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Oct 23, 2023

Une voie aérienne

Nature tome 615, pages

Nature volume 615, pages 660–667 (2023)Citer cet article

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L'infection pathogène provoque un état de maladie stéréotypé qui implique des changements comportementaux et physiologiques orchestrés de manière neuronale1,2. Lors de l'infection, les cellules immunitaires libèrent une «tempête» de cytokines et d'autres médiateurs, dont beaucoup sont détectés par les neurones3,4; Pourtant, les circuits neuronaux répondants et les mécanismes d'interaction neuro-immunitaires qui évoquent le comportement de la maladie lors d'infections naturalistes restent flous. Les médicaments en vente libre tels que l'aspirine et l'ibuprofène sont largement utilisés pour soulager la maladie et agissent en bloquant la synthèse de la prostaglandine E2 (PGE2)5. Un modèle phare est que la PGE2 traverse la barrière hémato-encéphalique et engage directement les neurones hypothalamiques2. Ici, en utilisant des outils génétiques qui couvrent largement un atlas des neurones sensoriels périphériques, nous avons plutôt identifié une petite population de neurones sensoriels glossopharyngés détectant la PGE2 (neurones pétrosaux GABRA1) qui sont essentiels pour le comportement de maladie induit par la grippe chez la souris. L'ablation des neurones pétrosaux GABRA1 ou l'inactivation ciblée du récepteur PGE2 3 (EP3) dans ces neurones élimine les diminutions induites par la grippe de l'apport alimentaire, de l'apport en eau et de la mobilité au cours de l'infection à un stade précoce et améliore la survie. La cartographie anatomique génétiquement guidée a révélé que les neurones pétrosaux GABRA1 se projettent dans les régions muqueuses du nasopharynx avec une expression accrue de la cyclooxygénase-2 après l'infection, et affichent également un schéma de ciblage axonal spécifique dans le tronc cérébral. Ensemble, ces résultats révèlent une voie sensorielle primaire des voies respiratoires au cerveau qui détecte les prostaglandines produites localement et médie les réponses systémiques de la maladie à l'infection par le virus respiratoire.

Les infections respiratoires causées par la grippe et d'autres agents pathogènes sont les principales causes de décès et d'hospitalisation dans le monde6, et la récente pandémie de COVID-19 a largement perturbé la société humaine. Se sentir malade peut être profondément débilitant et la plupart des gens sont malades plusieurs fois par an. La sensation de malaise représente une réponse neuronale à l'infection qui peut fournir une stratégie hautement coordonnée et adaptative pour favoriser la guérison1,2. Les animaux infectés par divers agents pathogènes présentent des réponses comportementales et physiologiques communes qui peuvent inclure de la fièvre, de la léthargie, une perte d'appétit, des maux de tête et des douleurs, des changements d'humeur et une diminution de la socialisation, suggérant un état de maladie commun impliquant des circuits neuronaux partagés2,7. En plus des symptômes courants, d'autres réponses à la maladie sont adaptées au site de l'infection; par exemple, certaines infections respiratoires provoquent une toux, une congestion et une bronchoconstriction, tandis que certaines infections intestinales provoquent des nausées, de la diarrhée et des vomissements. Les réponses comportementales spécifiques à l'infection suggèrent de multiples voies de communication corps-cerveau pour la détection des agents pathogènes.

Plusieurs cytokines et médiateurs immunitaires peuvent induire un comportement pathologique lorsqu'ils sont administrés isolément, notamment les interleukines, les interférons, le facteur de nécrose tumorale (TNF) et les eicosanoïdes1,2,4,8. Ces cytokines et d'autres, ainsi que des facteurs dérivés d'agents pathogènes tels que les lipopolysaccharides, les toxines bactériennes et les peptides formyl, peuvent activer un assortiment de neurones sensoriels centraux et/ou périphériques4,9. Ensemble, ces observations soulèvent la possibilité qu'il existe de nombreuses voies de diaphonie neuro-immune, bien qu'il ne soit pas clair quand ou si chacune de ces voies est engagée lors d'infections naturalistes.

Des produits chimiques tels que l'acide salicylique de l'écorce de saule, l'aspirine et l'ibuprofène bloquent la biosynthèse des principaux médiateurs lipidiques induits par l'infection par l'inhibition des enzymes cyclooxygénases et ont fourni une approche historiquement efficace pour gérer les symptômes de la maladie5,10. La prostaglandine E2 (PGE2) est un métabolite clé dépendant de la cyclooxygénase qui évoque un comportement de maladie, et l'inactivation d'autres enzymes en aval de la cyclooxygénase dans la voie de biosynthèse de la PGE2 améliore également les réponses à la maladie11. La PGE2 est détectée par une petite sous-famille de 4 récepteurs couplés aux protéines G (EP1–EP4)12, et on pense que certaines réponses de maladie induites par les pyrogènes, mais pas toutes, sont médiées par le récepteur EP32. Le récepteur EP3 est exprimé dans diverses régions du cerveau, y compris l'hypothalamus et les organes circumventriculaires ainsi que les neurones périphériques, les cellules immunitaires et de nombreux autres types de cellules12,13. L'inactivation spécifique à la région du récepteur EP3 dans le noyau préoptique médian (MnPO) de l'hypothalamus a diminué les réponses fébriles induites par les lipopolysaccharides14, les récepteurs PGE2 dans d'autres zones étant apparemment pertinents pour les effets sur l'éveil et l'alimentation2. Ces découvertes et d'autres ont conduit à plusieurs modèles possibles dans lesquels (1) la PGE2 peut traverser directement la barrière hémato-encéphalique en raison de son hydrophobicité, (2) la PGE2 peut être détectée ou pénétrer dans le cerveau au niveau des organes circumventriculaires, et/ou (3) la PGE2 peut être synthétisée dans le cerveau lui-même2,15,16. La PGE2 centrale pourrait alors activer un réseau neuronal distribué, avec différentes régions cérébrales réceptives telles que le MnPO évoquant des aspects particuliers d'une réponse caractéristique à la maladie17.

Les rôles des récepteurs de la prostaglandine dans les neurones périphériques sont restés flous et, en outre, nous avons estimé que l'application exogène de pyrogènes définis chimiquement pouvait produire une réponse inflammatoire systémique, alors que des infections naturelles à différents endroits et d'intensités variables pouvaient à la place déclencher des voies de réponse neuro-immunitaires locales qui sont restées inexplorées.

Nous avons développé un modèle de souris pour caractériser les mécanismes neuronaux sous-jacents au comportement de maladie induit par la grippe. Les souris ont été infectées par administration intranasale du virus de la grippe A PR/8/34 (H1N1) et surveillées pour les réponses caractéristiques à la maladie au cours des 10 à 20 jours suivants. L'infection grippale a diminué la consommation de nourriture, la consommation d'eau, la locomotion, le poids corporel et la survie chez les souris de type sauvage. Des titres plus élevés d'inoculum viral ont augmenté l'étendue du comportement pathologique, les phénotypes les plus graves apparaissant six à sept jours après l'infection (Fig. 1a). L'infection grippale a augmenté les niveaux de PGE2 dans le plasma et le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BALF) sur une période similaire, telle que mesurée par immunoessai enzymatique (ELISA) (données étendues Fig. 1b). L'administration de PGE2 a également inhibé de manière aiguë l'apport alimentaire (données étendues Fig. 2a) et les mesures de photométrie des fibres ont montré une diminution de l'activité des neurones hypothalamiques exprimant le peptide lié à l'agouti (AGRP) (données étendues Fig. 2c), ce qui correspond à une diminution de la motivation à manger, plutôt qu'une simple incapacité physique à manger. Nous avons également observé une réponse hypothermique à l'infection grippale (Extended Data Fig. 3a), cohérente avec les observations précédentes chez la souris18. L'administration d'ibuprofène (1 mg ml-1 dans l'eau de boisson, ad libitum) ou d'aspirine (20 mg kg-1, injection intrapéritonéale quotidienne) à des souris infectées par la grippe a diminué les taux plasmatiques de PGE2, rétabli l'alimentation, la consommation d'eau et le poids corporel, et favorisé la survie à l'infection (Fig. 1b et Extended Data Figs. 1b et 3b). Les souris traitées à l'ibuprofène et à l'aspirine ont conservé de faibles diminutions de l'alimentation, de la boisson et de la motilité sans élévation de la PGE2, ce qui soulève la possibilité que d'autres voies de communication neuro-immunitaires puissent également contribuer aux réponses comportementales. Pourtant, l'ibuprofène et l'aspirine ont considérablement réduit le comportement de maladie induit par la grippe, ce qui correspond au rôle clé des métabolites de la cyclooxygénase-2 dans la diaphonie neuro-immune.

a, Des souris ont été infectées par voie intranasale avec 25 μl de virus de la grippe A à dose faible (105 EID50 ml-1), moyenne (106 EID50 ml-1) ou élevée (107 EID50 ml-1) et la prise alimentaire, la prise d'eau, la motilité et le poids corporel ont ensuite été surveillés quotidiennement. L'EID50 est la dose infectieuse à 50 % des œufs. Les données sont moyennes ± sem ; n = 6 souris par groupe. ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Dunnett par rapport au contrôle du véhicule. Apport alimentaire : P = 0,0048 (faible), P < 0,0001 (moyen), P < 0,0001 (élevé). Consommation d'eau : P = 0,8185 (faible), P < 0,0001 (moyen), P < 0,0001 (élevé). Motilité : P = 0,5231 (faible), P < 0,0001 (moyen), P < 0,0001 (élevé). Poids corporel : P = 0,0002 (faible), P < 0,0001 (moyen), P < 0,0001 (élevé). Survie : P = 0,3173 (faible), P = 0,0185 (moyen), P = 0,0007 (élevé). b, Les souris ont été infectées par le virus de la grippe A (toutes les infections sont avec 106 EID50 ml-1 sauf indication contraire), ont reçu de l'eau potable avec ou sans 1 mg ml-1 d'ibuprofène et ont été surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 6 souris par groupe. Apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P = 0,0001 ; motilité : P = 0,0001 ; poids corporel : P < 0,0001 ; survie : P = 0,0295. c, Des souris ont été infectées par le virus de la grippe A, injectées quotidiennement (injection intrapéritonéale, 1 mg kg-1) avec des antagonistes pour EP1 (SC-51322), EP2 (PF-04418948), EP3 (DG-041) ou EP4 (ONO-AE3-208), ou véhicule seul, et surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 10 souris pour les groupes véhicules ; n = 8 souris pour tous les autres. Pour antagoniste EP3 - apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P = 0,0002 ; survie : P = 0,0094. b, c, test t bilatéral non apparié, avec des comparaisons entre les groupes traités avec l'ibuprofène ou un antagoniste de l'EP3 et le véhicule en c. Test du log-rank (Mantel-Cox) pour les analyses de survie ; pour les changements comportementaux ou physiologiques, un changement quotidien moyen de comportement (jours 1 à 10 après l'infection ou la survie) a été obtenu pour chaque souris, puis utilisé pour des comparaisons entre les groupes expérimentaux (pour plus d'informations, voir Extended Data Fig. 1a). *P < 0,05, **P < 0,005, ***P<0,0005 ; NS, non significatif.

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Des rôles pour de multiples récepteurs de prostaglandines ont été proposés dans les comportements de maladie2,19. Nous avons administré quotidiennement des antagonistes sélectifs pour chaque récepteur PGE2 après une infection grippale et mesuré différents aspects du comportement face à la maladie. L'antagoniste du récepteur EP3 DG-041 a efficacement bloqué la maladie induite par la grippe dans chaque paramètre mesuré et a également favorisé la survie (Fig. 1c), avec une ampleur d'effet similaire à celle de l'ibuprofène et de l'aspirine. En revanche, l'antagonisme des récepteurs EP1, EP2 ou EP4 n'a eu d'effet sur aucun paramètre mesuré. La sulprostone, agoniste sélective de l'EP3, a eu l'effet inverse d'inhiber la prise alimentaire (données étendues, Fig. 2b). Ainsi, les souris présentent des changements de comportement caractéristiques face à l'infection par le virus de la grippe grâce à l'action de la PGE2 sur les récepteurs EP3.

Le récepteur EP3 est exprimé dans plusieurs classes de neurones centraux et périphériques. Pour déterminer le site clé de l'action du récepteur EP3 dans la maladie induite par la grippe, nous avons obtenu des souris avec un allèle (Ptger3flox) pour l'inactivation dépendante de Cre du gène Ptger314, qui code pour le récepteur EP3. Nous avons ensuite croisé des souris Ptger3flox avec des souris Nestin-cre ou Advillin-creER, qui ciblent la recombinase Cre sur la plupart des neurones centraux ou périphériques20,21, respectivement (Extended Data Fig. 4a), et mesuré les comportements de maladie induits par la grippe. Advillin-creER ; Des souris Ptger3flox ont été traitées avec du tamoxifène pour induire une recombinaison médiée par Cre au moins une semaine avant l'administration du virus ; le traitement antérieur au tamoxifène des souris témoins n'a pas affecté les réponses comportementales ultérieures à l'infection grippale (données étendues Fig. 4b). Les diminutions induites par la grippe dans l'alimentation, la boisson, les mouvements, le poids corporel et la survie ont été atténuées dans Advillin-creER ; Souris Ptger3flox (Fig. 2b), avec des ampleurs d'effet similaires au traitement à l'ibuprofène, mais persistant dans Nestin-cre ; Souris Ptger3flox (Fig. 2a). Des effets similaires de la suppression du gène Ptger3 sur le comportement de la maladie ont été observés lorsque des doses plus faibles et moins létales de virus de la grippe ont été utilisées (Extended Data Fig. 5). Les souris avec un comportement de maladie atténué ont affiché un temps de récupération similaire, car une alimentation, une boisson et une motilité normales ont été observées environ deux semaines après l'infection dans tous les groupes expérimentaux. Ces observations ont indiqué que la grippe induit des réponses de maladie par l'action de PGE2 sur les neurones sensoriels périphériques.

a,b, Nestin-cre ; Ptger3flox (a), Advillin-creER ; Des souris Ptger3flox (b) ou des souris Ptger3flox (a,b) ont été infectées par le virus de la grippe A et surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 8 souris (Ptger3flox), n = 6 souris (Nestin-cre et Advillin-creER). Test t bilatéral non apparié comme détaillé à la Fig. 1 pour les analyses de comportement ou de physiologie ; test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de la survie. a, Apport alimentaire : P = 0,0126 ; consommation d'eau : P = 0,1006 ; motilité : P = 0,0701 ; poids corporel : P = 0,9361 ; survie : P = 0,7735. b, Apport alimentaire : P = 0,0004 ; consommation d'eau : P = 0,0004 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P = 0,0004 ; survie : P = 0,0216. c, Les ganglions NJP de souris Ptger3flox ont été injectés bilatéralement avec AAV-cre, exposés au virus de la grippe A ou à une solution saline et surveillés comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 8 souris par groupe. Ptger3flox, virus—apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P < 0,0001 ; survie : P < 0,0001. Ptger3flox ; AAV-cre, virus - Apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P < 0,0001 ; survie : P = 0,0376. ANOVA à un facteur avec le test de comparaison multiple de Dunnett comme détaillé dans la Fig. 1 pour les analyses de comportement ou de physiologie ; test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de la survie, avec comparaisons entre Ptger3flox, virus et Ptger3flox ; AAV-cre, véhicule (étoiles rouges) ou entre Ptger3flox, virus et Ptger3flox ; AAV-cre, virus (étoiles bleues).

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Le récepteur EP3 est exprimé dans plusieurs classes de neurones périphériques marqués chez les souris Advillin-creER, y compris les neurones sensoriels vagaux, les neurones sensoriels glossopharyngés, les neurones sensoriels spinaux des ganglions de la racine dorsale et potentiellement dans d'autres types de neurones. Les neurones sensoriels glossopharyngés et vagaux ont été considérés comme des candidats primaires pour la détection des agents pathogènes respiratoires car ils représentent la majeure partie de l'innervation dans les voies respiratoires supérieures et inférieures23. Chez la souris, le soma des neurones sensoriels vagaux (nodose et jugulaire) et glossopharyngien (pétreux) sont fusionnés en un grand superganglion de chaque côté du corps23. Nous avons injecté un virus adéno-associé (AAV) avec un allèle cre constitutif (AAV-cre) bilatéralement dans les ganglions nodose-jugulaire-pétreux (NJP) de souris Ptger3flox. L'inactivation efficace de Ptger3 dans les ganglions NJP a été confirmée deux semaines après l'injection d'AAV par hybridation in situ d'ARN (Extended Data Fig. 6). L'inactivation de Ptger3 ciblée sur les ganglions du NJP a provoqué une atténuation marquée du comportement de maladie induit par la grippe (Fig. 2c). Ces résultats indiquent que la grippe induit des changements de comportement via le récepteur EP3 exprimé sur les afférences sensorielles vagales et/ou glossopharyngées.

Ptger3 est exprimé dans un sous-ensemble de neurones sensoriels vagaux et glossopharyngés, comme l'ont révélé l'hybridation in situ de l'ARN (données étendues Fig. 6b) et l'analyse des données de transcriptome unicellulaire (Fig. 3a). Les approches de séquençage d'ARN unicellulaire ont révélé des dizaines de neurones sensoriels NJP moléculairement distincts22,24,25. L'expression la plus élevée de Ptger3 a été observée dans 6 groupes de neurones: J1, J2, J3, NP2, NP9 et NP26 (Fig. 3a), J désignant les neurones jugulaires et NP désignant les neurones pétreux-nodose. Nous avons croisé des souris Ptger3flox avec des souris Piezo2-IRES-cre, dans lesquelles J1, J2, J3 et d'autres neurones NJP sont marqués, et des souris Phox2b-cre, dans lesquelles NP2, NP9, NP26 et d'autres neurones NJP sont marqués. Les comportements de maladie induits par la grippe ont été atténués dans Phox2b-cre ; Souris Ptger3flox dans une gamme de titres viraux, mais pas dans Piezo2-IRES-cre ; Souris Ptger3flox (Fig. 3b et Extended Data Figs. 7 et 8a), suggérant un rôle pour les neurones NP2, NP9 ou NP26. Pour distinguer ces types de neurones, nous avons ensuite croisé des souris Ptger3flox avec des souris Pdyn-IRES-cre, Oxtr-IRES-cre et Gabra1-IRES-cre, qui affichent un ciblage différentiel des neurones NP26, NP2 et NP9. Gabra1-IRES-cre ; Les souris Ptger3flox ont montré une atténuation marquée du comportement de maladie induite par la grippe similaire au traitement à l'ibuprofène, alors qu'aucun effet n'a été observé dans Pdyn-IRES-cre ; Ptger3flox ou Oxtr-IRES-cre ; Souris Ptger3flox (Fig. 3b et données étendues Fig. 8a). Gabra1-IRES-cre ; Les souris Ptger3flox ont également présenté une réponse hypothermique atténuée à l'infection grippale (données étendues Fig. 3a). Nous avons également testé un rôle pour les neurones TRPV1 puisque leur délétion affecte la survie suite à des infections pulmonaires bactériennes qui provoquent une pneumonie mortelle26. Cependant, le comportement de maladie induit par la grippe était normal dans Trpv1-IRES-cre ; Les souris Ptger3flox (données étendues Fig. 8b, c) et, de plus, les neurones GABRA1 sont principalement négatifs pour Trpv1. Ainsi, la suppression du récepteur EP3 dans un petit sous-ensemble de neurones sensoriels périphériques exprimant Gabra1 (neurones NP9) a un effet étendu sur les réponses comportementales à l'infection grippale.

a, Une parcelle d'approximation et de projection uniformes de variété (UMAP) dérivée des données publiées du transcriptome unicellulaire des ganglions sensoriels vagaux et glossopharyngés22 montrant l'expression des gènes indiqués (la couleur montre l'expression relative sur une échelle logarithmique naturelle). b, les types de cellules, comme mis en évidence en a, expriment le gène indiqué ainsi que Ptger3. Les souris ont été infectées par le virus de la grippe A et surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 8 (Piezo2-IRES-cre), n = 6–8 (Phox2b-cre ; 8 témoins et 6 Phox2b-cre), n = 6 (Pdyn-IRES-cre), n = 6 (Oxtr-IRES-cre) et n = 10 (Gabra1-IRES-cre) souris par groupe. Test t bilatéral non apparié comme détaillé à la Fig. 1 pour les analyses de comportement ou de physiologie ; test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de la survie. Piezo2-IRES-cre—apport alimentaire : P = 0,2631 ; motilité : P = 0,2680 ; poids corporel : P = 0,7925 ; survie : P = 0,4736. Phox2b-cre—apport alimentaire : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P = 0,0002 ; survie : P = 0,0181. Pdyn-IRES-cre—apport alimentaire : P = 0,4539 ; motilité : P = 0,4946 ; poids corporel : P = 0,2675 ; survie : P = 0,7937 ; Oxtr-IRES-cre—apport alimentaire : P = 0,4786 ; motilité : P = 0,6333 ; poids corporel : P = 0,3297 ; survie : P = 0,7121 ; Gabra1-IRES-cre—apport alimentaire : P = 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P = 0,0004 ; survie : P = 0,0263.

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Ensuite, nous avons examiné comment les manipulations des neurones sensoriels affectaient les niveaux de transcription virale et la production de cytokines. Infection grippale induit PGE2 à des niveaux similaires dans le plasma et BALF de Gabra1-IRES-cre ; Ptger3flox, Phox2b-cre ; Ptger3flox, Advillin-creER ; Souris Ptger3flox et Ptger3flox (données étendues Fig. 9a), compatibles avec les changements dans la détection de PGE2 plutôt que dans la synthèse de PGE2 sous-jacents aux différences de comportement observées. Chez les souris témoins, les niveaux de transcription virale ont culminé trois jours après l'infection dans les voies respiratoires supérieures et cinq jours après l'infection dans les poumons. En Gabra1-IRES-cre; Chez les souris Ptger3flox, les niveaux de transcription virale ont été partiellement réduits dans les voies respiratoires supérieures et ont été diminués, retardés et persistants dans les poumons (Extended Data Fig. 9b). Les niveaux d'interféron-gamma (IFNγ), de TNF et d'interleukine 6 (IL-6) ont également atteint un pic dans le BALF des souris témoins 5 jours après l'infection, et ont également diminué et retardé dans Gabra1-IRES-cre ; Souris Ptger3flox (Données étendues Fig. 9c). Ces résultats indiquent que l'inactivation ciblée du récepteur EP3 dans les neurones sensoriels affecte non seulement le comportement de la maladie, mais également la réponse immunitaire et la transition de l'infection des voies respiratoires supérieures à inférieures.

Nous avons utilisé une approche complémentaire impliquant l'ablation cellulaire guidée par la toxine diphtérique pour clarifier le rôle des neurones sensoriels vagaux-glossopharyngés exprimant Gabra1 dans la maladie induite par la grippe et exclure un rôle pour d'autres sites d'expression de Gabra1. Les cellules de souris sont normalement résistantes à la toxine diphtérique, mais peuvent être rendues sensibles par l'expression du récepteur humain de la toxine diphtérique (DTR). ganglions NJP de Gabra1-IRES-cre ; Des souris lsl-DTR ont reçu une injection bilatérale de toxine diphtérique (nous appelons ces souris Gabra1-ABLATE), ce qui a entraîné une ablation très efficace des neurones GABRA1 vagaux et glossopharyngés (Fig. 4c). Nous avons précédemment démontré que cette approche n'affecte pas les neurones Cre-négatifs dans les ganglions NJP, ni les neurones Cre-positifs situés à distance27. Les souris Gabra1-ABLATE ont présenté des réponses de maladie atténuées à l'infection grippale similaires à celles de Gabra1-IRES-cre ; Souris Ptger3flox ou souris traitées à l'ibuprofène (Fig. 4a).

a, Gabra1-IRES-cre ; Des souris lsl-DTR ont été injectées bilatéralement dans les ganglions NJP avec ou sans toxine diphtérique (DT), puis infectées par le virus de la grippe A et surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 8 souris par groupe. Apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P = 0,0004 ; survie : P = 0,049. b, des souris de type sauvage ayant subi une chirurgie de transection bilatérale du nerf glossopharyngien ou une chirurgie factice ont été infectées par le virus de la grippe A et surveillées comme indiqué. Les données sont moyennes ± sem ; n = 8 souris par groupe. Apport alimentaire : P < 0,0001 ; consommation d'eau : P < 0,0001 ; motilité : P < 0,0001 ; poids corporel : P < 0,0001 ; P = 0,036. Test t non apparié à deux queues comme détaillé à la Fig. 1 pour l'analyse du comportement ou de la physiologie ; test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de la survie. c, Immunocoloration pour DTR dans des préparations entières de ganglions NJP quatre semaines après l'injection. Barres d'échelle, 200 μm. d, les transitoires de calcium évoqués par PGE2 (1 μM) ou KCl (150 mM) ont été imagés à l'aide de Calbryte 520 AM dans des neurones tdTomato-positifs collectés de manière aiguë à partir de ganglions NJP de Gabra1-IRES-cre ; Souris lsl-tdTomato. Barre d'échelle, 10 μm. Les images sont représentatives de trois répliques techniques. AU, unités arbitraires.

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Les neurones NP9 manquent d'expression de Hoxb4 (réf. 22) et les neurones GABRA1 sont souvent regroupés dans les ganglions NJP près de la branche glossopharyngée (Extended Data Fig. 10a), ce qui suggère qu'ils font partie du nerf glossopharyngé plutôt que du nerf vague. Étant donné que l'injection de toxine diphtérique a affecté de manière similaire les neurones vagaux et glossopharyngés, nous avons distingué les contributions de ces nerfs en sectionnant le nerf glossopharyngé bilatéralement tout en préservant le nerf vague. Les souris ayant subi une section bilatérale du nerf glossopharyngien ont présenté une atténuation similaire de la maladie induite par la grippe (Fig. 4b). Il a déjà été démontré que la PGE2 activait et/ou induisait des changements transcriptionnels dans les afférences spinales et vagales28,29,30,31, nous avons donc testé si les neurones GABRA1 étaient également directement activés. Nous avons observé que la PGE2 évoquait directement les transitoires de calcium dans les neurones GABRA1 cultivés de manière aiguë à partir des ganglions sensoriels NJP de Gabra1-IRES-cre ; Souris lsl-tdTomato (Fig. 4d, 16 sur 26 ou 61, 5% de neurones tdTomato-positifs et sensibles au KCl). Ainsi, de rares neurones glossopharyngés NP9 détectent la présence d'une infection virale respiratoire indirectement par le récepteur EP3 et, en réponse, évoquent un programme à plusieurs volets de comportement de maladie.

Les souris Gabra1-IRES-cre fournissent un outil précieux pour visualiser les rares neurones sensoriels glossopharyngés impliqués dans la diaphonie neuro-immune. Nous avons donc utilisé des approches de cartographie génétique pour marquer les projections périphériques et centrales des neurones GABRA1 (Fig. 5a). Les ganglions NJP de souris Gabra1-IRES-cre ont été injectés soit avec un AAV contenant un gène rapporteur Cre-dépendant codant pour tdTomato (AAV-flex-tdTomato) ou la phosphatase alcaline (AAV-flex-AP), ainsi qu'un AAV contenant un gène rapporteur Cre-indépendant codant pour la GFP (AAV-GFP) pour visualiser le champ de projection NJP global. Les fibres ont ensuite été visualisées dans les voies respiratoires et le cerveau.

a, des ganglions NJP de souris Gabra1-IRES-cre ont été injectés bilatéralement avec AAV-GFP indépendant de Cre et AAV-flex-tdTomato dépendant de Cre, et des axones fluorescents ont été visualisés (vert : tous les axones sensoriels NJP ; rouge : axones GABRA1 NJP) par immunohistochimie pour tdTomato et GFP dans des cryosections coronales fixes du tronc cérébral de souris. Barre d'échelle, 200 μm. b, les ganglions NJP de souris Gabra1-IRES-cre ont été injectés bilatéralement avec AAV-flex-tdTomato, et les axones ont été visualisés par immunocoloration pour tdTomato dans des cryosections coronales fixes du nasopharynx. Barres d'échelle, 100 μm (en haut), 50 μm (en bas). c, En haut, immunohistochimie de COX2 dans des cryosections fixes de nasopharynx chez des souris non infectées (contrôle) ou des souris infectées pendant cinq jours par le virus de la grippe A. Barres d'échelle, 100 μm. En bas, quantification de l'immunofluorescence COX2 dans le nasopharynx des souris indiquées. Les données sont moyennes ± sem ; n = 29 sections de 5 souris par groupe sur 3 expériences indépendantes. Test t bilatéral non apparié, P < 0,0001. Panneau de gauche en partie a adapté avec la permission de la réf. 35, Elsevier. Panneau supérieur de la partie b créé avec BioRender.com.

Données source

Au centre, les neurones sensoriels des ganglions noueux et pétreux traversent le crâne et innervent les régions du tronc cérébral qui incluent le noyau du tractus solitaire (NTS) et l'area postrema32, tandis que les neurones sensoriels jugulaires innervent le noyau paratrigeminal33. Diverses afférences vagales définies par Cre ciblent des sous-régions spatialement restreintes du NTS, certains types d'afférences, mais pas tous, accédant également à la zone postrema24,34,35. Les axones des neurones NJP GABRA1 étaient fortement restreints dans le NTS latéral (Fig. 5a), non observés dans la zone postrema et éloignés des emplacements NTS ciblés par les axones de certains autres neurones NJP définis par Cre, tels que les neurones innervant l'intestin marqués par l'expression de Gpr65 ou Glp1r35. Ces découvertes soutiennent en outre un modèle d'organisation topographique dans le tronc cérébral36, avec des neurones relayant la présence d'une infection des voies respiratoires spatialement restreinte à partir d'au moins certaines autres entrées intéroceptives.

En périphérie, des axones GABRA1 marqués ont été observés dans seulement quelques organes internes connus pour recevoir l'innervation vagale et glossopharyngée. Nous avons observé l'innervation la plus dense dans le nasopharynx et la cavité buccale, y compris les papilles gustatives, une certaine innervation des muscles trachéaux et pharyngés et une innervation clairsemée du muscle de l'estomac (données étendues Fig. 10b). L'innervation n'a pas été observée dans de nombreux autres organes internes, notamment le cœur, l'œsophage, l'aorte et le sinus carotidien. Le nasopharynx est un site riche pour la surveillance immunitaire, car il relie la cavité nasale au reste du système respiratoire et fournit une première ligne de défense immunitaire muqueuse37. L'infection grippale augmente les niveaux de PGE2 localement dans le nasopharynx38 et, chez l'homme, entraîne une inflammation des amygdales nasopharyngées39. Les souris ont un système orthologue connu sous le nom de tissu lymphoïde associé au nasopharynx40, nous avons donc testé si les axones GABRA1 étaient situés à proximité des médiateurs immunitaires pertinents. Les axones GABRA1 étaient enrichis dorsalement dans les couches épithéliales et sous-épithéliales du nasopharynx (Fig. 5b) et, notamment, l'expression de la cyclooxygénase-2 a également été détectée dans l'épithélium dorsal du nasopharynx (Fig. 5c). De plus, l'expression de la cyclooxygénase-2 était nettement régulée positivement dans le nasopharynx dorsal après une infection grippale chez la souris (Fig. 5c). Ainsi, les neurones GABRA1 occupent une position stratégique et privilégiée pour la détection des niveaux accrus de PGE2 qui se produisent lors d'une infection virale.

Malgré la vaccination saisonnière et les thérapies antivirales, l'infection virale de la grippe A reste l'une des menaces humaines les plus graves, affectant des millions de personnes dans le monde chaque année. Les inhibiteurs de la cyclo-oxygénase-2 font partie des médicaments contre les nausées et les douleurs les plus répandus, avec environ 30 milliards de doses d'anti-inflammatoires non stéroïdiens (AINS) consommées chaque année aux États-Unis seulement41. Le blocage de la production de PGE2 atténue la maladie, et plusieurs modèles ont été proposés pour expliquer comment le cerveau reçoit des informations sur une infection périphérique via la PGE2 (réf. 2). Ici, nous observons que les comportements de maladie induits par la grippe ont été atténués de la même manière par 1) l'antagonisme de l'ibuprofène, de l'aspirine et des récepteurs EP3, 2) l'inactivation du gène ciblé Ptger3 à l'aide de souris Advillin-creER, Phox2b-cre et Gabra1-IRES-cre et l'injection directe d'AAV-cre dans les ganglions NJP, 3) l'ablation des neurones GABRA1 NJP et 4) et le nerf glossopharyngé transection. À partir de ces résultats combinés, nous concluons qu'un petit groupe de neurones sensoriels glossopharyngés exprimant Gabra1 détecte la PGE2 et induit un état de maladie orchestré par les neurones associé à une suite de réponses comportementales à l'infection virale respiratoire.

Les prostaglandines et de nombreuses autres cytokines peuvent activer les afférences vagales et autres périphériques in vitro8,29,31, mais leurs rôles physiologiques dans les infections naturalistes ont été difficiles à analyser. La vagotomie bloque les réponses de la maladie aux cytokines et aux lipopolysaccharides dans certaines études mais pas dans d'autres42,43, et cette variabilité peut être due à l'emplacement ou à la dose d'administration de pyrogènes. Nos résultats indiquent un rôle clair pour les neurones sensoriels glossopharyngés clairsemés qui sont anatomiquement prêts à détecter la PGE2 induite par la grippe. La PGE2 a une stabilité limitée in vivo44, de sorte que les neurones sensoriels périphériques qui détectent directement la PGE2 au site de l'infection fourniraient apparemment un conduit rapide et robuste pour le transfert d'informations vers le cerveau.

Des comportements de maladie ont été proposés pour aider à conserver l'énergie pour combattre l'infection1. Cependant, l'élimination de la voie de détection de la grippe du nerf glossopharyngien atténue non seulement le comportement de maladie, mais favorise également la survie. Le knock-out d'EP3 à partir d'un petit groupe de neurones glossopharyngés est suffisant pour imiter le phénotype de survie profond observé dans les knock-outs du corps entier. Un modèle est que l'anorexie induite par l'agent pathogène est bénéfique dans certains modèles d'infection mais nocive dans d'autres. Par exemple, le blocage de la production de PGE2 est nocif lors d'une infection à mycobactérie 345, mais favorise la survie lors d'une infection grippale19,46. De plus, le gavage au glucose est préjudiciable lors d'une septicémie bactérienne, où la glycémie peut fournir un carburant direct pour l'agent pathogène, mais protecteur lors d'une infection grippale47. Ainsi, la perturbation des réponses neuronales à l'infection peut diminuer la mortalité en atténuant les changements dans le comportement alimentaire. De plus, une voie neurale activée par l'infection et favorisant l'anorexie peut fournir un avantage net de survie lors de certaines infections bactériennes, et est donc maintenue au cours de l'évolution, mais est nocive lors d'une infection virale, comme observé ici. De plus, le comportement de la maladie peut fournir un avantage distinct au niveau de la population, car les animaux malades cherchent à s'isoler et limitent ainsi la transmission des agents pathogènes à leurs proches48.

Ces résultats indiquent que l'inactivation ciblée du récepteur EP3 dans les neurones sensoriels affecte non seulement le comportement de la maladie, mais également la réponse immunitaire et la transition virale des voies respiratoires supérieures aux voies respiratoires inférieures. Une interprétation parcimonieuse de ces résultats est que les neurones pétrosaux GABRA1, lors de la détection de PGE2, engagent des circuits neuronaux qui évoquent des réponses coordonnées qui incluent des comportements de maladie ainsi que des réflexes moteurs qui affectent la fonction immunitaire. De plus, des changements dans le comportement alimentaire peuvent affecter secondairement la fonction immunitaire47,48 et l'activation des neurones pétrosaux GABRA1 peut affecter les niveaux de cytokines autres que PGE2 (Extended Data Fig. 9c), ce qui peut potentiellement déclencher une rétroaction neuronale supplémentaire et améliorer le comportement de la maladie. Toutes ces réponses à l'infection dépendraient de manière critique du récepteur EP3 dans les neurones pétrosaux GABRA1, qui joue un rôle essentiel en relayant d'abord la présence d'une infection des voies respiratoires supérieures au cerveau, évoquant finalement un comportement de maladie.

Le comportement de maladie induit par l'infection grippale a été atténué, mais pas éliminé, après le traitement par AINS, l'inactivation ciblée du récepteur EP3, l'ablation neuronale ciblée et la transection du nerf glossopharyngé, suggérant d'autres voies vers la maladie. Il convient de noter que la cinétique du comportement de maladie résiduel suite à la manipulation des neurones pétreux GABRA1 correspond à l'évolution temporelle de l'accumulation du virus dans les poumons, ce qui indique qu'il existe probablement deux phases de comportement de maladie induit par la grippe. La première phase se produit lorsque le virus est le plus répandu dans les voies respiratoires supérieures, et la maladie est principalement médiée par les neurones sensoriels glossopharyngés détectant la PGE2 marqués par GABRA1, qui se projettent vers le nasopharynx. La deuxième phase de la maladie survient lorsque le virus est le plus répandu dans les voies respiratoires inférieures et que le poumon est principalement innervé par des neurones sensoriels vagaux plutôt que glossopharyngés. Nos données soulèvent la possibilité que cette deuxième phase de la maladie implique une autre voie neuronale indépendante des PGE2, EP3 et des neurones sensoriels glossopharyngés. Les inhibiteurs des voies d'interaction neuro-immunitaires résiduelles, une fois identifiés, pourraient potentiellement améliorer le soulagement des malaises induits par la grippe lorsqu'ils sont utilisés en association avec des AINS. Nous notons également que les récepteurs PGE2 sont exprimés dans plusieurs types de neurones sensoriels NJP, ainsi que dans le cerveau et les ganglions de la racine dorsale. Il est probable que le système nerveux utilise plusieurs voies sensorielles pour détecter les infections périphériques, avec différents capteurs peut-être spécialisés pour des types d'agents pathogènes particuliers ou des emplacements d'infection dans le corps. De cette façon, les neurones sensoriels intestinaux et respiratoires pourraient potentiellement engager différents circuits neuronaux qui conduisent, par exemple, à la toux ou à la nausée31,49. Conformément à cette notion, diverses voies vers la maladie sont différemment sensibles à l'inhibition pharmacologique; par exemple, le malaise intestinal est traité cliniquement à l'aide d'antagonistes du récepteur de la sérotonine HTR3A50. Comprendre la diversité des voies sensorielles menant à la maladie et le moment où elles sont engagées par différentes infections pathogènes fournira un cadre essentiel pour déchiffrer cet état physiologique complexe et mal compris, et pourrait permettre d'améliorer les interventions thérapeutiques.

Toutes les procédures animales ont suivi les directives éthiques décrites dans le National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, et tous les protocoles ont été approuvés par le comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux (IACUC) de la Harvard Medical School. Les souris ont été maintenues à température constante (23 ± 1 °C) et à humidité relative (46 ± 5 %) avec un cycle lumière/obscurité de 12 h. Type sauvage C57BL/6J (000664), Nestin-cre (003771), Phox2b-cre (016223), Advillin-creER (032027), Trpv1-IRES-cre (017769), Pdyn-IRES-cre (027958), Piezo2-EGFP-IRES-cre (027719), Oxtr-IRES-cre (0313 03), Agrp-cre (012899), lsl-DTR (007900), lsl-tdTomato (Ai14, 007914) ont été achetés chez Jackson Laboratories. Les souris Gabra1-IRES-cre, lsl-L10-GFP et Ptger3flox ont été précédemment générées14,22,51.

La grippe A/PR/8/34 (H1N1) a été achetée auprès de Charles River Avian Vaccine Services (10100374) avec un EID50 de 1012 ml-1. Le virus a été dilué dans une solution saline stérile pour la dose administrée, qui était EID50 106 ml-1 sauf indication contraire. L'administration virale a été adaptée à partir d'études antérieures52. Des souris éveillées ont été retenues manuellement et le virus de la grippe A a été administré lentement par chaque narine (volume total de 25 μl) à l'aide d'une pipette P200 pour éviter tout déversement ou administration à la bouche. Après administration, les souris ont été maintenues les narines dressées pendant 10 à 15 s et remises dans leur cage.

Pour l'analyse des changements de comportement induits par l'infection par le virus de la grippe A, des souris âgées de six à huit semaines sans préjugé sexuel ont été logées individuellement avec un accès libre à la nourriture et à l'eau. Les valeurs de base ont été obtenues en mesurant l'apport alimentaire quotidien, l'apport quotidien en eau, le poids corporel et la motilité pendant trois jours avant l'inoculation. Après infection virale, toutes les mesures ont été exprimées en pourcentage de changement par rapport aux valeurs de base. La consommation de nourriture et d'eau a été calculée quotidiennement en mesurant le changement de poids de la nourriture et de l'eau restantes dans la cage. Le mouvement des animaux a été enregistré (webcam C922x Pro Stream, Logitech) dans la cage de la maison pendant 30 minutes par jour et la motilité exprimée en distance totale déplacée, telle que déterminée par le plug-in MTrack2 disponible dans ImageJ (1.53q, NIH). Pour mesurer l'apport alimentaire aigu, les souris ont été mises à jeun pendant 24 h et, au début de l'obscurité, ont reçu de la PGE2 ou de la sulprostone (agoniste EP3, 14765, Cayman Chemical Company) via la voie d'exposition et les doses indiquées dans les légendes des figures. Les animaux ont ensuite été logés individuellement dans des cages propres avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau, et la quantité de nourriture consommée pendant 1 h a été déterminée en mesurant la nourriture dans la cage avant et après la période de test.

La température corporelle centrale a été surveillée par une sonde rectale ou par radiotélémétrie. Les mesures de la sonde rectale ont été effectuées toutes les heures chaque jour de midi à minuit à l'aide d'une sonde de température rectale de souris (Kent Scientific, RET-3, diamètre de la pointe de 0, 16 mm) connectée à un thermomètre (Kent Scientific WD-20250-9). Les sondes ont été stérilisées (éthanol à 70%), lubrifiées (gel lubrifiant Aquagel, ParkerLabs, 57-05) et insérées à environ 5 à 7 mm dans le rectum de souris physiquement retenues, et la température a été enregistrée pendant 30 s. Pour la radiotélémétrie, un dispositif de radiotélémétrie qui signale la température corporelle (HD-X11, DSI) a été implanté chirurgicalement dans la cavité abdominale. La chirurgie a été réalisée sous anesthésie avec de l'avertine (200 mg kg−1, injection intrapéritonéale) et la région abdominale a été désinfectée et rasée. Une incision d'environ 1 cm a été pratiquée et le péritoine abdominal au niveau de la linea alba a été doucement exposé pour insérer le dispositif de radiotélémétrie stérile. Le site opératoire a été scellé avec des sutures VICRYL (J392H, Ethicon). Les animaux ont reçu de la buprénorphine SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg-1 par voie sous-cutanée à l'arrière du cou) et ont pu récupérer pendant au moins une semaine. Les données de température corporelle ont été recueillies sur des intervalles de 15 minutes avec un récepteur (easyTEL, Emka Technologies) connecté à un ordinateur exécutant le logiciel iox v.2.10.8. Tous les points de données d'une souris un jour donné ont été moyennés.

L'ibuprofène (I4883) et l'aspirine (acide acétylsalicylique, A5376) ont été achetés chez Sigma, et les antagonistes des récepteurs PGE2 SC-51322 (2791), PF-04418948 (4818), DG-041 (6240) et ONO-AE3-208 (3565) ont été achetés chez Tocris. De l'ibuprofène (1 mg ml-1, solution saline) a été ajouté à l'eau potable ad libitum, et de l'aspirine (20 mg kg-1, solution saline) et des antagonistes des récepteurs PGE2 (1 mg kg-1, solution saline) ont été injectés (par voie intrapéritonéale) quotidiennement. L'administration d'inhibiteurs de la cyclooxygénase-2 et d'antagonistes des récepteurs PGE2 a commencé 3 jours avant l'inoculation du virus et s'est poursuivie jusqu'à la fin de la période de surveillance. Le tamoxifène a été administré quotidiennement pendant 5 jours (injection intrapéritonéale, 70 mg kg-1) au moins une semaine avant l'infection par le virus de la grippe.

Les ganglions NJP ont été injectés avec des AAV ou de la toxine diphtérique comme décrit précédemment34, avec des modifications mineures. Les souris ont été anesthésiées (200 mg kg-1 d'avertine, injection intrapéritonéale) et la profondeur de l'anesthésie a été assurée tout au long de la procédure en l'absence de réponse au pincement de l'orteil. Les ganglions NJP ont été exposés et injectés en série (10 × 13, 8 nl) avec une solution saline contenant soit des AAV (titre> 6, 7 × 1012 vg ml -1) soit de la toxine diphtérique (5 μg ml -1, Sigma) additionnée de 0, 05% Fast Green FCF Dye (Sigma) à l'aide d'une pipette en verre fortement tirée attachée à un injecteur Nanoject (Drummond). AAV-cre (AAV-Syn-Cre-GFP, SignaGen Laboratories, SL100892, AAV9), AAV-flex-tdTomato (AAV9.CAG.Flex.tdTomato.WPRE.BGH, Addgene, 51503, AAV9), AAV-GFP (pENN.AAV.CB7.CI.eGFP.WPRE.rBG, Addgene, 105542, AAV 9) et AAV-flex-AP (AAV9.CAG.flex.PLAP.WPRE.bgH, virus personnalisé, Boston Children's Hospital Viral Core, Boston, MA, AAV9) ont été achetés. L'injection réussie a été vérifiée par Fast Green FCF Dye remplissant lentement tout le ganglion sans fuite. Les plaies chirurgicales ont été fermées avec des sutures VICRYL enduites (J392H, Ethicon) et les animaux ont reçu de la buprénorphine SR (BupSR-LAB, ZooPharm, 20 mg kg -1 par voie sous-cutanée à l'arrière du cou) comme analgésique. Les animaux ont récupéré pendant au moins deux semaines pour l'analyse comportementale ou quatre semaines pour l'analyse histologique.

Les souris ont été anesthésiées (200 mg kg-1 d'avertine, injection intrapéritonéale) et la profondeur de l'anesthésie a été assurée tout au long de la procédure en l'absence de réponse au pincement de l'orteil. Les ganglions NJP ont été exposés chirurgicalement et le nerf glossopharyngé a été identifié et sectionné immédiatement à côté des ganglions à l'aide de microciseaux. Les chirurgies factices impliquaient une exposition des ganglions NJP sans section nerveuse. Les plaies chirurgicales ont été fermées avec des sutures VICRYL enduites (J392H, Ethicon) et les animaux ont reçu 20 mg kg -1 de buprénorphine SR (BupSR-LAB, ZooPharm, par voie sous-cutanée à l'arrière du cou) comme analgésique. Les animaux se sont rétablis pendant au moins deux semaines avant l'analyse comportementale.

L'immunohistochimie et l'analyse de la fluorescence des tissus natifs ont été réalisées après perfusion intracardiaque de fixateur (10 ml de PBS, puis 10 ml de paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS). Pour l'immunocoloration DTR complète, les ganglions NJP ont été collectés et perméabilisés (11, 5 g de glycine, 400 ml de PBS avec 0, 2% de Triton X-100, 100 ml de DMSO) à 37 ° C pendant 1 semaine. Les ganglions ont ensuite été bloqués (1 h, température ambiante) dans un tampon de blocage (5 % de sérum d'âne normal, 017-000-121, Jackson dans 0,05 % de Tween-20/PBS) et incubés (une nuit, 4 °C) avec 1:200 anti-DTR (HB-EGF, chèvre, AF259NA, Fisher Scientific) dans un tampon de blocage. Les échantillons ont été lavés (4 × 10 min, 0,05 % de Tween-20 dans du PBS, température ambiante) et incubés (2 h, température ambiante) avec une solution anti-chèvre Alexa 488 (Jackson Immunoresearch, 705-545-147, 1:500 dans du PBS avec 0,05 % de Tween-20). Les tissus ont été lavés à nouveau (4 × 10 min, 0, 05% de Tween-20 dans du PBS, température ambiante), montés (milieu Fluoromount G, SouthernBiotech) sur des lames de microscope (Fisher Scientific) et visualisés à l'aide d'un microscope confocal Leica SP5 II et analysés à l'aide d'ImageJ (1.53q). Pour l'immunocoloration à la cyclooxygénase-2, le tissu nasopharyngé a été cryosectionné (15 μm), bloqué (1 h, température ambiante) avec une solution de blocage (sérum d'âne normal à 5 ​​%, PBS avec 0,01 % de Triton X-100) et incubé (une nuit, 4 °C) avec un anticorps anti-COX2 (lapin, ab179800, Abcam, 1:500 dans du PBS avec 0,01 % de Triton tonne X-100). Les coupes ont été lavées (3 × 10 min, température ambiante, PBS avec 0,01 % de Triton X-100) et incubées (2 h, température ambiante) avec une solution anti-lapin Alexa 488 (Jackson Immunoresearch, 711-545-152, 1:1 000 dans du PBS avec 0,01 % de Triton X-100). Les coupes ont été lavées à nouveau (3 × 10 min, température ambiante, PBS avec 0,01 % de Triton X-100), montées avec du milieu Fluoromount G et visualisées à l'aide d'un microscope confocal Leica SP5 II. Pour visualiser les axones du tronc cérébral, des cryosections du tronc cérébral (20 μm) ont été obtenues à partir de souris ayant reçu une injection d'AAV et traitées comme décrit ci-dessus pour l'immunocoloration à la cyclooxygénase-2 dans le tissu nasopharyngé, sauf que les anticorps étaient 1: 1 000 anti-GFP (poulet, GFP-1020, Aves Labs), 1: 1 000 anti-RFP (lapin, 600-401-37 9, Rockland), anti-poulet Alexa 647 (Jackson Immunoresearch, 703-605-155, 1:300) et anti-lapin Cy3 (Jackson Immunoresearch, 111-165-144, 1:300). Pour visualiser les axones dans le nasopharynx, des coupes nasopharyngées fixes (15 μm) ont été colorées comme ci-dessus pour l'immunocoloration à la cyclooxygénase-2, mais avec un anticorps primaire anti-RFP suivi d'un anticorps secondaire anti-lapin Cy3. Pour l'innervation des neurones GABRA1 vers la trachéale et les muscles constricteurs inférieurs du pharynx, les tissus ont été prélevés frais, coupés le long de l'axe ventral pour la visualisation à livre ouvert, fixés (paraformaldéhyde à 4 %/PBS pendant 1 h, température ambiante ou pendant la nuit, 4 °C) et colorés pour tdTomato comme ci-dessus pour la visualisation de tdTomato dans le nasopharynx, à l'exception de l'incubation primaire d'anticorps (36 h, 4 °C) et des lavages suivants (3 × 12 h, 4 °C) étaient plus longues. Pour visualiser la phosphatase alcaline, les animaux ont été perfusés avec du PBS et les tissus ont été prélevés, fixés (paraformaldéhyde à 4 %, 1 h, température ambiante) et lavés dans du PBS froid. Les tissus ont ensuite été incubés (70 ° C, 2 h) dans un tampon de phosphatase alcaline (Tris HCl 0, 1 M pH 9, 5, NaCl 0, 1 M, MgCl2 50 mM, Tween-20 0, 1%, lévamisole 5 mM) et lavés deux fois dans un tampon de phosphatase alcaline. L'activité de la phosphatase alcaline a été visualisée avec une solution NCT/BCIP (34042, ThermoFisher Scientific) selon les protocoles du fabricant. Les échantillons colorés ont été post-fixés (paraformaldéhyde à 4 %, pendant la nuit, 4 °C), déshydratés par une série de lavages à l'éthanol et nettoyés à l'aide d'un mélange 1:2 d'alcool benzylique (Sigma-Aldrich 402834-500ML) : benzoate de benzyle (Sigma-Aldrich B6630-1L). Le tissu a ensuite été coupé le long de l'axe ventral pour une visualisation à livre ouvert. Les colorations entières ont été capturées par microscopie avec un AxioZoom (Zeiss) et analysées à l'aide d'ImageJ (1,53q).

Des sondes de réaction en chaîne d'hybridation (HCR) basées sur l'ADN contre Ptger3 (lot n° PRH698) et Phox2b (lot n° PRF341) ont été achetées auprès de Molecular Instruments. Solution d'hybridation (30 % formamide, 5× SSC, 9 mM d'acide citrique (pH 6), 0,1 % de Tween-20, 50 μg ml−1 héparine, 1× solution de Denhardt, 10 % de sulfate de dextrane), tampon de lavage de la sonde (30 % formamide, 5× SSC, 9 mM d'acide citrique pH 6,0, 0,1 % de Tween-20, 50 μg ml-1 d'héparine), un tampon d'amplification (5 × SSC, 0, 1% de Tween-20, 10% de sulfate de dextrane) et des amplificateurs HCR marqués au fluorophore ont été achetés auprès de Molecular Instruments. Les ganglions NJP ont été fraîchement prélevés, montés en OCT (Sakura Finetek) et cryosectionnés (10 μm). Le tissu a été post-fixé (4 % PFA, PBS, température ambiante, 20 min), lavé (3 × 10 min, PBS, température ambiante), traité avec du peroxyde d'hydrogène à 1 % (PBS, température ambiante, 20 min) et incubé avec des sondes Ptger3 et Phox2b HCR (0,4 pmol, tampon d'hybridation dans une chambre humidifiée, 37 °C, pendant la nuit). Le tissu a ensuite été lavé (15 min, 37 ° C) avec (1) un tampon de lavage de sonde 3: 1: 5 × SSCT (5 × SSC, 0, 1% de Tween-20), (2) un tampon de lavage de sonde 1: 1: 5 × SSCT, (3) un tampon de lavage de sonde 1: 3: 5 × SSCT et (4) 5 × SSCT. Le tissu a ensuite été incubé avec un tampon d'amplification (30 min, température ambiante), puis avec des amplificateurs fluorescents HCR (6 pmol, Alexa594 pour la sonde Ptger3 et Alexa 488 pour la sonde Phox2b) dans un tampon d'amplification (chambre humidifiée, température ambiante, pendant la nuit). Le tissu a ensuite été lavé (5 × SSCT, 2 × 30 min, 1 × 5 min, température ambiante), monté dans du milieu Fluoromount G et visualisé par microscopie confocale (Leica SP5 II).

Toutes les parcelles UMAP de ce manuscrit ont été réalisées à partir de données de transcriptome unicellulaire publiées (ID d'accession GEO : GSE145216) 22 à l'aide de Seurat (4.1.0) et de R Studio (4.1.2).

Les niveaux de Ptger3 de souris, de transcrit Gapdh et de la nucléoprotéine du virus de la grippe (NP) ont été mesurés dans l'ADNc obtenu à partir de l'hypothalamus, des ganglions NJP, du lavage nasal (pour l'analyse des voies respiratoires supérieures) et/ou du BALF (pour l'analyse des voies respiratoires inférieures). Le BALF a été recueilli en ouvrant chirurgicalement le cou et en canulant un cathéter 21G dans la trachée. Au total, 3 × 1 ml de PBS ont été lentement injectés dans les poumons, puis la solution a été doucement aspirée dans la seringue et collectée. Le BALF collecté a été centrifugé (7 min, 400 g, 4 ° C) et les surnageants ont été stockés (-80 ° C) jusqu'à l'analyse. Le lavage nasal a été réalisé en insérant une aiguille (26G) dans la trachée supérieure inclinée vers le nez. Du PBS stérile (1 ml) a été administré par l'aiguille via une seringue canulée (canule en polyéthylène PE20, diamètre intérieur 0,38 mm), et recueilli après expulsion par le nez. L'ARN a été collecté et l'ADNc a été synthétisé à partir de BALF, de liquide de lavage nasal et de tissu homogénéisé à l'aide de Trizol (15596026, ThermoFisher) et du kit de transcription inverse d'ADNc haute capacité (4368813, ThermoFisher) conformément aux protocoles du fabricant. L'analyse qPCR a été effectuée sur l'ADNc à l'aide d'amorces spécifiques au gène, PowerTrack SYBR Green Master Mix (A46012, ThermoFisher) sur l'instrument QuantStudio 7 qPCR (ThermoFisher). Les amorces Gapdh étaient GGGTGTGAACCACGAGAAATATG et TGTGAGGGAGATGCTCAGTGTTG ; Les amorces Ptger3 étaient CAACCTTTTCTTCGCCCTCTG et TTTCTGCTTCTCCGTGTGTG ; et les amorces nucléoprotéiques du virus de la grippe étaient GACGATGCAACGGCTGGTCTG et ACCATTGTTCCAACTCCTTT. Les niveaux d'expression de Ptger3 et de la nucléoprotéine ont été normalisés aux niveaux de Gapdh. La normalisation a été réalisée par la méthode 2-ΔCT pour les données étendues Fig. 4a et la méthode 2-ΔΔCT53 pour les données étendues Fig. 9b, avec une normalisation supplémentaire à l'aide de valeurs provenant de témoins non infectés.

Les souris ont été euthanasiées à différents moments après l'infection par le virus de la grippe A. Le sang total a été prélevé par ponction cardiaque à l'aide d'une aiguille et d'une seringue revêtues d'EDTA 0,5 M et mélangé immédiatement avec de l'EDTA 0,5 M (50 μl). Le plasma a été isolé par centrifugation (3 000 tr/min, 10 min, 4 ° C) et le surnageant stocké (-80 ° C) jusqu'à l'analyse ELISA. Le BALF a été collecté comme décrit ci-dessus. Les taux de PGE2 et de cytokines ont été mesurés dans le plasma et/ou BALF par ELISA (R&D Systems, PGE2 : KGE004B, TNF : DY410-5, IFNγ : DY485-05, IL-6 : DY406-05) selon les instructions du fabricant.

Les ganglions NJP ont été recueillis de manière aiguë à partir de Gabra1-IRES-cre ; Souris lsl-tdTomato et incubées (37 °C, 90 min, avec rotation) dans une solution de dissociation (Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) contenant de la libérase (55 mg ml-1, Roche, 05401135001), DNase (0,004 %, Worthington, LS002007)). Les cellules ont ensuite été culottées (3 min, 300 g, 4 ° C) et remises en suspension dans 0, 2% d'ovomucoïde, 0, 004% de DNase, DMEM, 200 μl. À l'aide d'une pipette P200, les cellules ont été triturées au moins 10 fois jusqu'à ce que les amas ne soient plus visibles, filtrées à travers une passoire cellulaire à mailles de 40 μm et agglomérées à nouveau (3 min, 300 g, 4 ° C). Les cellules ont ensuite été remises en suspension dans un milieu de culture contenant 5 µM de Calbryte 520 AM (20651, AAT Bioquest) ; le milieu de culture contient 1× B27 (Gibco, 17504044), 1× N2 (Gibco, 17502048), 1× pénicilline et streptomycine (Gibco, 15140122) dans du milieu Neurobasal sans rouge de phénol (Gibco, 12348017). Les cellules remises en suspension ont ensuite été étalées sur une lamelle recouverte de laminine et incubées (37 ° C, au moins 30 min avant l'imagerie) dans un incubateur à CO2 humidifié. Le couvercle en verre a ensuite été transféré dans une chambre avec une perfusion d'entrée et de sortie (Warner Instruments, RC-24N) avec un flux continu de solution saline équilibrée de Hank (HBSS). Les réponses calciques ont ensuite été imagées (488 nm) sur perfusion de prostaglandine E2 (1 μM en HBSS, 2 min) et de KCl (150 mM, en fin de run). Les neurones positifs pour GABRA1 ont été identifiés par fluorescence tdTomato (568 nm). Les cellules ont été identifiées comme réactives si la fluorescence moyenne de Calbryte 520 AM pendant la période de stimulation dépassait trois écarts-types au-dessus de la moyenne de base.

La photométrie des fibres des neurones AGRP a été réalisée comme décrit54 avec PGE2 (injection intrapéritonéale, 0, 5 mg kg -1) ou PBS injecté de manière aiguë lors d'une brève contention manuelle à l'aide du logiciel Synapses (Build: 94-42329P, Tucker-Davis Technology). Les données ont été analysées à l'aide de Matlab (R2020a).

Les données dans les graphiques sont représentées par la moyenne ± sem, avec toutes les tailles d'échantillon et les valeurs P fournies dans les légendes des figures. L'analyse statistique des expériences comportementales impliquait de faire la moyenne des changements quotidiens des paramètres indiqués par souris (jours 1 à 10 après l'infection ou pendant la survie). La signification statistique a été calculée avec le logiciel Prism 8.4.3 (GraphPad) et a impliqué des tests statistiques décrits dans les légendes des figures. L'analyse Probit dans Extended Data Fig. 5b a été réalisée avec SPSS, 21 (IBM). La taille des échantillons a été choisie en fonction de l'expertise antérieure et des publications dans notre domaine26,55 et est divulguée dans les légendes des figures. Les groupes d'animaux ont été répartis au hasard et les animaux témoins ont été appariés selon l'âge aux animaux expérimentaux. Le même chercheur a effectué le génotypage et l'analyse des réponses à la maladie, de sorte que les données n'ont pas été générées en aveugle au génotype ou au groupe expérimental.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données utilisées pour générer des chiffres, y compris les points de données comportementales de chaque souris individuelle, sont fournies en tant que données source. Tous les réactifs qui peuvent ne pas être disponibles dans le commerce, y compris certaines souris transgéniques et AAV, seront mis à disposition gratuitement sur demande raisonnable. Les données sources sont fournies avec ce document.

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Nous remercions C. Saper pour les souris Ptger3flox et les commentaires sur le manuscrit. Les dessins animés ont été créés à l'aide de BioRender.com. Ce travail a été soutenu par des subventions du NIH (DP1 AT009497 et R01 HL132255) et de l'initiative Chan Zuckerberg à SDL, une bourse postdoctorale Banting à N.-RB et une bourse Goldberg de la Harvard Medical School à NHSLP était un Warren Alperts Distinguished Scholar et SDL est un chercheur de l'Institut médical Howard Hughes.

Sarah L.Prescott

Adresse actuelle : Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, États-Unis

Howard Hughes Medical Institute, Département de biologie cellulaire, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Na-Ryum Bin, Sarah L. Prescott, Nao Horio, Yandan Wang et Stephen D. Liberles

Département d'immunologie, Harvard Medical School, Boston, MA, États-Unis

Isaac M. Chiu

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Expériences conçues par N.-RB, SLP, NH, IMC et SDL. N.-RB, NH, SLP et YW ont réalisé des expériences. N.-RB, SLP, NH, IMC et SDL ont analysé les données. N.-RB et SDL ont rédigé le manuscrit.

Correspondance à Stephen D. Liberles.

SDL est consultant pour Kallyope, Inc. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature remercie Alice McGovern, Ruslan Medzhitov et Kevin Tracey pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, L'analyse statistique des expériences comportementales impliquait la moyenne des changements quotidiens des paramètres indiqués par souris (jours 1 à 10 après l'infection ou pendant la survie), comme représenté ici dans les graphiques à barres. Les valeurs statistiques sont identiques à celles de la figure 1a. b, les niveaux de PGE2 dans le plasma (gauche, milieu) et BALF (droite) ont été mesurés par ELISA aux moments indiqués après exposition au virus de la grippe A (rouge, bleu) ou au véhicule témoin (noir). Certaines souris infectées par le virus (bleues) ont en outre reçu un accès ad libitum à l'ibuprofène (1 mg/ml) dans l'eau potable à partir de 3 jours avant l'infection (à gauche) ou ont reçu une administration quotidienne d'aspirine (IP, 20 mg/kg), moyenne ± sem, n : 3 souris par groupe, ***p < 0,0005 par ANOVA à deux voies suivie d'un test de comparaison multiple de Bonferroni avec des comparaisons entre les courbes rouges et noires (étoiles rouges) ou les courbes rouges et bleues ( étoiles bleues). les valeurs de p dans b sont <0,0001 pour toutes les étoiles indiquées.

Données source

a, Prise alimentaire par des souris à jeun ayant reçu de la PGE2 (gauche : IP, droite : intranasale) aux doses indiquées (mg/kg) et ayant accès à la nourriture à volonté (1 h), moyenne ± erreur type, n : 9 (gauche) souris par groupe, 28 (véhicule), 10 (0,0625, 0,125, 0,25), 20 (0,5) po (droite), ***p < 0,0005, **p < 0 0,005, *p < 0,05, ns : non significatif par le test de comparaison multiple de Tukey ANOVA à deux facteurs. b, Prise alimentaire par des souris à jeun ayant reçu l'agoniste des récepteurs EP3 sulprostone (gauche : IP, droite : intranasal) aux doses indiquées (mg/kg) et ayant eu accès à la nourriture à volonté (1 h), moyenne ± sem, n : 8 souris par groupe, ***p < 0,0005, *p < 0,05 par test de comparaison multiple de Tukey ANOVA bilatéral (gauche) ou test t bilatéral non apparié (droite). c, la fluorescence GCaMP6s (ΔF/F) a été mesurée dans les neurones AGRP du noyau arqué par photométrie sur fibre avant et après injection IP de PGE2 (0,5 mg/kg dans du PBS) ou de véhicule seul (PBS). (en haut) Les réponses sont représentées comme la moyenne des mesures effectuées dans des intervalles de temps de 10 minutes (par exemple, 10 se réfère à la moyenne des mesures effectuées entre 0 et 10 min), moyenne ± sem, n : 12 souris par groupe, **p < 0,01, ***p < 0,001 par ANOVA bidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Bonferroni, (en bas) représentant des traces d'enregistrement avec une barre rouge indiquant le temps d'injection. valeurs de p de gauche à droite dans a : IP : <0,0001, 0,0005, <0,0001, intranasal : <0,0001, 0,0455, 0,0008, 0,6630 ; b, IP : <0,0001, 0,0312, 0,0187, intranasale : <0,0001 ; c : <0,0001, <0,0001, 0,0045.

Données source

a, Température corporelle centrale dans flox-Ptger3 et Gabra1-ires-Cre ; Les souris flox-Ptger3 ont été mesurées quotidiennement après administration de virus de la grippe (rouge, bleu) ou de solution saline (noire) à l'aide d'une sonde rectale (gauche) ou d'une radiotélémétrie (droite), moyenne ± sem, n : 6 (gauche) et 3 (droite) souris par groupe, ***p < 0,0005 par test de comparaison multiple de Dunnett ANOVA unidirectionnel (gauche) ; *** p <0,0005 par test t bilatéral non apparié pour la droite, comme détaillé dans la Fig. 1 pour l'analyse comportementale/physiologique (à droite), les comparaisons entre les courbes rouges et noires (étoiles rouges) ou entre les courbes rouges et bleues (étoiles bleues). Pour les données de droite, deux des trois souris flox-Ptger3 témoins sont mortes au jour 5, donc les données suivantes sont représentées par une ligne pointillée et une analyse statistique a été effectuée uniquement sur les données des jours 1 à 4. b, Les souris ont reçu des injections quotidiennes d'aspirine (IP, 20 mg/kg), de rouge ou de véhicule seul (noir) tout au long du paradigme. Après trois jours, les souris ont été infectées par le virus de la grippe A et ensuite surveillées comme indiqué, moyenne ± sem, n : 6 souris par groupe, ***p < 0,0005 par test t bilatéral non apparié comme détaillé sur la figure 1 pour l'analyse comportementale/physiologique, *p < 0,05 par un test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de survie. valeurs de p dans a, gauche : rouge < 0,0001, bleu 0,0003, droite : < 0,0001 ; b, de gauche à droite : <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0243.

Données source

a, analyse qPCR de l'expression de Ptger3 dans l'hypothalamus (à gauche) ou les ganglions NJP (à droite) de flox-Ptger3 (blanc), Nestin-Cre ; flox-Ptger3 (rouge) et Phox2b-Cre ; souris flox-Ptger3 (bleu). Les souris Phox2b-Cre affichent l'expression de Cre dans les neurones noueux et pétreux mais pas dans les neurones jugulaires56. Les niveaux de transcription Ptger3 ont été exprimés après normalisation aux niveaux d'expression de Gapdh, moyenne ± sem, n : 6 souris pour flox-Ptger3 et 3 pour les autres groupes, ***p < 0,0005, ns : non significatif par le test de comparaison multiple de Dunnett ANOVA à un facteur. b, les souris témoins flox-Ptger3 ont été traitées avec (droite) ou sans (gauche) tamoxifène pendant 5 jours consécutifs (IP, 70 mg/kg) comme cela a été fait pour Advillin-CreER ; souris flox-Ptger3. Au moins une semaine plus tard, les souris ont été exposées au virus de la grippe A (rouge) ou à une solution saline (noire) et surveillées comme indiqué, moyenne ± sem, n : 6 souris par groupe, ***p < 0,0005 par test t non apparié à deux queues comme détaillé sur la figure 1 pour l'analyse comportementale/physiologique, *p < 0,05 par un test du log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de survie. valeurs de p dans a, gauche : <0,0001, 0,7506, droite : 0,8680, <0,0001 ; b de haut en bas, à gauche : <0,0001, <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0179, à droite : <0,0001, 0,0003, <0,0001, 0,0179.

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a, Des souris de type sauvage ont été infectées par le virus de la grippe A aux titres indiqués et la survie ultérieure a été contrôlée quotidiennement, n : 10 par groupe. b, une courbe dose-réponse du titre viral (log10) en fonction des taux de survie avec un ajustement non linéaire de R2 = 0,926. c, Un tableau indiquant les taux de survie à diverses doses d'inoculation du virus de la grippe A, avec le % de létalité estimé déterminé par l'analyse de régression Probit (Statistical Product and Service Solutions). d, Advillin-CreER ; Les souris flox-Ptger3 (rouges, préalablement injectées de tamoxifène) ou les souris flox-Ptger3 (noires) indiquées ont été infectées par des doses sublétales de virus de la grippe A (en haut : 105 EID50 ou LD21, en bas : 105,5 EID50 ou LD39) et surveillées quotidiennement comme indiqué, moyenne ± sem, n : 6 souris par groupe, ***p < 0,0005 par test t bilatéral non apparié comme détaillé dans la Fig. 1 pour l'analyse comportementale/physiologique, *p < 0,05, ns : non significatif par un test de log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de survie. p valeurs de gauche à droite dans d, haut : <0,0001, <0,0001, 0,0002, <0,0001, 0,4788 ; bas : <0,0001, <0,0001, 0,0004, 0,0004, 0,0078.

Données source

a, dessin animé illustrant l'injection bilatérale d'AAV-Cre dans les ganglions NJP de souris flox-Ptger3. b, Les ganglions NJP de souris flox-Ptger3 ont été injectés bilatéralement avec AAV-Cre (en bas) ou une solution saline (contrôle, en haut), et des cryosections de ganglions NJP ont ensuite été examinées par hybridation in situ d'ARN bicolore pour détecter Phox2b (vert) et Ptger3 (rouge), barre d'échelle : 100 μm. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes. Partie a créée avec BioRender.com.

Phox2b-Cre; Des souris flox-Ptger3 (rouges) ou des souris flox-Ptger3 (noires) ont été infectées par des doses sublétales de virus de la grippe A (en haut : 105 EID50 ou LD21, en bas : 105,5 EID50 ou LD39) et surveillées quotidiennement comme indiqué, moyenne ± sem, n : 6 souris par groupe, **p < 0,005, ***p < 0,0005 par test t bilatéral non apparié comme détaillé dans la Fig. 1 pour l'analyse comportementale/physiologique, *p < 0,05, ns : non significatif par un test de log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de survie. valeurs p de haut en bas à gauche : <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,4524 ; à droite : <0,0001, <0,0001, <0,0001, 0,0002, 0,0155.

Données source

a, Modifications de la consommation d'eau après une infection grippale chez les souris de la Fig. 3, moyenne ± sem, n : 8 (Piezo2-ires-Cre), 6-8 (Phox2b-Cre ; 8 témoins et 6 Phox2b-Cre), 6 (Pdyn-ires-Cre), 6 (Oxtr-ires-Cre) et 10 (Gabra1-ires-Cre) souris par groupe, ***p < 0,0005, ns : non significatif par le test t bilatéral non apparié, comme détaillé sur la figure 1 pour l'analyse comportementale/physiologique. b, Un graphique UMAP (Uniform Manifold Approximation and Projection) dérivé des données publiées sur le transcriptome unicellulaire des ganglions sensoriels vagaux et glossopharyngés22 indiquant l'expression de Trpv1 (ombrage rouge : échelle logarithmique naturelle). c, Trpv1-ires-Cre ; Des souris flox-Ptger3 (bleues) ou des souris flox-Ptger3 (noires) ont été infectées par le virus de la grippe A et surveillées quotidiennement comme indiqué, moyenne ± sem, n : 6 souris par groupe, ns : non significatif par un test t non apparié à deux queues comme détaillé sur la figure 1 pour l'analyse comportementale/physiologique, ns : non significatif par un test de log-rank (Mantel-Cox) pour l'analyse de survie. p valeurs de haut en bas dans a : 0,9101, 0,0004, 0,0534, 0,9544, <0,0001 et c : 0,2485, 0,0705, 0,0888, 0,1801, 0,8412.

Données source

a, les niveaux de PGE2 dans le plasma (à gauche) et BALF (à droite) ont été mesurés par ELISA chez des souris indiquées à différents moments après l'exposition au virus de la grippe A ou au contrôle PBS, moyenne ± sem, n : 5 souris par groupe, ns : non significatif par ANOVA à deux voies impliquant l'analyse des groupes infectés par le virus de la grippe. b, analyse qPCR des niveaux de transcription de la nucléoprotéine virale (NP) dans les voies respiratoires supérieures et inférieures de flox-Ptger3 et Gabra1-ires-Cre ; souris flox-Ptger3 après infection par le virus de la grippe, normalisées à Gapdh et témoins non infectés, moyenne ± sem, n : 5 souris par groupe, ***p < 0,0005 par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni avec des comparaisons faites entre les courbes rouges et bleues (étoiles bleues) ou les courbes noires et vertes (étoiles vertes). c, les niveaux d'IFNγ, de TNFα et d'IL-6 dans BALF ont été mesurés par ELISA aux moments indiqués après l'exposition au virus de la grippe A dans flox-Ptger3 (noir) ou Gabra1-ires-Cre ; flox-Ptger3 (rouge), moyenne ± sem, n : 3 souris par groupe, ***p < 0,0005 par ANOVA à deux voies suivie du test de comparaison multiple de Bonferroni avec des comparaisons faites entre les courbes rouges et noires (étoiles rouges). valeurs p en a : 0,1591, 0,0662, b et c : <0,0001 pour toutes les étoiles indiquées.

Données source

a, signaux fluorescents GFP natifs dans des préparations entières de ganglions NJP de Gabra1-ires-cre ; lsl-L10 GFP, barre d'échelle : 200 μm. b, les ganglions NJP de souris Gabra1-ires-Cre ont reçu une injection bilatérale d'AAV-flex-AP ou d'AAV-flex-tdTomato dépendant de Cre et les axones ont été visualisés dans des préparations de tissus entiers fixes en utilisant soit un substrat de phosphatase alcaline colorimétrique (deux premières rangées, images de gauche dans les deux rangées inférieures) ou immunocoloration tdTomato (deux images de droite dans les deux rangées inférieures). Barres d'échelle (de gauche à droite) rangée du haut : 500, 1000, 1000 (encart : 250) μm ; 2ème rangée : 500, 1000, 500 μm ; 3ème rangée : 200, 50 μm ; rangée du bas : 200, 100 μm. Les images sont représentatives de trois expériences indépendantes impliquant GFP et tdTomato et de deux expériences indépendantes impliquant la phosphatase alcaline.

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Réimpressions et autorisations

Bin, NR., Prescott, SL, Horio, N. et al. Une voie sensorielle des voies respiratoires au cerveau médie la maladie induite par la grippe. Nature 615, 660–667 (2023). https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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Reçu : 13 avril 2022

Accepté : 03 février 2023

Publié: 08 mars 2023

Date d'émission : 23 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-023-05796-0

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