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Oct 26, 2023

Identification des ancêtres et SRAS

Nature tome 588, pages

Nature volume 588, pages 670–675 (2020)Citer cet article

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Détails des métriques

Le poumon distal contient des bronchioles terminales et des alvéoles qui facilitent les échanges gazeux. Des systèmes tridimensionnels de culture pulmonaire distale humaine in vitro faciliteraient grandement l'investigation de pathologies telles que la pneumonie interstitielle, le cancer et la pneumonie à coronavirus 2019 (COVID-19) causée par le syndrome respiratoire aigu sévère coronavirus 2 (SARS-CoV-2). Nous décrivons ici le développement d'un système de culture à long terme sans alimentation et chimiquement défini pour les progéniteurs pulmonaires distaux en tant qu'organoïdes dérivés d'un seul adulte épithélial alvéolaire humain de type II (AT2) ou de cellules basales KRT5 +. Les organoïdes AT2 ont pu se différencier en cellules AT1, et les organoïdes basocellulaires ont développé des lumières bordées de cellules massues et ciliées différenciées. L'analyse unicellulaire des cellules KRT5 + dans les organoïdes basaux a révélé une population distincte de cellules mitotiques ITGA6 + ITGB4 +, dont la progéniture s'est ensuite séparée en une sous-fraction TNFRSF12Ahi qui comprenait environ 10% des cellules basales KRT5 +. Cette sous-population a formé des grappes dans les bronchioles terminales et a présenté une activité de croissance organoïde clonogénique enrichie. Nous avons créé des organoïdes pulmonaires distaux avec une polarité apicale pour présenter l'ACE2 sur la surface externe exposée, facilitant l'infection des cultures AT2 et basales avec le SRAS-CoV-2 et identifiant les cellules du club comme population cible. Cette culture à long terme et sans alimentation d'organoïdes pulmonaires distaux humains, couplée à une analyse unicellulaire, identifie l'hétérogénéité fonctionnelle parmi les cellules basales et établit un modèle organoïde in vitro facile d'infections pulmonaires distales humaines, y compris la pneumonie associée au COVID-19.

Le poumon distal remplit des fonctions respiratoires essentielles qui peuvent être compromises par des troubles inflammatoires, néoplasiques ou infectieux tels que la pneumonie COVID-19. L'étude de ces conditions serait facilitée par des modèles in vitro robustes basés sur des cellules humaines. L'identité des cellules souches qui régénèrent l'épithélium pulmonaire distal in vivo au cours de la vie humaine a été déduite d'études sur la souris, malgré les différences entre ces espèces1. Chez l'homme, les cellules souches basales recouvrent l'ensemble de l'arbre des voies respiratoires, alors que chez la souris, les cellules club2 et/ou les cellules non club3 exprimant la sécrétoglobine 1A1 (SCGB1A1) renouvellent les bronchioles distales au cours du vieillissement. Dans la région des échanges gazeux, les cellules épithéliales alvéolaires de souris de type II (AT2) génèrent des cellules AT1 et AT2 pendant l'homéostasie4,5, et des progéniteurs supplémentaires sont recrutés en réponse à une blessure grave3,6,7,8,9. La présence et/ou les rôles des progéniteurs facultatifs dans le poumon humain sont inconnus. Les cellules AT2 humaines peuvent être différenciées en cellules AT1, mais ces cultures sont de courte durée et ne démontrent pas d'auto-renouvellement à long terme ou ne permettent pas l'expansion pour la modélisation de la maladie4,10,11 ; de plus, leurs besoins en cellules nourricières empêchent la définition de composants de niche spécifiques12,13. Nous avons établi une culture organoïde à long terme du poumon humain distal, y compris AT2 et des cellules souches basales, et avons utilisé ce système pour valider les cellules progénitrices fonctionnelles et modéliser l'infection par le SRAS-CoV-2.

Nous avons défini empiriquement des conditions moyennes pour soutenir l'expansion clonale des progéniteurs pulmonaires humains distaux de 136 individus dans la matrice extracellulaire collagène/laminine (ECM) (Fig. 1a, Tableau supplémentaire 1). Ensemble, l'EGF et l'antagoniste du BMP NOGGIN ont soutenu la croissance de cellules pulmonaires distales désagrégées ou de leurs fractions épithéliales purifiées (Extended Data Fig. 1a – c). Des cellules individuelles (données étendues Fig. 1d – g) se sont développées en organoïdes kystiques SFTPC + HTII-280 + AT2 (Fig. 1b – e) ou en organoïdes solides KRT5 + exprimant le marqueur cellulaire basal KRT5 (Fig. 1b, f – h).

un. Les cultures organoïdes pulmonaires distales humaines D14 (jour 14) contiennent des organoïdes kystiques et solides. En bas à gauche, fond clair ; à droite, hématoxyline et éosine (H&E). Barre d'échelle, 100 μm. b, Immunofluorescence entière avec des anticorps anti-KRT5 (cellule basale), anti-SFTPC (cellule AT2) et anti-SCGB1A1 (cellule club). Barre d'échelle, 100 μm. c – e, organoïdes alvéolaires sur D32. c, organoïde AT2 kystique. IL; barre d'échelle, 25 μm. d, Immunofluorescence complète pour anti-SFTPC, anti-HTII-280, phalloïdine (Ph) et DAPI ; barre d'échelle, 50 μm. e, fluorescence anti-KI67 et DAPI d'une section adjacente à d. f – h, organoïdes basaux sur D32. f, H&E ; barre d'échelle, 50 μm. g, Immunofluorescence complète pour anti-KRT5 et DAPI ; barre d'échelle, 100 μm. h, immunomarquage anti-KI67 et DAPI de la section adjacente à g. i – k, ARN-seq unicellulaire des organoïdes pulmonaires distaux totaux à J28. i, parcelle d'intégration de voisins stochastiques distribués en t (t-SNE) de 7 285 cellules individuelles démontrant des populations AT2, basales et de club. j, Expression de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) et SCGB1A1 (club). k, Tracés de caractéristiques pour l'expression de SFTPC (AT2), KRT5 (basal) et SCGB1A1 (club). l–p, culture organoïde clonogénique AT2. l, Microscopie fond clair des organoïdes AT2 à J180 ; barre d'échelle, 200 μm. m, coloration H&E de la culture comme dans l ; barre d'échelle, 50 μm. n, Microscopie électronique à transmission de l'organoïde AT2 à J32. LB, corps lamellaire ; barre d'échelle, 5 μm. o, p, Immunofluorescence de l'organoïde AT2 à J32 (o) ; la culture sur verre pendant 10 jours supplémentaires induit la différenciation en cellules AT1 (p). Immunofluorescence pour anti-HTI-56 (AT1) et anti-HTII-280 (AT2); barre d'échelle, 50 μm. q, scRNA-seq présentent des tracés de 2 780 cellules organoïdes AT2 à J89 de culture cumulative.

Le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) d'organoïdes pulmonaires distaux a confirmé la présence de populations de cellules SFTPC + AT2, de cellules basales KRT5 + et de cellules club SCGB1A1 + (Fig. 1i, j, Extended Data Fig. 2). Des cellules co-exprimant KRT5 et SCGB1A1 ont été trouvées dans les populations de cellules basales et de cellules club, suggérant un état de transition (Fig. 1j, k, données étendues Fig. 2) qui a été étayé par les résultats de l'analyse de trajectoire SPADE14 et Monocle15 (données étendues Fig. 3, tableau supplémentaire 2).

Nous avons généré des organoïdes AT2 purs à partir de cultures mixtes via l'absorption de colorants lysosomiques dans les corps lamellaires (données étendues Fig. 4a, b, Fig. 1 supplémentaire). Les cellules EPCAM + LysoTracker + AT2 se sont multipliées par clonage jusqu'à 180 jours (Fig. 1l, m, Extended Data Fig. 4c, d). Le milieu EGF / NOGGIN chimiquement défini était suffisant pour la prolifération clonale de base des organoïdes AT2, qui a été atténuée en bloquant la biosynthèse WNT endogène globale (Extended Data Fig. 4e), conformément à l'exigence de signalisation WNT autocrine dans les cellules AT2 de souris16. La croissance a été améliorée en ajoutant un milieu conditionné de fibroblastes contenant du sérum et des agonistes WNT (Extended Data Fig. 4f). La microscopie électronique à transmission a révélé des microvillosités et des corps lamellaires caractéristiques des cellules AT2 matures (Fig. 1n, Extended Data Fig. 4g). Les organoïdes AT2 ont montré une régulation positive des marqueurs AT1 lorsqu'ils ont été cultivés sur du verre avec du sérum (Fig. 1o, p).

L'ARN-seq unicellulaire d'organoïdes pulmonaires distaux mixtes ou d'organoïdes alvéolaires purifiés a révélé une expression uniformément élevée de marqueurs cellulaires AT2 canoniques dans les populations alvéolaires (Fig. 1i – k, q, Données étendues Fig. 2, Données supplémentaires 1). Les sous-ensembles de cellules AT2 n'ont pas été facilement observés et les ARNm liés au cycle cellulaire ne se sont pas localisés dans une sous-population AT2 spécifique (Fig. 1q, Données supplémentaires 1, Tableau supplémentaire 3).

Les organoïdes basocellulaires dans la culture pulmonaire distale mixte se sont développés plus rapidement que les organoïdes alvéolaires et ont initialement formé des sphéroïdes KRT5 + solides (Fig. 1a, b, f – h). Cependant, après un mois de culture, environ 50% des organoïdes avaient développé une ou parfois plusieurs lumières (Fig. 2a, b, Données étendues Fig. 5a – c) avec des cellules massues (SCGB1A1 + KRT5 –) et ciliées (AcTUB + KRT5 –) tapissant la surface intérieure (Fig. 2a, b). Les cultures basales purifiées par sédimentation de densité présentaient une excroissance clonale en série, une dépendance à l'EGF et à la NOGGIN et une cavitation doublée de cellules ciliées luminales SCGB1A1 + club et AcTUB + (Fig. 2c, d, Données étendues Fig. 5d – h, Vidéos supplémentaires 1, 2). Une différenciation similaire s'est produite lorsque les organoïdes ont été transférés dans des cultures d'interface air-liquide (ALI) 2D (Fig. 2e).

a, b, Immunofluorescence montrant une différenciation organoïde basale en culture mixte. Les lumières sont tapissées de cellules ciliées de tubuline acétylée + (AcTUB), qui expriment le récepteur ACE2 du SRAS-CoV-2 mais manquent de KRT5 (a) et de cellules club SCGB1A1 + (b). Barre d'échelle, 20 μm. c–e, Culture organoïde basale sédimentée. c, différenciation des cellules Club dans des organoïdes basaux purifiés après 38 jours en culture clonogénique 3D, illustrée par la fluorescence totale pour l'anti-SCGB1A1 (rouge), la phalloïdine (blanche) et le DAPI (bleu) ; barre d'échelle, 50 μm. d, différenciation ciliée des organoïdes comme dans c. Image de transmission confocale ; barre d'échelle, 20 μm. Boîte blanche en médaillon élargie à l'image principale ; les pointes de flèches désignent les cils. e, Immunofluorescence montrant des cellules de club ciliées AcTUB + et SCGB1A1 + dans un organoïde qui a été replaqué dans une culture ALI 2D. Barre d'échelle, 50 μm. f, g, ARN-seq unicellulaire de cellules basales KRT5 + de la Fig. 1i. f, tracés t-SNE montrant les sous-clusters Basal 1 et Basal 2. Basal 1 est subdivisé en Basal 1.1 et 1.2, ce dernier exprimant les ARNm prolifératifs CDK1 et PCNA. g, expression génique différentielle dans les sous-clusters Basal 1 et Basal 2 à partir d'un total de 2 303 cellules basales. h, superpositions t-SNE du transcrit du marqueur basal de f (nombre log10 d'identificateurs moléculaires uniques (UMI)). i, Parcelles cinétiques d'expression génique relative de f et g sur la trajectoire pseudo-temporelle (n = 3 721 cellules). j, isolement FACS des cellules TNFRSF12Ahi par rapport aux cellules TNFRSF12Aneg à partir d'organoïdes pulmonaires distaux mixtes, pré-fermés sur des singulets vivants. k, image en fond clair d'une culture organoïde de cellules de j à J14. l, Quantification de k (nombre d'organoïdes pour 1 000 cellules) ; ***P < 0,001 (P = 1,0 × 10−4), test t de Student bilatéral. Les données dans j, k représentent n = 5 expériences indépendantes pour chaque population TNFRSF12A.

Données source

Le regroupement unicellulaire d'ARN-seq de cellules basales organoïdes KRT5 + de plusieurs individus a identifié de manière reproductible deux populations: Basal 1 et Basal 2 (Fig. 2f, g, Données étendues Fig. 6a, Données supplémentaires 1). Basal 1 comprenait une sous-population à cycle actif (Basal 1.2) qui était enrichie en marqueurs de prolifération (PCNA, CDK1) et en processus liés au cycle cellulaire de l'analyse de l'enrichissement des cellules géniques (GSEA) (Fig. 2f, g, Données étendues Fig. 6a – c, Tableau supplémentaire 3). Basal 1, mais pas Basal 2, exprimait des ARNm canoniques de cellules basales pulmonaires tels que TP6317, l'intégrine-α6 (ITGA6) et l'intégrine-β4 (ITGB4, qui code un partenaire de liaison de ITGA618 et marque les progéniteurs épithéliaux négatifs de la lignée de souris (LNEP)) 7 (Fig. 2h). Basal 2 était enrichi en expression de gènes liés au transport vésiculaire, aux processus du réticulum endoplasmique et aux marqueurs squameux (Fig. 2g, Tableau supplémentaire 3).

Nous avons examiné le gène Basal 1 exprimé de manière différentielle TNFRSF12A (également connu sous le nom de Fn14, TWEAKR), qui code pour un récepteur membranaire (Fig. 2g, h, Tableau supplémentaire 4) en raison de son utilité potentielle pour l'isolement du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) et son homologie avec le marqueur de cellules souches intestinales TNFRSF1919. Une analyse pseudo-temporelle impartiale a révélé une trajectoire unicellulaire continue reliant les cellules KRT5 + Basal 1 aux cellules club SCGB1A1 +, l'ARNm TNFRSF12A étant fortement associé au gène marqueur de prolifération MKI67 (Fig. 2i, Données étendues Fig. 3e). Lorsque les cellules basales 1 co-exprimant EPCAM, ITGA6 et ITGB4 ont été divisées en trois fractions (exprimant des niveaux faibles, moyens et élevés d'ARNm de TNFRSF12A), un module de gène prolifératif20 a été significativement enrichi dans la fraction la plus élevée (TNFRSF12Ahi) par rapport à la fraction la plus basse (TNFRSF12Alo) (Extended Data Fig. 6d – f). Pour déterminer si cet enrichissement reflétait un potentiel prolifératif intrinsèque, nous avons fractionné les organoïdes pulmonaires distaux totaux par FACS en cellules EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + Basal 1, puis en sous-ensembles TNFRSF12Ahi et TNFRSF12Aneg (Fig. 2j). Lorsqu'il est cultivé, le sous-ensemble TNFRSF12Ahi a montré une capacité de formation d'organoïdes clonogéniques 4 à 12 fois supérieure à celle du sous-ensemble TNFRSF12Aneg (Fig. 2k, l).

Nous avons examiné les relations de lignée entre Basal 1 et Basal 2 en fractionnant les organoïdes basaux KRT5 + sédimentés par densité par FACS en populations EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + TNFRSF12Ahi (Basal 1) et EPCAM + ITGA6 − ITGB4 − TNFRSF12Aneg (Basal 2) (données étendues Fig. 7a). La formation d'organoïdes clonogéniques a été fortement enrichie dans Basal 1 par rapport à Basal 2 à partir de trois individus distincts (données étendues Fig. 7b – d). Les gènes SPRR1B et TMSB4X enrichis en 2 basaux (Fig. 2g, Tableau supplémentaire 3) ont été induits de manière transitoire dans des organoïdes cellulaires Basal 1 (Données étendues Fig. 7e, f), ce qui suggère que les cellules Basal 2 pourraient se différencier de Basal 1.

Le gène cible NOTCH HES1 était l'un des loci les plus différentiellement exprimés dans les organoïdes Basal 1, dans lesquels les réseaux de gènes comprenaient NOTCH1, NOTCH2 et JAG1 (Fig. 2g, Tableau supplémentaire 3). L'inhibition de NOTCH a augmenté de manière significative la prolifération basale des organoïdes à partir des cellules TNFRSF12AhiEPCAM + ITGA6 + ITGB4 + (données étendues Fig. 7g, h), ce qui suggère que la signalisation NOTCH limite la croissance de ces cellules. Inversement, l'agonisme NOTCH n'a pas affecté la prolifération, mais a induit l'expression de SCGB1A1, similaire aux cellules des voies respiratoires supérieures21,22 (Extended Data Fig. 7i).

L'immunomarquage du tissu pulmonaire distal humain a montré des cellules basales TNFRSF12A + enrichies par intermittence aux extrémités ou aux bases des sillons bronchiolaires (Fig. 3a, Données étendues Fig. 8a, b); ces derniers sont reconnus comme une niche de cellule caliciforme23. Nous avons trouvé TNFRSF12A dans diverses cellules stromales et épithéliales pulmonaires, mais il marquait clairement une population mineure de cellules basales KRT5 + et p63 + (Fig. 3a, Données étendues Fig. 8a – c). Le sous-ensemble TNFRSF12A + de cellules basales KRT5 + avait un indice mitotique supérieur à celui des cellules KRT5 + totales in vivo (Fig. 3b, c), ce qui correspond aux résultats de l'organoïde scRNA-seq (Fig. 2i). L'analyse FACS des cellules pulmonaires distales humaines a confirmé que TNFRSF12A était exprimé dans 10, 9% des cellules basales (données étendues Fig. 8d, en haut).

a, Gauche, immunofluorescence anti-KRT5 et anti-TNFRSF12A du poumon distal humain. La zone encadrée jaune est agrandie avec (au milieu) et sans (à droite) DAPI. Barres d'échelle, 100 μm. b, Immunofluorescence de la prolifération des cellules basales des voies respiratoires distales TNFRSF12A + montrant KRT5, TNFRSF12A, KI67 et DAPI. Barre d'échelle, 100 μm. c, indice mitotique des cellules TNFRSF12A+KRT5+ de b ; trois expériences indépendantes. K5+, total KRT5+ ; K5+T+, TNFRSF12A+KRT5+. Les boîtes à moustaches représentent le premier quartile, la médiane et le troisième quartile ; les moustaches indiquent le minimum et le maximum. **P < 0,01 (P = 4,4 × 10−3), test t de Student bilatéral. d, immunofluorescence en fond clair et anti-KRT5 de cultures d'organoïdes TNFRSF12Aneg et TNFRSF12Ahi isolées par FACS à J14 ; barres d'échelle, 500 μm. e, Quantification de d (nombre d'organoïdes pour 1 000 cellules) ; les données représentent n = 5 expériences indépendantes pour chaque population TNFRSF12A. Les boîtes à moustaches représentent le premier quartile, la médiane et le troisième quartile ; les moustaches indiquent le minimum et le maximum. P = 1,1 × 10−3, test t de Student bilatéral. f, H&E et immunomarquage anti-KRT5, anti-TNFRSF12A, anti-SCGB1A1 et anti-AcTUB d'organoïdes de la fraction TNFRSF12Ahi de cellules pulmonaires distales EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + triées par FACS. Barres d'échelle, 50 μm. g, H&E et immunofluorescence anti-SCGB1A1 et anti-AcTUB de cultures ALI 2D à partir d'organoïdes de cellules basales de cellules basales TNFRSF12Ahi comme dans f. Barres d'échelle, 50 μm.

Données source

Lors d'une culture prospective directement à partir de poumon humain sans intermédiaire organoïde, les cellules EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + TNFRSF12Ahi isolées par FACS (cellules TNFRSF12Ahi Basal 1; Données étendues Fig. 8d, en bas) ont montré une augmentation de 15 fois de la formation d'organoïdes KRT5 + par rapport aux cellules EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + TNFRSF12Aneg (cellules TNFRSF12neg Basal 1; Fig. 3d, e). Les organoïdes basaux TNFRSF12Ahi se sont également différenciés en cellules ciliées SCGB1A1 + club et AcTUB + en culture prolongée (Fig. 3f) ou lorsqu'ils sont cultivés en monocouches ALI 2D (Fig. 3g).

Le virus de la grippe H1N1 infectait avidement les organoïdes pulmonaires distaux, qui exprimaient également les récepteurs de la grippe (données étendues Fig. 9a – d), similaires aux organoïdes des voies respiratoires proximales24,25. L'infection d'organoïdes par la grippe H1N1 PR8 a été inhibée par des analogues de nucléosides, conformément aux études précédentes26 (Extended Data Fig. 9e), et le criblage de diverses classes de composés antiviraux dans un format à 48 puits a révélé une activité différentielle (Extended Data Fig. 9f), suggérant que ce système pourrait être utilisé pour la découverte de thérapies évolutives.

Dans la pneumonie COVID-19, une infection sévère par le SRAS-CoV-2 du poumon distal induit des lésions alvéolaires et une insuffisance respiratoire27. Le scRNA-seq organoïde à des moments avant la différenciation ciliée a identifié l'expression du récepteur ACE2 du SRAS-CoV-2 et le traitement des ARNm de la protéase TMPRSS2 principalement dans les cellules club et AT2 (données étendues Fig. 10a), ce qui correspond à l'expression de l'ACE2 dans les cellules luminales intérieures différenciées KRT5− (Fig. 2a). Pour faciliter l'accès du SRAS-CoV-2 aux cellules luminales exprimant l'ACE2, nous avons adapté une méthode de polarisation de culture en suspension apicale28 aux organoïdes pulmonaires distaux (données étendues Fig. 10b). En 48 h de suspension, les organoïdes se sont réorganisés en sphéroïdes épithéliaux apicaux avec des microvillosités, des jonctions apicales et des cils mobiles faisant face à l'extérieur de l'organoïde. La différenciation des cellules ciliées orientées vers l'extérieur s'est accélérée sur cinq jours et a progressé sur des semaines (Fig. 4a, Données étendues Fig. 10c – f, Vidéo supplémentaire 3). Les organoïdes basaux apicaux ont également montré une augmentation des cellules de club tournées vers l'extérieur avec des granules sécrétoires apicaux (Fig. 4a, données étendues Fig. 10g), et les organoïdes AT2 apicaux ont montré une différenciation en cellules AT1 (données étendues Fig. 10h – j). Surtout, dans les organoïdes apicaux, l'ACE2 s'est localisé sur les membranes cellulaires apicales sur la surface externe de l'organoïde (Fig. 4b, Extended Data Fig. 10k).

a, Immunofluorescence comparant la polarisation et la localisation de surface des cellules club SCGB1A1 + (vert) et des cellules ciliées AcTUB + (blanc) lors d'une croissance non polarisée intégrée à l'ECM (à gauche) ou d'une culture en suspension apicale (à droite). b, Coupes transversales d'organoïdes basaux apicaux comme dans un coloré avec anti-ACE2, anti-SCGB1A1 et DAPI. c, PCR quantitative pour l'ARN génomique non épissé du SRAS-CoV-2 (ARNg, à gauche) et sgARN épissé (à droite) dans les organoïdes pulmonaires distaux apicaux, 72 h après l'infection (hpi), normalisé au snoARN U3 ; n = 2 expériences indépendantes. d, Immunofluorescence anti-ARNdb d'organoïdes pulmonaires distaux humains apicaux, soit infectés par un faux, soit infectés par le SRAS-CoV-2, 48 hpi. e, Immunofluorescence pour la protéine de nucléocapside (NP) du SRAS-CoV-2 dans des organoïdes apicaux infectés ou faussement infectés à 96 hpi. f, Immunofluorescence d'organoïdes AT2 apicaux infectés par le SRAS-CoV-2 avec les anticorps indiqués à 96 hpi. g, colocalisation par immunofluorescence de SARS-CoV-2 NP et SCGB1A1 dans des organoïdes basaux pulmonaires distaux apical-out à 96 hpi. h, Immunofluorescence montrant la spécificité de type cellulaire dans les organoïdes apicaux infectés par le SRAS-CoV-2. Inf, cellule infectée par le SARS-CoV-2. Dans c–h, les organoïdes étaient en suspension pendant 6 à 10 jours (basal) ou 3 jours (AT2) avant l'infection. Barres d'échelle, 20 μm sauf pour f, h (10 μm).

Organoïdes pulmonaires distaux mixtes infectés par le SRAS-CoV-2, avec induction d'ARN génomique du SRAS-CoV-2 non épissé atteignant des niveaux similaires à ceux du petit ARN nucléolaire U3 abondamment exprimé (Fig. 4c, à gauche). De plus, les organoïdes infectés ont montré un ARN sous-génomique épissé spécifique au SRAS-CoV-2 (sgRNA; Fig. 4c, à droite) et la production de virions infectieux avec formation de plaques de cellules VeroE6 (35 PFU ml-1 à partir de lysats d'organoïdes et 65 PFU ml-1 à partir de surnageants d'organoïdes). Dans les organoïdes basaux infectés par le SRAS-CoV-2, l'ARN double brin (ARNdb) est apparu 48 h après l'infection (Fig. 4d) et la protéine de nucléocapside (NP) du SRAS-CoV-2 96 h (Fig. 4e). Environ 10 % des organoïdes AT2 ont affiché une expression proéminente de SARS-CoV-2 NP dans les cellules SFTPC+ ; les organoïdes restants étaient dépourvus d'infection (Fig. 4f). De même, le SRAS-CoV-2 a infecté environ 10 % des organoïdes basaux. Dans 2 621 cellules basales totales des voies respiratoires distales représentant des cultures de quatre individus (tableau supplémentaire 5), l'infection par le SARS-CoV-2 n'a pas été détectée dans les cellules basales KRT5+ ou ciliées AcTUB+ (rapport de cotes 0, P < 0,05), contrairement à l'infection des cellules ciliées des voies respiratoires supérieures par le SARS-CoV-2 dans la culture ALI 2D29,30. Cependant, l'immunofluorescence SARS-CoV-2 NP et dsRNA était principalement présente dans les cellules club SCGB1A1 + (Fig. 4g, h) qui étaient fortement associées et représentaient 79% des cellules positives pour NP ou ARNdb (rapport de cotes 19, 33, P <0, 0001); 21% des cellules infectées manquaient de SCGB1A1 (Fig. 4g, h, tableau supplémentaire 5). Dans l'ensemble, ces études indiquent que les cellules AT2 ont été directement infectées par le SRAS-CoV-2 et suggèrent que les cellules club sont une population cible pulmonaire distale.

Nous avons appliqué des cultures organoïdes pulmonaires distales humaines à long terme à la découverte de progéniteurs et à la modélisation de maladies infectieuses. Nos découvertes s'étendent sur les méthodes antérieures de culture pulmonaire adulte à court terme et dépendantes de l'alimentation4,10,11 et présentent une alternative aux techniques impliquant la différenciation des cellules souches pluripotentes inductibles31,32,33,34. Les organoïdes contenaient deux sous-types apparentés de cellules basales pulmonaires distales humaines KRT5 + - Basal 1 et Basal 2. Notamment, la fraction Basal 1 exprimant TNFRSF12A possédait une activité progénitrice clonogénique enrichie, établissant un précédent fonctionnel pour un sous-type de cellules basales enrichi en prolifération. Bien que TNFRSF12A ne soit en aucun cas exclusivement présent dans les cellules basales, dans la couche basale, il se localise souvent dans une niche postulée dans les bases et les extrémités des sillons des voies respiratoires23, étendant les notions récentes selon lesquelles l'épithélium pulmonaire présente une spécialisation spatiale35. Il est possible que TNFRSF12A ou des marqueurs analogues puissent distinguer des sous-ensembles de progéniteurs de cellules basales dans d'autres tissus. Nos organoïdes permettent également une exploration facile de l'infection pulmonaire distale par le SRAS-CoV-2, qui est pertinente pour la pneumonie associée au COVID-1927, et impliquent les cellules du club SCGB1A1+ comme cible dont l'infection pourrait compromettre les glycosaminoglycanes pulmonaires protecteurs et précipiter un cercle vicieux d'infection. Nous n'avons pas observé d'infection des cellules ciliées, contrairement aux études pulmonaires ALI 2D29,30 ; cela pourrait nécessiter des conditions de culture alternatives. Des populations négatives pour SCGB1A1 ont également été infectées et font l'objet d'investigations plus approfondies ; par exemple, les cellules sécrétoires transitoires bronchiques expriment ACE2 et TMPRSS236.

Dans l'ensemble, l'analyse unicellulaire des cultures organoïdes, telle que décrite ici, peut représenter une stratégie générale pour identifier et valider fonctionnellement les cellules souches candidates dans des tissus à prolifération lente. La culture de progéniteurs pour toutes les lignées épithéliales pulmonaires distales humaines adultes, y compris les alvéoles, devrait permettre la modélisation de maladies telles que les affections pulmonaires néoplasiques et interstitielles12 et permettre des applications d'ingénierie tissulaire et de médecine de précision. Enfin, ce système organoïde devrait faciliter diverses enquêtes sur les agents pathogènes pulmonaires, y compris l'infection pulmonaire distale par le SRAS-CoV-2 associée à une insuffisance respiratoire fulminante.

Des détails expérimentaux supplémentaires se trouvent dans les méthodes supplémentaires. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Les expériences n'ont pas été randomisées et les chercheurs n'ont pas été aveuglés à l'attribution pendant les expériences et l'évaluation des résultats.

Toutes les expériences réalisées dans ce travail ont été approuvées par le comité d'examen institutionnel de la faculté de médecine de l'Université de Stanford et réalisées sous le protocole no. 28908. Le consentement éclairé standard pour la recherche a été obtenu par écrit de tous les patients qui ont contribué à cette étude avant le prélèvement de tissus et toutes les expériences ont suivi les directives et réglementations pertinentes. Le tissu pulmonaire périphérique à moins de 1 cm de la plèvre viscérale a été obtenu à partir de tissu chirurgical mis au rebut lors de lobectomies. Pour les patients suspects de cancer du poumon, les cas de maladie clinique T4 (American Joint Cancer Committee 6e édition) (par exemple, des caractéristiques telles qu'une invasion bronchique ou des nodules/métastases satellites parenchymateux) ont été différés. Le tissu normal a été retiré de la marge pulmonaire la plus distale anatomiquement aux lésions palpablement bien définies, ou des lobes non impliqués dans le cas des pneumonectomies. Les échantillons avec des tumeurs contenant des marges mal définies ont été différés. Le tissu a été traité frais ou stocké à 4 ° C pendant la nuit et traité le lendemain matin.

Pour isoler les cellules distales des voies respiratoires, le parenchyme pulmonaire à 1 cm de la plèvre viscérale a été mécaniquement dissocié avec des ciseaux de Castro, lavé et incubé avec 5 unités par ml d'élastase porcine (Worthington), 100 unités Kunitz par ml de DNase I (Worthington) et Normocin (InvivoGen), et remis en suspension dans deux volumes de tissu de milieu organoïde pulmonaire, comprenant du DMEM/F12 avancé (Invitrogen) complété par Nicotinamide 10 mM, N-acétyl cystéine, supplément 1 × B27 moins vitamine A, NOGGIN humain recombinant (100 ng ml-1, R&D Systems), EGF humain recombinant (50 ng ml-1, R&D Systems) et inhibiteur du TGF-β A83-01 (100 nM, Tocris). Ce milieu organoïde pulmonaire a été utilisé pour toutes les expériences à l'exception de celles présentées dans les données étendues Fig. 4f. Le tissu a ensuite été agité pendant 1 h à 37 ° C et la suspension cellulaire résultante a été filtrée à travers des tamis cellulaires de 100 à 40 μm et soumise à une lyse des globules rouges au chlorure d'ammonium. Le culot cellulaire a ensuite été lavé et remis en suspension dans 10 volumes de facteur de croissance réduit Basement Membrane Extract II (Trevigen). Les cellules de la matrice ont ensuite été étalées dans des plaques à 24 puits dans des gouttelettes de 50 μl, et un milieu chaud a été ajouté après la solidification des gouttelettes pendant 10 min à température ambiante. Le milieu a été changé tous les 3 à 4 jours et les organoïdes ont été passés toutes les 3 à 4 semaines par dissociation avec TrypLE. Le passage était basé sur la durabilité et l'intégrité de l'ECM et la confluence organoïde estimée, jugée par le volume organoïde estimé par rapport au volume de la gouttelette ECM. Les organoïdes pulmonaires distaux pourraient être passés pendant environ 6 mois avec des organoïdes basaux présentant initialement 6 à 7 doublements toutes les 2 semaines. Les organoïdes alvéolaires se sont développés plus lentement avec un taux initial de 3 à 4 doublements toutes les 2 semaines, mais ont prédominé sur les organoïdes basaux après plusieurs mois. Calculées à partir des taux de division cellulaire initiaux, les limites supérieures de l'expansion basale et alvéolaire étaient respectivement de 219 (524 288 fois) et 216 (65 536 fois). Pour exclure la contamination par des cellules malignes, des cultures à long terme ont été systématiquement évaluées pour la présence de dysplasie ou de carcinome par un pathologiste certifié. De plus, cinq cultures d'organoïdes à long terme (2 à 6 mois) ont subi un séquençage ciblé de nouvelle génération pour exclure les variants nucléotidiques pathogènes (voir ci-dessous). Tous les détails sont fournis dans les méthodes supplémentaires.

Le poumon distal a été dissocié comme ci-dessus, et toutes les étapes d'incubation ont été réalisées sur de la glace. Nous avons incubé 107 cellules avec Fc Block (Biolegend 422301) et les avons diluées au 1/100 dans du tampon FACS (2 mM EDTA et 0,2 % de sérum de veau fœtal dans 1 × PBS, pH 7,4), pendant 10 min. Les cellules ont ensuite été mélangées avec des anticorps anti-CD45 conjugués à l'APC à 1 μg ml-1 dans du tampon FACS pendant 30 min, lavées et soumises à deux cycles de déplétion avec des billes magnétiques selon le protocole du fabricant (Miltenyi : anti-human fibroblast 130-050-601, anti-CD31 130-091-935, anti-APC 130-090-855, LS colonne 130-042-401). Les cellules non marquées ont ensuite été centrifugées à 300 g et marquées avec un cocktail de 1 μg ml-1 d'anticorps anti-EPCAM PerCP-Cy5.5 et de colorant de viabilité Zombie Aqua (Biolegend 423101) dilué au 1: 400 à partir de la concentration du stock dans du tampon FACS.

Pour la cryoconservation et la récupération, les gouttelettes d'ECM ont été dissociées par pipetage dans trois volumes de PBS avec 5 mM d'EDTA, puis incubées sur de la glace pendant 1 h. Les cellules ont été culottées à 300 g pendant 5 min et remises en suspension dans un milieu de congélation (sérum de veau fœtal (Gibco), 10 % v/v DMSO), placées dans des cryovials puis dans des conteneurs Mr. Frosty (Thermo Fisher) et stockées à -80 °C pendant la nuit, suivi d'un transfert en phase vapeur d'azote liquide pour un stockage à long terme. Les organoïdes ont été récupérés par décongélation rapide dans un bain-marie à 37 ° C, suivi d'un lavage dans un milieu organoïde et d'un placage dans de l'ECM avec un milieu organoïde plus 10 μM d'inhibiteur de ROCK Y-27632 (Tocris).

Les cellules distales des voies respiratoires ont été isolées et étalées comme ci-dessus avec les exceptions suivantes : le DMEM/F12 avancé a été utilisé à la place du milieu organoïde pendant la digestion par l'élastase du tissu pulmonaire, et les cellules ont été diluées en série et filtrées à travers un tamis cellulaire de 40 μm et comptées avec un hémocytomètre. Mille cellules épithéliales viables (par exclusion, taille et morphologie du bleu Trypan) par μl d'ECM ont été étalées par gouttelette de Matrigel de 5 μl par puits. Le milieu de base consistait en un milieu organoïde dépourvu de A83-01, EGF, NOGGIN, WNT3A ou RSPO1. EGF (final 50 ng ml-1, R&D), NOGGIN (final 100 ng ml-1, R&D), WNT3A (final 100 ng ml-1, R&D), RSPO1 (final 500 ng ml-1, Peprotech) ou l'inhibiteur PORCUPINE C59 (final 1 μM, Biogems) ont été ajoutés seuls ou en combinaison au milieu de base. Les images ont été obtenues dix jours après le placage primaire avec un microscope optique inversé à un grossissement de 5 ×. Chaque condition a été plaquée en quatre exemplaires et la formation d'organoïdes a été quantifiée à l'aide du plug-in d'analyse des particules (seuil, 4902 pixels) dans ImageJ (voir Méthodes supplémentaires).

Les cultures d'organoïdes pulmonaires d'individus distincts ont été dissociées 4 semaines après le placage primaire et soumises à un scRNA-seq à base de gouttelettes avec la plate-forme 10x Genomics Single Cell 3 'avec une UMI à 5 nucléotides, selon le protocole du fabricant. La capture cellulaire, la préparation de la bibliothèque et le séquençage ont été effectués comme décrit précédemment37. Pour l'analyse scRNA-seq sur la figure 1k, un test de somme de rang Kruskal – Wallis modifié a été effectué pour déterminer l'importance de l'expression différentielle du gène marqueur pour les cellules AT2 (SFTPC), basales (KRT5) et club (SCGB1A1), avec tous P <0, 001. L'analyse des composants principaux, le t-SNE, le regroupement basé sur des graphiques non supervisé, les tests statistiques et la trajectoire pseudo-temporelle pour toutes les analyses scRNA-seq sont décrits dans les méthodes supplémentaires et les données supplémentaires 1.

Les cellules LysoTracker+ AT238 provenant d'organoïdes non fractionnés ont été purifiées par FACS et cultivées pendant deux mois avec un passage. Ceux-ci ont été dissociés et soumis à un scRNA-seq à base de gouttelettes avec la plateforme 10x Genomics Chromium Single Cell 3 'v2 selon le protocole du fabricant. La bibliothèque a été séquencée à l'aide d'un séquençage apparié (26 bp read 1 et 98 bp read 2) avec un index d'échantillon unique (8 bp) sur un Illumina NextSeq 500. Le prétraitement des données et l'analyse des composants principaux ont été effectués avec CellRanger v1.2. L'analyse ultérieure est décrite dans les méthodes supplémentaires et les données supplémentaires 1.

Les cultures d'organoïdes ont été fixées dans de l'ECM avec 2, 5% de glutaraldéhyde dans un tampon cacodylate 0, 1 M (pH 7, 4), déshydratées, noyées dans de la résine époxy et visualisées avec un microscope électronique à transmission JEOL (modèle JEM1400) avec un émetteur LaB6 à 120 kV.

Les organoïdes ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 2 % à 4 °C pendant la nuit, inclus dans de la paraffine et sectionnés (10 à 20 μm) comme décrit précédemment37. Les coupes ont été déparaffinées et colorées avec H&E pour analyse histologique. Les anticorps utilisés pour la coloration immunocytochimique suivant les protocoles de coloration standard39 sont répertoriés dans les méthodes supplémentaires et les images ont été acquises sur un microscope confocal Leica-SP8.

L'hybridation in situ de l'ARN a été réalisée comme décrit40 et les séquences de sonde sont fournies dans les méthodes supplémentaires.

Des organoïdes intacts et non infectés ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 2 % dans du tampon phosphate 100 mM (pH 7,4) (paraformaldéhyde à 4 % pour les organoïdes infectés) pendant 1 h à température ambiante, lavés avec du PBS avec de la glycine 100 mM, perméabilisés dans du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 1 h, puis incubés dans du tampon de coloration (4 % BSA, 0,05 % Tween- 20 dans du PBS pH 7,4, 10 % de sérum de chèvre/âne) pendant une heure supplémentaire, suivie d'une incubation avec l'anticorps primaire pendant 24 h à température ambiante dans un tampon de coloration. Les montures entières ont ensuite été lavées avec du PBS-T et incubées avec des anticorps secondaires fluorescents, de la phalloïdine et du DAPI, pendant 4 h à température ambiante dans un tampon de coloration. Après des lavages supplémentaires, des montures entières ont été immergées dans un milieu de montage (Vectashield, Vector Laboratories) et montées sur des lamelles à chambre pour l'imagerie dans quatre canaux à l'aide de microscopes confocaux Zeiss LSM 700 ou 900. Le rendu 3D des piles d'images confocales a été réalisé à l'aide du logiciel Volocity Image Analysis (Quorum Technologies Inc., Guelph, Ontario). Pour la figure 4h, qui nécessitait cinq couleurs, les cils ont été distingués par coloration avec deux anticorps secondaires fluorescents et fusion des voxels colocalisés dans un canal pseudo-coloré à l'aide du logiciel Volocity. La coloration à la lectine (FITC-Sambuca Nigrin, Vector Labs FL-1301 ; Biotin-Maackia Amurensis, Vector Labs FL-1301) a été réalisée selon le protocole du fabricant après fixation des organoïdes avec 0,1 % de paraformaldéhyde dans du PBS pendant 1 h à température ambiante suivi d'un blocage avec de l'avidine/biotine (Vector Labs SP-2001). La lectine biotine-Maackia Amurensis a été marquée avec un conjugué streptavidine-PE (Thermo Fisher SA10041) et après lavage, la coloration de la lectine a été imagée dans un Keyence BZ-X700.

Dix cultures organoïdes ont été séquencées à l'aide d'un test de reséquençage ciblé commercial avec une couverture de bout en bout de 131 gènes du cancer et un logiciel compagnon (TOMA COMPASS Tumor Mutational Profiling System, Foster City, CA) pour déterminer la présence de mutations oncogènes dans les cultures organoïdes à long terme. Les bibliothèques ont été séquencées sur un Illumina NextSeq 500. Les variantes non synonymes sont répertoriées dans le tableau supplémentaire 6. Les fichiers d'appel de variantes sont fournis dans les données supplémentaires 2.

Les cultures d'organoïdes dans les 2 à 3 semaines suivant l'ensemencement primaire ont été dissociées avec 1 U ml-1 de protéase neutre (Worthington, Cat LS02100) et 100 KU DNase I dans un milieu organoïde pulmonaire. Les organoïdes basaux ont ensuite été collectés par sédimentation par gravité et le surnageant a été aspiré ou collecté pour une utilisation en aval. Les organoïdes basaux ont ensuite été fractionnés sur un gradient de Ficoll-Paque personnalisé (4 vol Ficoll-Paque à 1 vol PBS) et centrifugés à 300 g pendant 10 min à température ambiante. Le surnageant a été aspiré et le culot d'organoïde a été remis en suspension dans 10 ml de PBS dans un tube conique de 15 ml, recueilli par sédimentation par gravité et étalé dans de l'ECM comme décrit ci-dessus.

Les organoïdes ont été dissociés avec TrypLE, suivis d'une neutralisation avec 10% de volume de sérum de veau fœtal, soumis à de la DNase à 100 KU ml-1, lavés avec un milieu organoïde pulmonaire, puis incubés avec 100 volumes de culot cellulaire de milieu organoïde pulmonaire avec 10 nM LysoTracker Red DND-99 (Thermo Fisher L7528) à 37 ° C pendant 30 min. Les cellules ont ensuite été lavées et remises en suspension dans un tampon FACS comme décrit ci-dessus, incubées avec un bloc Fc, puis incubées sur de la glace avec un cocktail de marquage composé de 1 μg ml-1 d'anticorps anti-EPCAM PerCP-Cy5.5 et de coloration de viabilité Zombie Aqua (Biolegend 423101) dilué au 1: 400 à partir de la concentration du stock dans du tampon FACS. Les cellules EPCAMhi et LysoTrackerhi ont été triées dans un milieu organoïde pulmonaire avec 10 μM de Y-27632 (Tocris 1254) et cultivées dans de l'ECM et un milieu organoïde pulmonaire avec Y-27632 pendant 24 h, suivi d'un milieu organoïde pulmonaire sans Y-27632. La croissance des organoïdes AT2 purs a été améliorée par l'ajout de milieu conditionné de cellules L contenant du sérum 1: 1 vol: vol (L-WRN CM) contenant WNT3A, R-SPONDIN3 et NOGGIN et complété par EGF41 recombinant. La stratégie de déclenchement complète est fournie dans la Fig. 1 supplémentaire. Tous les anticorps FACS ont été achetés auprès de Biolegend. Des résultats qualitativement identiques pourraient également être obtenus avec une purification FACS anti-HTII-280 (marqueur AT2, Terrace Biotech) au lieu de LysoTracker. Les cellules organoïdes AT2 ont été transdifférenciées en cellules AT1 par dissociation TrypLE de l'ECM et ensemencement sur des lamelles de verre chambrées, suivies d'une culture avec du DMEM/F12 avancé et du sérum de veau fœtal à 5 %.

Des organoïdes FACS EPCAM+ dépourvus de stroma à J14 ont été infectés par des lentivirus à un MOI estimé à 0,9 comme décrit précédemment43 avec des vecteurs lentiviraux de troisième génération (PGK-GFP T2A Puro, SBI cat. n° CD550A-1 ; mCherry modifié à partir de pLentiCRISPRv1 (Addgene n° 49545) pour incorporer une cassette EF-1a-mCherry P2A Puro, un cadeau de Paul Rack). Quatre-vingt-seize heures après l'infection, les organoïdes ont été traités avec de la puromycine à une concentration de 600 ng ml-1 pendant 48 h pour sélectionner les cellules transduites. Deux semaines après la sélection, les organoïdes exprimant la GFP ou les organoïdes exprimant mCherry ont été dissociés en cellules individuelles et mélangés dans un rapport de 1: 1 et notés comme monochromatiques ou mélangés après 28 jours de chaque passage. La même approche a été utilisée pour les cultures AT2 et basales purifiées après des stratégies d'isolement respectives à partir d'une culture initiale d'organoïde purifiée par FACS, EPCAM +, appauvrie en stroma.

Du tissu pulmonaire humain adulte a été obtenu et dissocié comme ci-dessus, mais les cellules ont été marquées avec Zombie Aqua live: dead tache comme ci-dessus, lavées avec un tampon FACS, puis fixées dans du PFA à 2% dans du PBS pendant une nuit à 4 ° C. Les cellules ont ensuite été colorées en utilisant la procédure de montage entier comme décrit ci-dessus avec l'omission du lavage au PBS-glycine. Les cellules fixées et perméabilisées ont ensuite été incubées avec une dilution au 1/400 de l'anticorps de souris anti-cytokératine humaine 5 conjugué Alexa Fluor 647 (Abcam) pendant 24 h à 4 ° C dans un tampon de perméabilisation. Les cellules ont ensuite été lavées avec un tampon FACS et marquées avec un anticorps de souris anti-humain TNFRSF12A conjugué à la PE (clone ITEM-4, Biolegend) pendant 30 min sur de la glace, suivi d'un lavage et d'une analyse sur un instrument BD Aria Fusion. La stratégie de déclenchement complète et la validation qPCR de l'anticorps ITEM-4 sont détaillées dans la Fig. 1 supplémentaire.

Des suspensions unicellulaires de poumon distal humain frais ou de culture organoïde primaire à environ 4 semaines de culture ont été dissociées comme ci-dessus, traitées avec Fc Block (BioLegend) et incubées dans un tampon FACS avec Zombie Aqua 1:400, 1 μg ml-1 PerCP-Cy5.5 anti-humain EpCAM (CD326), 1 μg ml-1 APC anti-humain ITGA6 (CD49f), 2 μg ml-1 FIT C anti-ITGB4 humain (CD104), et 1 μg ml-1 PE anti-humain TNFRSF12A (CD266). Trente minutes après le marquage, les cellules ont été lavées deux fois avec du tampon FACS et triées pour EPCAMhi, ITGA6/ITGB4hi, TNFRSF12Ahi et TNFRSF12Aneg. La stratégie de déclenchement complète est fournie dans la Fig. 1 supplémentaire. Plus de 5 000 cellules ont été triées dans des tubes Eppendorf avec un milieu organoïde pulmonaire et un inhibiteur de ROCK 10 μM Y-27632. Tous les anticorps FACS ont été achetés chez Biolegend.

Les cellules ont été ensemencées dans de l'ECM et immergées dans un milieu organoïde pulmonaire avec 10 μM d'inhibiteur de ROCK Y-27632. La densité d'ensemencement pour les cellules isolées par FACS à partir d'une culture organoïde était de 1 000 cellules par puits à une densité de 100 cellules par μl d'ECM. La densité d'ensemencement pour les cellules isolées par FACS à partir de poumon distal humain frais était de 3 000 cellules par puits à une densité de 300 cellules par μl d'ECM. Après 24 h, le milieu a été changé pour éliminer l'inhibiteur de ROCK, puis il a été changé toutes les 72 h. La formation d'organoïdes a été quantifiée manuellement 14 jours après le placage par deux observateurs indépendants.

Des cultures non fractionnées contenant des types de cellules AT2, basales et club à 2 à 3 semaines ont été infectées en triple avec la souche H1N1 PR8 modifiée pour exprimer la GFP lors de la réplication virale après 24 h de prétraitement avec des composés antiviraux. L'ECM a été dispersé par addition d'EDTA 5 mM dans du PBS, suivi d'un lavage et d'une inoculation avec le virus rapporteur PR8-H1N1 – GFP à un MOI estimé de 1 dans un milieu contenant soit un véhicule, soit des antiviraux. Après 12 h (un cycle d'infection grippale), l'expression intacte de la GFP organoïde a été soit visualisée par microscopie à fluorescence avec un microscope automatisé Keyence BZ-X700, soit dissociée en cellules individuelles et fixée avec 0, 1% de PFA dans du PBS, suivie d'une quantification FACS des cellules GFP + (la stratégie de déclenchement est fournie dans la Fig. 1 supplémentaire). Les courbes dose-réponse antivirales ont été générées à l'aide d'un ajustement de courbe de régression non linéaire à quatre paramètres avec GraphPad Prism 7 (GraphPad Software, San Diego, CA). Le tropisme H1N1 a été évalué d'une manière similaire à ci-dessus, à l'exception que la fraction cellulaire basale sédimentée par Ficoll par rapport aux fractions non basales a été dissociée en cellules individuelles, comptée et infectée avec un MOI estimé de 1 dans un milieu organoïde pendant 1 h à 37 ° C, suivi d'un lavage et d'un réensemencement dans l'ECM, d'une culture de 16 h, puis d'une dissociation et d'un FACS comme ci-dessus.

Les organoïdes pulmonaires cultivés intégrés dans des gouttelettes d'ECM de 50 ul ont été transférés dans une culture en suspension comme décrit 28 avec des modifications. En bref, les organoïdes intégrés à l'ECM ont été délogés doucement par pipetage à l'aide de pointes LoBind stériles (Eppendorf 22493008) et placés dans des tubes coniques LoBind de 15 ml (Eppendorf 30122216) contenant de l'EDTA 5 mM glacé dans du PBS. Cinq millilitres de solution d'EDTA ont été utilisés par gouttelette d'ECM (3 gouttelettes d'ECM par tube conique de 15 ml) tournant pendant 1 h à 4 ° C sur une plate-forme rotative. Les organoïdes ont été centrifugés à 200 g pendant 3 min à 4 ° C et le surnageant a été éliminé. Le culot a été remis en suspension dans du milieu de croissance dans des plaques de culture tissulaire à six puits à fixation ultra-faible (Corning Costar 3471). Les organoïdes en suspension ont été incubés à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant différents temps (gamme de 0 à 30 jours) pour caractériser la polarité apicale, la ciliogenèse et la différenciation, et pour préparer des organoïdes apicaux pour des expériences d'infection avec le SRAS-CoV-2.

Les cellules VeroE6 ont été obtenues auprès de l'ATCC sous forme de stocks sans mycoplasme et maintenues dans du DMEM additionné de 10 % de FBS. Le SARS-CoV-2 (USA-WA1/2020) a été passé dans des cellules VeroE6 dans du DMEM avec 2 % de FBS. Les titres ont été déterminés par dosage de plaque sur des cellules VeroE6 en utilisant Avicel (FMC Biopolymer) et du cristal violet (Sigma), la séquence du génome viral a été vérifiée et toutes les infections ont été réalisées avec le virus du passage 3. Les organoïdes ont été comptés et passés dans un milieu de suspension pendant 6 à 8 jours, puis remis en suspension dans un milieu viral ou un volume égal de milieu factice à un MOI de 1 par rapport au nombre total de cellules organoïdes dans l'échantillon, puis incubés à 37 ° C sous 5 % de CO2 pendant 2 h. Les organoïdes ont ensuite été étalés en suspension dans un milieu organoïde pulmonaire (organoïdes apicaux). Aux moments indiqués, les organoïdes apicaux ont été lavés avec du milieu organoïde pulmonaire et du PBS et remis en suspension dans du TRIzol LS (Thermo Fisher), du PFA à 4% fraîchement préparé dans du PBS ou du milieu organoïde pulmonaire de 250 μl. Les cellules remises en suspension dans un milieu organoïde pulmonaire ont été lysées par congélation à -80 ° C. Les surnageants de culture ont été conservés dans du TRIzol LS ou ajoutés directement aux monocouches de dosage sur plaque. Tous les travaux sur le SARS-CoV-2 ont été effectués dans une armoire de biosécurité de classe II dans des conditions BSL3 à l'Université de Stanford.

L'ARN des organoïdes infectés par le SRAS-CoV-2 a été extrait en ajoutant 750 μl de TRIzol (Thermo Fisher Scientific), en incubant à 55 ° C pendant 5 min, puis en ajoutant 150 μl de chloroforme. Après avoir mélangé chaque échantillon au vortex pendant 7 s, les échantillons ont été incubés à 25 °C pendant 5 min puis centrifugés à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C. La couche aqueuse a été soigneusement retirée de chaque échantillon, mélangée avec deux volumes d'éthanol à 100 % et purifiée à l'aide d'un kit RNA Clean & Concentrator-25 (Zymo Research) conformément aux instructions du fabricant. Tous les échantillons d'ARN ont été traités avec de la DNase (kit sans ADN Turbo, Thermo Fisher Scientific). Le Brilliant II SYBR Green QRT–PCR 1-Step Master Mix (VWR) a été utilisé pour convertir l'ARN en ADNc et pour amplifier des régions d'ARN spécifiques sur le système de détection par PCR en temps réel CFX96 Touch (Bio-Rad). La réaction de transcription inverse a été effectuée pendant 30 min à 50 ° C, 10 min à 95 ° C, suivie d'une qPCR en deux étapes avec 95 ° C pendant 10 s et 55 ° C pendant 30 s, pour un total de 40 cycles. Deux ensembles d'amorces ont été utilisés pour amplifier soit l'ARN génomique (ARNg) du SRAS-CoV-2 non épissé couvrant les positions nucléotidiques 14221-14306, soit l'ARNsg30 du SRAS-CoV-2 épissé. Les séquences d'amorces se trouvent dans le tableau supplémentaire 7.

La coloration optimale du tissu pulmonaire distal humain a été obtenue à partir d'échantillons fixés dans les 30 minutes suivant les résections chirurgicales primaires dans du paraformaldéhyde à 4 % dans du PBS. Les échantillons ont été incubés dans un fixateur pendant une nuit à 4 ° C, transférés dans du saccharose à 30 % et intégrés dans un OCT. Les coupes congelées ont été coupées à 10 μm, soumises à une récupération d'antigène à base de citrate (Vector Labs) à 70 ° C pendant 30 min, puis bloquées pendant 1 h avec du sérum de chèvre à 10% dans un tampon de lavage IF comme décrit ci-dessus. L'anti-TNFRSF12A de souris (clone ITEM-4, Biolegend) a été utilisé pour la Fig. 3a et l'anti-TNFRSF12A polyclonal de lapin (ThermoFisher PA5-20275) a été utilisé pour les Fig. 3b, f et Extended Data Fig. 845.

Des organoïdes vivants ont été maintenus entre deux lamelles dans une chambre de visualisation (lamelle couvre-objet à deux chambres Lab-Tek II) et filmés à l'aide d'un microscope Nikon TE2000E utilisant une microscopie à contraste interférentiel différentiel (DIC) avec un objectif 63 ×. Les échantillons ont été conservés à 37 ° C avec 5% de CO2 pendant l'imagerie. Les vidéos numériques ont été collectées par un appareil photo numérique Hamamatsu ORCA-285 haute résolution et rendues à l'aide du logiciel OpenLab 5.5.2 (Improvision). Après enregistrement, les échantillons ont été fixés et colorés sans être retirés des chambres et transférés au microscope confocal pour la microscopie par immunofluorescence.

Sauf indication contraire, toutes les données sont représentatives d'au moins deux expériences indépendantes avec chaque expérience indépendante réalisée à l'aide d'une culture organoïde dérivée d'un individu. Les limites de la boîte à moustaches s'étendent du premier au troisième quartile, les lignes horizontales représentent les valeurs médianes et les moustaches représentent les minima ou les maxima de la plage de données ou, dans le cas des valeurs aberrantes, 1,5 fois la plage interquartile avec les valeurs aberrantes représentées par des points de données. les tests t étaient bilatéraux et les valeurs P sont notées *P < 0,05, **P ≤ 0,01 et ***P ≤ 0,001. Tous les détails sont fournis dans les méthodes supplémentaires.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Les ensembles de données scRNA-seq ont été déposés dans Gene Expression Omnibus avec le code d'accession GSE106850. Les données sources sont fournies avec ce document.

Des scripts pour effectuer des analyses de données scRNA-seq sont fournis avec cet article. Le code personnalisé est disponible sur GitHub (https://github.com/ameen-salahudeen/lung_organoid).

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Nous remercions les membres des laboratoires Kuo et Desai pour les discussions ; la Stanford Tissue Bank, J. Shrager, M. Berry et W. Trope pour l'acquisition de tissus ; S. Plevritis pour l'analyse de trajectoire ; et le Stanford Stem Cell FACS Facility, P. Chu, A. McCormick, D. Mendoza, F. de la Vega et J. Zengel pour leur expertise technique. SARS-Related Coronavirus 2, Isolate USA-WA1/2020, NR-52281 a été déposé par le CDC et obtenu via BEI Resources, NIAID, NIH. Les bourses soutenant les auteurs sont les suivantes : AAS : AP Giannini, ECOG-ACRIN, P. Carbone, Stanford Cancer Institute ; SSC : subvention du programme de formation des scientifiques médicaux de Stanford T32 GM007365-44 ; JZ : Bourse d'études supérieures de Stanford ; SMdlO : Ponts CIRM. Le soutien financier est le suivant : AR : subvention NIH T32 AI007502-23 ; RAF : Fondation de recherche sur le cancer Damon Runyon (DRG-2286-17) ; VvU : Subvention Rubicon de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (452181214) ; CS et JZ : NSF DMS 1712800 et le Stanford Discovery Innovation Fund ; KCG et MMD : Institut médical Howard Hughes ; CAB : Burroughs Wellcome Fund Investigators in the Pathogenese of Infectious Disease Grant 1016687. Ce travail a également été soutenu par CIRM DISC2-09637 à CJK et TJD : Fondation Bill et Melinda Gates OPP1113682 à CJK, MRA et CAB ; Novo Nordisk Foundation Challenge Grant à MRA et MM-C. ; Mathers Foundation Covid Fund à KCG ; et NIH accorde K08DE027730 à AAS, U19AI057229 à MMD, R56AI111460 à JSG, 5R01HL14254902 à TJD, DK11572802 à CJK et KCG, R01AI157155 à RSB, et U19AI116484, U01DK085527, U 01CA217851, U01CA176299 et U01DE025188 à CJC. Le CAB est boursier de la faculté Tashia et John Morgridge et chercheur du Biohub Chan Zuckerberg. TJD est la Woods Family Endowed Faculty Scholar en médecine translationnelle pédiatrique. CJK est la professeure de médecine Maureen Lyles D'Ambrogio.

Ameen A. Salahudeen

Adresse actuelle : Division d'hématologie et d'oncologie, Département de médecine, Université de l'Illinois au Chicago College of Medicine, Chicago, Illinois, États-Unis

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi

Division d'hématologie, Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Ameen A. Salahudeen, Shannon S. Choi, Sean M. de la O, António JM Santos, Jihang Ju, Arpit Batish, Tatsuya Usui, Daniel J. Hart et Calvin J. Kuo

Division des maladies infectieuses et de médecine géographique, Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Arjun Rustagi et Catherine A. Blish

École d'ingénierie de l'Université de Stanford, Département de génie électrique, Stanford, Californie, États-Unis

Junjie Zhu

Département de microbiologie et d'immunologie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar, Jeffrey S. Glenn, Mark M. Davis et Manuel R. Amieva

Stanford Institute of Immunity, Transplantation and Infection, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Vincent van Unen, Lisa E. Wagar et Mark M. Davis

Stanford ChEM-H, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Ryan A. Flynn

Département de chimie, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Ryan A. Flynn

Département de pédiatrie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Mar Margalef-Català & Manuel R. Amieva

10x Génomique, Pleasanton, Californie, États-Unis

Grace XY Zheng, Jessica M. Terry, Phillip Belgrader, Solongo B. Ziraldo et Tarjei S. Mikkelsen

Département d'épidémiologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Caitlin E. Edwards et Ralph S. Baric

Département de physiologie moléculaire et cellulaire, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Vincent Luca & K. Christopher Garcia

Division de la science des données biomédicales, Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Benoît Anchang & Chiara Sabatti

Division des soins pulmonaires, des allergies et des soins intensifs, Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Monica Nagendran et Tushar J. Desai

Division de gastroentérologie, Département de médecine, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Khanh Nguyen et Jeffrey S. Glenn

Département de biochimie, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Pehr B.Harbury

Howard Hughes Medical Institute, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

K. Christopher Garcia et Mark M. Davis

Département de microbiologie et d'immunologie, Université de Caroline du Nord à Chapel Hill, Chapel Hill, Caroline du Nord, États-Unis

Ralph S.Baric

Chan Zuckerberg Biohub, San Francisco, Californie, États-Unis

Catherine A. Bliss

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AAS et SSC ont conçu, conçu et réalisé des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit. AR a conçu et réalisé des infections par le SRAS-CoV-2. JZ, VvU et CS ont conçu et interprété des études d'ARN-seq sur cellule unique. RAF a effectué qRT-PCR. MM-C., SMdlO, AJMS, TU, DJH, JJ et AB ont effectué la culture et l'analyse des organoïdes. Panneaux FACS conçus par LEW et MMD. VL et KCG ont fourni le mutant DLL4 E12. BA a effectué une analyse SPADE. KN et JSG ont conçu et exécuté des études sur la grippe. GXYZ, JMT, PB, SBZ et TSM ont conçu et exécuté des expériences de séquençage d'ARN unicellulaire. Le CEE et le RSB ont donné des conseils sur les études sur le SRAS-CoV-2. MN et PBH ont fourni des protocoles d'hybridation in situ. MRA, CAB, TJD et CJK ont conçu et conçu des expériences, analysé des données et rédigé le manuscrit.

Correspondance avec Catherine A. Blish, Tushar J. Desai ou Calvin J. Kuo.

CJK, AAS, SSC, CAB, AR, MRA, MM-C., SMdlO et TU sont répertoriés comme inventeurs sur le brevet provisoire 63/053 079 décrivant les méthodes dans cet article. CJK est l'un des fondateurs de Surrozen Inc. Tous les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Informations sur l'évaluation par les pairs Nature remercie les évaluateurs anonymes pour leur contribution à l'évaluation par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a, Schéma de l'initiation de la culture à partir du poumon distal humain. b, évaluation par microscopie à fond clair des facteurs de croissance exogènes requis et quantification automatisée des organoïdes après le 10e jour de culture organoïde chimiquement définie avec des facteurs de croissance recombinants spécifiés, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 4 par condition, les données sont moyennes ± sem, * = P < 0,05, test t bilatéral de l'étudiant, barre d'échelle = 500 μm. c, en haut, schéma de purification pour isoler les cellules épithéliales du poumon humain distal impliquant une déplétion négative des billes MACS des cellules hématopoïétiques CD45 +, des cellules endothéliales et des fibroblastes, suivie d'une sélection FACS positive pour l'épithélium EPCAM +. En bas à gauche, FACS représentatif démontrant > 99,9 % de pureté EPCAM+ (orange) lors d'une nouvelle analyse par rapport aux contrôles non colorés (gris). En bas à droite, prolifération de cellules EPCAM+ purifiées à partir de cultures pulmonaires distales après le 10e jour de culture organoïde avec des facteurs de croissance spécifiés, N = Noggin, E = EGF, W = WNT3A, R = RSPO1, n = 3 par condition, les données sont moyennes ± sem, ** = P < 0,01, test t bilatéral de l'étudiant. d, images confocales de transmission en accéléré d'organoïdes solides et kystiques provenant de cellules pulmonaires distales humaines dissociées, barre d'échelle = 100 μm. par exemple, études de mélange de clonalité. e, Schéma des études de mélange de cellules exprimant le lentivirus-GFP et le lentivirus-mCherry pour déterminer la clonalité. f, imagerie fluorescente vivante représentative des organoïdes verts et rouges résultants de (e), barre d'échelle = 500 μm. g, Quantification des cultures d'organoïdes pulmonaires distales rouges, vertes ou chimériques de deux individus (1, 2) après le passage initial et en série (P1 = passage 1).

Données source

a–c, le regroupement non supervisé des populations cellulaires totales démontre une cohérence dans les principaux gènes exprimés de manière différentielle correspondant aux cellules basales (KRT5/6), club (SCGB1A1) et AT2 (SFTPC). La fraction épithéliale de ces cultures variait d'environ 90 à 99 % de toutes les cellules, le reste étant soit des fibroblastes (VIM+) soit des cellules mononucléaires (HLA-DR+, probablement des macrophages alvéolaires). d – f, visualisation t-SNE et parcelles de violon pour les gènes marqueurs correspondant à chaque population. Notez qu'une population unique enrichie en gènes SPRR, qui ont été décrits pour marquer la métaplasie squameuse, a été trouvée exclusivement dans la culture organoïde du poumon 3, dérivée d'un individu qui était un fumeur actif.

a, tracé SPADE de cellules regroupées où chaque point représente des états de cellule qui sont plus liés sur les branches identiques ou adjacentes d'un arbre couvrant minimum. Remarque : les cellules AT2 existent sur une branche distale des cellules basales et club, ce qui suggère qu'il n'y a pas de hiérarchie de lignée entre les cellules AT2, basales et club. b, les parcelles SPADE d'échantillons scRNA-seq regroupés après exclusion des cellules AT2, VIM + et HLA-DR + soutiennent les relations de lignée entre les populations basales (bleues) et club (rouges) par les branches de cellules club émanant des cellules basales. c, tracés SPADE des populations Basal 1, Basal 2 et club. d, à gauche, l'expression génique de SCGB1A1 montre une expression plus élevée dans les lignées de cellules club que basales (à gauche) par rapport à KRT5 (au milieu). À droite, expression génique médiane de TNFRSF12A, montrant un haut (contour orange) et un bas (contour bleu) dans les branches des cellules basales et inférant une relation de lignée potentielle. e, Analyse de la trajectoire pseudo-temporelle Monocle 3 des transcriptomes unicellulaires de Basal 1 connectés aux cellules du club représentées avec UMAP (numéro de cellule, n = 3 721), colorées par l'amas de cellules (à gauche) et le gradient pseudo-temporel (à droite).

a, à gauche, images confocales d'un organoïde AT2 vivant à 67 jours de culture marqué avec le colorant nucléaire Hoescht et le LysoTracker Red DND-99. En haut à droite, isolement des organoïdes AT2 purifiés. Parcelles FACS représentatives montrant la purification LysoTracker Red AT2 à partir de cultures organoïdes non fractionnées. En bas à droite, l'immunomarquage du cytospin des cellules AT2 triées par LysoTracker montre une grande pureté (100/100 cellules SPC + SCGB1A1- KRT5); barre d'échelle = 50 μm). b, schéma de l'isolement par FACS de cellules AT2 à partir d'organoïdes pulmonaires distaux mixtes humains sous forme de cellules EPCAM + LysoTracker + AT2, suivi d'une culture organoïde clonogénique à long terme. c, Image représentative des études de mélange clonal à partir de cellules AT2 appauvries en stroma, EPCAM + LysoTracker +, marquées de manière lentivirale démontrant la présence de complètement mCherry + ou GFP + mais pas d'organoïdes chimériques réalisées comme dans Extended Data Fig. 1e-g, passage 1 après infection lentivirale, barre d'échelle = 200 μm. d, Quantification des cultures organoïdes AT2 rouges, vertes ou chimériques comme dans (c) de deux individus (1, 2) après passage initial et en série (P1 = passage 1). e, prolifération d'organoïdes AT2 avec différentes combinaisons de facteurs de niche recombinants et de l'inhibiteur PORCUPINE C59 (1 mM), NOGGIN (N), EGF (E), WNT3A (W), R-SPONDIN1 (R). n = 3 par condition, les données sont moyennes ± sem, * = P < 0,05, *** = P < 0,001, test t de Student bilatéral. f, microscopie à fond clair comparant l'amélioration de la croissance des organoïdes AT2 purs dans des milieux organoïdes pulmonaires chimiquement définis (EN) par rapport à des milieux conditionnés de cellules L contenant du sérum contenant WNT3A, NOGGIN et R-SPONDIN3 (L-WRN CM) complétés par de l'EGF recombinant, une expérience. Barre d'échelle = 200 μm. g, Image en microscopie électronique à transmission d'un organoïde AT2 représentatif à 28 jours de culture. Notez les microvillosités apicales (flèches noires) et les corps lamellaires (flèches rouges) ; barre d'échelle = 10 μm.

Données source

a–c, les organoïdes basaux en culture mixte forment progressivement des lumières internes, qui ne sont pas associées à l'apoptose. a, KRT5 IF, culture au jour 26, barre d'échelle = 200 μm. b. Quantification de la lumière, culture j12 versus j26, détermination unique. c, Absence d'apoptose dans la lumière interne organoïde des cellules basales d26, caspase IF clivée, de la Fig. 2b, barre d'échelle = 20 μm. d, e, Isolement d'organoïdes cellulaires basaux purifiés par sédimentation différentielle dans Ficoll. d, schéma et enrichissement à> 90% de cellules KRT5 +, mesurés par FACS KRT5 intracellulaire de cellules organoïdes basales sédimentées ; barre d'échelle = 100 μm. e, La microscopie en accéléré en série des organoïdes basaux sédimentés révèle une cavitation spontanée dans les deux semaines suivant le passage ou dans les quatre semaines suivant le début de la culture ; barre d'échelle = 25 μm. f, g, études de mélange clonal à partir de cellules organoïdes basales appauvries en stroma, purifiées par Ficoll et marquées par lentivirus démontrant pleinement mCherry + ou GFP + mais pas d'organoïdes chimériques comme dans Extended Data Fig. 1f, passage 1 après infection lentivirale, barre d'échelle = 200 μm. f, étude d'image de mélange clonale représentative. g, Quantification. h, Évaluation du facteur de croissance pour les organoïdes basaux après sédimentation d14, dissociation enzymatique et culture clonogénique. La croissance n'a pas été affectée par l'inhibiteur PORCUPINE C59 (1 μM). n = 4 par condition, les données sont moyennes ± sem, *** = P < 0,001, test t de Student bilatéral.

Données source

a, l'analyse de regroupement à haute résolution identifie une sous-population cellulaire basale active reproductible avec une expression significativement plus élevée d'ARNm pour TNFRSF12A, le marqueur de la voie NOTCH HES1 et le marqueur de prolifération MKI67. Test de somme des rangs de Kruskal–Wallis modifié deux valeurs p de queue : TNFRSF12A 4,15 × 10−8 ; HES1 2,4 × 10−10 ; MKI67 3,4 × 10−3. b, le regroupement à résolution fine des populations KRT5 + identifie deux sous-groupes Basal 1, Basal 1.1 et 1.2. c, Gene Ontology PANTHER surreprésentation des gènes différentiellement exprimés enrichis en Basal 1.2 par rapport à 1.1 montre que la majorité des processus Basal 1.2 impliquent le cycle cellulaire (astérisques). L'analyse complète est fournie dans le tableau supplémentaire 3. d, tracé de violon de l'analyse scRNA-seq pour la Fig. 2f – h illustrant l'expression de l'ARNm de KRT5 parmi les cellules individuelles triplement EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + exprimant l'ARNm (violet, c'est-à-dire l'expression en tandem de l'ARNm des trois gènes) par rapport au reste des cellules (gris), P <0, 001 test de somme de rang Kruskal – Wallis à deux queues. e, visualisation t-SNE de l'expression de TNFRSF12A et ITGA6 à partir de d parmi les cellules avec expression du gène EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + et subdivision par expression d'ARNm élevée (quartile supérieur, orange), moyenne (rose) et faible (quartile inférieur, bleu marine). f, l'expression génique associée à la prolifération est progressivement enrichie pour les fractions cellulaires scRNA-seq dans les cellules EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + qui sont stratifiées pour une expression faible, moyenne ou élevée de l'ARNm de TNFRSF12A comme dans e. Les données en f représentent les fractions de population cellulaire d'une seule expérience. *** = P < 0,001, test Chi carré bilatéral.

a, Isolement de Basal 1 et Basal 2 via une sédimentation différentielle des cellules KRT5 + suivie d'un tri FACS de EPCAM + ITGA6 + ITGB4 + TNFRSF12A + (Basal 1) par rapport à EPCAM-ITGA6-ITGB4-TNFRSF12A- (Basal 2). b, Mesure FACS intracellulaire de l'expression de la protéine KRT5 dans les fractions basales 1 et 2 de a. c, fond clair représentatif des cultures organoïdes du jour 14 de a, b. d, Quantification de 3 expériences indépendantes de a à c, la boîte à moustaches représente le premier quartile, la médiane, le troisième quartile et les moustaches représentent le minimum et le maximum. *** P < 0,001, test t de Student bilatéral. e, mesure qPCR de deux gènes Basal 2 régulés de manière différentielle à partir des trois réplicats biologiques scRNA-seq (Extended Data Fig. 6, SPRR1B, TMSB4X) après une culture prolongée de cellules Basal 1 isolées par FACS. Les données sont la moyenne relative ± sem des cultures de trois expériences indépendantes, ** = P < 0,01, test t de Student bilatéral. f, ARN FISH démontrant les transcrits cellulaires TMSB4X et SPRR1B dans les organoïdes provenant de cellules basales 1 (flèches), barre d'échelle = 25 μm. g, immunomarquage KRT5 et SFTPC et SCGB1A1 RNA FISH de cellules TNFRSF12Ahi Basal 1 isolées par FACS sous véhicule, agonisme NOTCH (peptide JAG1) ou antagonisme NOTCH avec le mutant 4 du ligand de type Delta (DLL4E12 ; E12) ou l'inhibiteur de la gamma-sécrétase DBZ ; barre d'échelle = 50 μm. h, quantification fluorescente de la réduction du colorant résazurine pour estimer la prolifération cellulaire relative en g, les données sont normalisées par rapport au véhicule (V) et représentent la moyenne ± sem de cinq expériences indépendantes, * P <0,05, test t d'étudiant à deux queues. i, Quantification de l'expression des gènes SCGB1A1 et SFTPC par RNA FISH dans le contexte de l'agonisme ou de l'antagonisme NOTCH à partir de trois expériences indépendantes, ** P <0, 01, *** P <0, 001, test t d'étudiant à deux queues. La régulation à la hausse de l'ARNm de SFTPC n'était pas accompagnée d'un corps lamellaire ou d'une production de protéines SFTPC (données non présentées).

Données source

a, b, Immunomarquage de KRT5 et TNFRSF12A dans les voies respiratoires distales humaines de deux individus, barre d'échelle = 100 μm. c, Immunomarquage de KRT5, TNFRSF12A et p63 dans les voies respiratoires distales humaines, barre d'échelle = 100 μm. D, analyse FACS d'un poumon distal humain fraîchement fixe avec anti-KRT5 (intracellulaire) et anti-TNFRSF12A monoclonal (surface cellulaire) (en haut), ou FACS séquentiels isolation de cellules distales humaines fraîchement dissociées de l'Epcam + ITGA6 + ITGB4 + Cellules suivis de la fractionnement), pré-gradus S et utilisé pour des expériences de culture sur la figure 3D - G.

a, b, Modélisation organoïde pulmonaire distale de l'infection grippale H1N1. a, Transmission fusionnée et images confocales GFP d'organoïdes basaux purifiés (à gauche) et purifiés AT2 (à droite) 12 h après l'infection par le virus de la grippe PR8-GFP H1N1, quantifiés par FACS pour % cellules GFP+. Le graphique à barres représente le pourcentage moyen de cellules infectées à partir de trois répétitions techniques, P = 0,57, test Chi-carré. Barres d'échelle = 50 μm. b, Quantification du génome viral au fil du temps de surnageants mixtes de culture d'organoïdes pulmonaires distaux soumis à une infection initiale par le H1N1 de type sauvage à une multiplicité d'infection (MOI) estimée à 0,01, qRT–PCR, les données représentent la moyenne de trois expériences indépendantes ± sem c, d, Coloration de lectine avec des lectines de M. amurensis (a2-3) et S. nigra (a2-6) ou aucun contrôle négatif de lectine pour caractériser les résidus d'acide sialique comme molécules de surface pour l'entrée des cellules hôtes du virus de la grippe. Organoïdes AT2 (c) et organoïdes basaux (d). Barre d'échelle = 25 μm. e, Courbes dose-réponse pour deux classes différentes de médicaments antiviraux sur l'infectiosité et la réplication de la grippe. L'analogue nucléosidique FdC a démontré une activité dépendante de la dose avec une IC50 de 340 nM par rapport à l'inhibiteur de la neuraminidase zanamivir, qui n'altère que l'excrétion virale mais pas l'infectiosité et la réplication. n = 3 par condition, les données représentent la moyenne ± sem f, Micrographie à fluorescence du criblage multipuits de divers agents antiviraux sélectionnés après une infection organoïde H1N1 PR8-GFP au format 48 puits. FdC = analogue nucléosidique 2'-désoxy-2'-fluorocytidine. Cpd = composé #.

Données source

a, tracés scRNA-seq de l'expression des gènes ACE2 et TMPRSS2 dans des organoïdes pulmonaires distaux mixtes intégrés à l'ECM, comme sur la Fig. 1a – h. b, Diagramme de l'élimination de l'ECM et de la culture en suspension conduisant à la polarité apicale des organoïdes pulmonaires. c, microscopie confocale représentative montrant la réorganisation des microfilaments (phalloïdine) et des microtubules acétylés (AcTUB) lors du retrait de l'ECM. Barre d'échelle = 10 μm. d–f, polarisation et différenciation ciliaire accélérée des organoïdes basaux apicaux. d, sections confocales 3D (panneaux supérieurs) et reconstructions de surface (panneaux inférieurs) d'organoïdes pulmonaires apicaux à différents jours après le retrait de l'ECM. Au jour 0 (j0), l'organisation des microfilaments (vert, phalloïdine) et des microtubules (rouge, tubuline acétylée) n'est pas polarisée tandis que les brins jonctionnels (ZO-1, blanc) sont polarisés. Au jour 2 en suspension (d2) ZO-1 (blanc) forme des anneaux de jonction dans la périphérie apicale de chaque cellule face à la face externe des organoïdes et le cytosquelette d'actine forme des microvillosités (vert) tournées vers l'extérieur (polarité apicale). De plus, à j2, certaines cellules initient la polarisation des microtubules. Au jour 5 (j5), beaucoup plus de cellules ont des cils mobiles tournés vers l'extérieur. Les cils mobiles matures peuvent être observés pendant plusieurs semaines, par exemple au jour 14 (j14). e, reconstruction confocale 3D d'un organoïde intégré dans l'ECM composé principalement de cellules souches basales (KRT5 +, blanc). f, Au fur et à mesure que la polarité apicale est établie dans la culture en suspension et que la ciliogenèse commence, les cellules basales KRT5 + se trouvent sous l'épithélium polarisé. g, des cellules SCGB1A1+ Club avec une polarité apicale sont présentes sur la surface extérieure. Dans tous les panneaux, les noyaux sont colorés en bleu avec du DAPI et l'organisation des microfilaments d'actine est visualisée avec de la phalloïdine (vert). Barres d'échelle = 10 μm. h – j, La culture en suspension prolongée d'organoïdes AT2 (jour 10 après la suspension) induit une polarisation apicale et une différenciation AT1. h, Les sections optiques à travers des organoïdes dérivés des alvéoles après 10 jours de culture en suspension montrent une diminution de l'abondance des cellules AT2 tandis que les cellules cuboïdes individuelles commencent à exprimer le marqueur AT1 HTI-56 (rouge), une protéine transmembranaire spécifique à la membrane apicale des pneumocytes alvéolaires de type 1 (AT1). Barres d'échelle = 10 μm. i, j, Des vues latérales d'organoïdes alvéolaires après 10 jours de culture en suspension révèlent de fines cellules AT1 avec des complexes jonctionnels apicaux réactifs à la phalloïdine tournés vers l'extérieur (apical-out) (i) et l'expression de HTI-56 sur la membrane apicale (j). Barres d'échelle = 10 μm. k, Immunofluorescence représentative en microscopie confocale d'un organoïde basal humain apical après 10 jours en suspension exprimant le récepteur SARS-CoV-2 ACE2 (vert), les cils (AcTUB, rouge) et le DAPI (bleu). Barre d'échelle = 20 μm.

Stratégies de déclenchement. a, stratégie de déclenchement EPCAM + Lysotracker + pour purifier les cellules AT2. La pureté a été confirmée avec 100/100 cellules triées positives pour la protéine SFTPC (correspondant aux données étendues Fig. 4a). b, EPCAM+ITGA6+ITGB4+TNFRSF12Ahi/neg gating stratégie. La pureté a été confirmée avec 100/100 cellules triées regroupées colorées positives pour la protéine KRT5 (correspondant à la Fig. 2j-k). c, stratégie de synchronisation pour analyser les cellules KRT5 + et les populations TNFRSF12A + correspondantes dans des cellules fraîchement dissociées des poumons humains distaux (correspondant aux données étendues Fig. 8d). d, corrélation RT-PCR de TNFRSF12A et d'autres ARNm de cellules triées par FACS en fractions TNFRSF12A neg, med et hi (Fig. 3d). e, Stratégie de déclenchement pour estimer l'infectivité H1N1 PR8 GFP dans les organoïdes pulmonaires humains (correspondant aux données étendues Fig. 9a).

Données démographiques cliniques de 136 donneurs de tissus pulmonaires utilisés dans cette étude. Chaque ligne correspond à un individu unique à partir duquel un poumon normal a été obtenu et les colonnes correspondent à des caractéristiques telles que l'âge, le sexe et l'emplacement anatomique du poumon.

Gènes utilisés pour l'analyse SPADE. Les gènes ont été utilisés dans SPADE sur la base d'une annotation de regroupement de cellules basée sur un graphique à partir d'une analyse scRNA-seq de trois individus. Les détails complets de SPADE sont fournis dans les méthodes supplémentaires.

Analyse d'enrichissement d'ensemble de gènes (GSEA) des principaux gènes exprimés de manière différentielle à partir de populations de scRNA-seq. Les populations correspondent à Basal 1, Basal 2, Basal 1.1, Basal 1.2 et Cluster 1 des ensembles de données purifiées AT2 scRNA-seq. Les principaux gènes différentiellement exprimés pour chaque population sont répertoriés dans chaque onglet. Gras = gènes utilisés pour l'analyse GSEA (test de surreprésentation de Panther, avec correction de Bonferroni, les valeurs p sont bilatérales).

Liste des gènes de la protéine membranaire Basal 1. Les gènes ont été identifiés par analyse ontologique des gènes Basal 1 les plus exprimés différentiellement avec le terme GO 0031224 (composant intrinsèque de la membrane).

Analyse de l'infection par le SRAS-CoV-2 dans les cultures d'organoïdes pulmonaires. Les cellules positivement infectées ont été quantifiées par coloration NP dsRNA et SARS-CoV-2 parmi les cellules basales KRT5 +, les cellules club SCGB1A1 + et les cellules ciliées AcTUB + à l'aide de la microscopie confocale. L'analyse statistique (chi-carré ou test exact de Fisher) a été effectuée comme indiqué.

Séquençage de nouvelle génération de cinq cultures organoïdes pulmonaires distales. Résumé et annotations des variantes non synonymes avec fréquence allélique> 0,10 pour 130 gènes du cancer à l'aide du système de profilage des tumeurs TOMA (TOMA, Foster City, CA).

Tableaux des réactifs. Tableaux individuels des composants des médias organoïdes, des réactifs d'immunomarquage et de microscopie à fluorescence, des réactifs RT-PCR, des amorces RT-PCR et des sondes d'hybridation d'ARN utilisées dans cette étude.

Guide de l'analyse scRNA-seq des organoïdes pulmonaires. Analyse scRNA-seq pour les poumons 1, 2, 3 et les organoïdes AT2 purifiés fournis au format .rmd et .html.

Séquençage des cultures d'organoïdes pulmonaires. Les données de séquençage de nouvelle génération pour chacune des cinq cultures d'organoïdes pulmonaires distales (système de profilage des tumeurs TOMA) sont fournies au format Variant Call.

Les organoïdes basaux différenciés ont des cils fonctionnels, partie 1. Vidéo de microscopie confocale à transmission de cils battants (grossissement 25X).

Les organoïdes basaux différenciés ont des cils fonctionnels, partie 2. Vidéo de microscopie à fond clair de cils battants (grossissement 10x).

Les organoïdes basaux différenciés apicaux ont des cils fonctionnels. Vidéo de microscopie confocale DIC et 3D de cils mobiles dans des organoïdes basaux apicaux aux jours 5 et 14 de culture en suspension.

Réimpressions et autorisations

Salahudeen, AA, Choi, SS, Rustagi, A. et al. Identification des progéniteurs et infection par le SRAS-CoV-2 dans les organoïdes pulmonaires distaux humains. Nature 588, 670–675 (2020). https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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Reçu : 08 novembre 2017

Accepté : 18 novembre 2020

Publié: 25 novembre 2020

Date d'émission : 24 décembre 2020

DOI : https://doi.org/10.1038/s41586-020-3014-1

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