fécales provenant des mêmes donneurs d'AN et de HC appariés qu'auparavant. Par la suite, les souris des deux groupes ont été hébergées individuellement et soumises à un régime alimentaire restreint à 30 % de calories pendant trois semaines. L'eau a été donnée à volonté pendant cette période. Les souris anorexiques transplantées (AN-T) et les souris normales transplantées témoins (HC-T) ont été pesées tous les cinq jours après le début du régime hypocalorique. Créé avec Biorender.com.

a, Changement de poids corporel et pourcentage de graisse de souris sans germe (GF) (n = 21) nourries avec un régime alimentaire ad libitum et transplantées avec le microbiote de patients anorexiques. b, Changement de poids corporel par rapport au poids corporel au jour 0 après un régime hypocalorique pour trois expériences indépendantes (n = 8, 6 et 6 pour des lots indépendants, respectivement). Les données sont exprimées en moyenne ± sem(a,b). La signification a été calculée par une analyse de variance à deux voies (ANOVA), suivie d'un test post hoc de Benjamini-Hochberg. c, profil du métabolome sérique chez les donneurs humains et les receveurs de souris GF nourris avec un régime hypocalorique à 30 %. Les données ont été exprimées sous forme de changements de pli transformés en log2 (log2FC) entre les groupes AN et témoin. Des valeurs log2FC positives indiquent des métabolites enrichis en AN, tandis que des valeurs log2FC négatives indiquent des métabolites enrichis en HC. Les métabolites sériques qui ont été modifiés de manière persistante entre les groupes AN et HC chez les donneurs humains et les receveurs de souris GF ont été marqués de barres bleues. CA, acide cholique ; DCA, acide désoxycholique ; FFA, acide gras libre ; w/a-MCA, acide ω/α-muricholique; HDCA, acide hyodésoxycholique ; TaMCA, acide taurine-α-muricholique; CDCA, acide chénodésoxycholique; LCA, acide lithocholique ; UDCA, acide ursodésoxycholique; G, acides biliaires conjugués à la glycine ; T, acides biliaires conjugués à la taurine. d, carte thermique sur le panneau de gauche montrant la corrélation entre les ASV et les gènes quantifiés dans l'hypothalamus ou le tissu adipeux blanc sous-cutané. Les informations taxonomiques des ASV sont données sur le panneau de droite. +, p < 0,05 corrigé par la méthode Benjamini-Hochberg (voir Source Data pour les valeurs p exactes).

Données source

Notes supplémentaires, fig. 1–7 et Références.

Tableaux supplémentaires 1 à 8.

Données sources pour les figures supplémentaires. 1–6.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

Données sources statistiques.

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Réimpressions et autorisations

Fan, Y., Støving, RK, Berreira Ibraim, S. et al. Le microbiote intestinal contribue à la pathogenèse de l'anorexie mentale chez l'homme et la souris. Nat Microbiol 8, 787–802 (2023). https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Reçu : 23 juin 2022

Accepté : 03 mars 2023

Publié: 17 avril 2023

Date d'émission : Mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41564-023-01355-5

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Microbiologie de la nature (2023)