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Oct 27, 2023

Double blocage des deux PD

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 2472 (2023) Citer cet article

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Le cancer colorectal est un cancer peu immunogène. Une telle propriété peut être annulée à l'aide de l'ICD. Cependant, les inducteurs de la CIM peuvent également induire l'expression des récepteurs de point de contrôle inhibiteurs CD47 et PD-L1 sur les cellules tumorales, rendant les tumeurs CRC résistantes principalement à la destruction des lymphocytes T CD8 et à la phagocytose médiée par les macrophages. Dans cette étude, nous avons examiné l'effet thérapeutique du régime Oxaliplatine et FOLFOX en combinaison avec des anticorps bloquants contre CD47 et PD-L1. Le traitement par FOLFOX et Oxaliplatine conduit à une augmentation de l'expression de CD47 et PD-L1 sur les cellules CT-26 in vitro et in vivo. La combinaison d'anticorps bloquants contre CD47 et PD-L1 avec FOLFOX entraîne une augmentation significative de la survie et une diminution de la taille de la tumeur. Ce triple régime de combinaison conduit également à une diminution significative des Treg et des MDSC et à une augmentation significative des lymphocytes CD8 + INF-γ + et du rapport des macrophages M1/M2 dans le microenvironnement tumoral. Notre étude a montré que la triple thérapie combinée avec FOLFOX, CD47 et PD-L1 est un schéma thérapeutique efficace dans le modèle tumoral de souris CT-26 et peut être considérée comme un potentiel à traduire en clinique.

Malgré des années de recherche avancée, le cancer colorectal (CCR) reste l'un des types de tumeurs solides les plus courants et les plus agressifs. En tant que première ligne de traitement du CCR avancé, le FOLFOX (5-fluorouracile plus oxaliplatine) est utilisé en routine comme schéma de chimiothérapie combiné. Cependant, la résistance acquise aux médicaments limite leur effet anti-tumoral ; ainsi, les régimes de chimiothérapie ne sont pas administrés à des fins curatives1,2.

Bien que le blocage de l'axe protéine de mort cellulaire programmée-1 (PD-1)/ligand de mort programmée-1 (PDL-1) ait conduit à un changement de paradigme dans l'immunothérapie du cancer et ait montré un grand potentiel dans le traitement du cancer, il ne peut pas être généralisé à tous les types de cancers3,4. Des études récentes soulignent l'importance de la contexture immunitaire du microenvironnement tumoral sur la réponse hétérogène au blocage des points de contrôle immunitaire (ICB)5. Le CCR, en particulier les tumeurs microsatellites stables (MSS), est l'une de celles qui répondent mal à la thérapie par points de contrôle en raison de sa faible immunogénicité et de sa faible infiltration tumorale de lymphocytes T CD8+4,6,7. Les patients atteints de CCR avec microsatellite instable (MSI) ont montré une plus grande quantité de lymphocytes T CD8+ infiltrés dans la tumeur préexistante et une meilleure réponse au traitement anti-PD-17,8.

Une façon d'améliorer la faible immunogénicité des tumeurs et l'infiltration des lymphocytes T CD8+ consiste à utiliser un inducteur de mort cellulaire immunologique (ICD) comme agent chimiothérapeutique1,9,10. Il a été démontré que le régime FOLFOX et l'oxaliplatine induisent efficacement la CIM, bien qu'ils augmentent l'expression des récepteurs de points de contrôle dans les cellules tumorales et les lymphocytes1,11. Parmi les récepteurs aux points de contrôle, PD-L1 et CD47 sont tous deux surexprimés après traitement par FOLFOX et oxaliplatine chez les patients1.

La régulation à la hausse de CD47, un mécanisme par lequel les cellules cancéreuses augmentent leur "soi", joue un rôle important dans l'inhibition de la phagocytose des cellules tumorales par les macrophages et les cellules dendritiques (CD). De plus, une augmentation de son expression conduit au blocage de la présentation croisée par les DCs12,13. Une expression plus élevée de CD47 est observée dans de larges types de cancers associés à un pronostic plus faible et à une augmentation de la mortalité. Le blocage de CD47/protéine régulatrice du signal α (SIRPα) est une nouvelle ère émergente dans l'immunothérapie du cancer14. Plusieurs études d'essais cliniques étudient le bénéfice clinique de ce récepteur de point de contrôle immunitaire inné, avec certains essais de phase I publiés15,16. Cependant, on s'attend à ce que les monothérapies bloquant CD47/SIPR-α n'agissent pas comme un traitement curatif, et la combinaison de la thérapie innée avec les ICB adaptatifs et les chimiothérapies sont à l'honneur14,17,18,19.

Dans la présente étude, nous avons cherché à étudier le potentiel d'une thérapie combinée utilisant l'oxaliplatine (OXP) comme inducteur efficace d'ICD et en libérant des modèles moléculaires associés aux dommages (DAMP) qui agissent comme un vaccin intrinsèque avec des anti-CD47 et anti-PD-L1. Nous émettons l'hypothèse qu'en fournissant un signal "mange-moi" et en bloquant le signal "ne me mange pas", via l'inducteur ICD et en bloquant respectivement CD47, les DC et les macrophages phagocyteraient les cellules tumorales et induiraient une réponse immunitaire. Dans le bras effecteur par les lymphocytes T CD8+, le blocage du PD-L1 renforce leur fonction effectrice et détruit les cellules tumorales. En utilisant le modèle de souris CT-26, nous examinons plus en détail le remplacement de l'oxaliplatine par FOLFOX dans notre thérapie combinée conçue pour évaluer la source de synergie potentielle. Nos données ont révélé que chez les souris porteuses de tumeur CT-26, FOLFOX dans une combinaison d'anti-CD47 et d'anti-PD-L1 a entraîné une augmentation significative de la survie et une réduction de la taille de la tumeur.

Pour évaluer si le régime OXP et FOLFOX affecte l'expression de CD47 et PD-L1 dans les cellules CT-26 in vitro, nous avons analysé leur expression par le cytomètre en flux après un traitement avec des agents chimiothérapeutiques. Six heures après le traitement des cellules avec OXP ou FOLFOX dans le milieu de culture cellulaire, les cellules ont été extraites des puits et analysées par un cytomètre en flux. Les régimes OXP et FOLFOX augmentent l'expression de CD47 et de PD-L1 à la surface des cellules CT-26 (Fig. 1A – F). FOLFOX augmente même l'expression de CD47 et PD-L1 plus que OXP (P < 0,0001).

FOLFOX et OXP ont augmenté l'expression de CD 47 et PD-L1 à la surface cellulaire des lignées cellulaires CT-26. (A – D) Stratégies de déclenchement pour l'analyse de l'expression de surface cellulaire CD47 et PD-L1 dans la lignée cellulaire tumorale CT-26 après traitement avec OXP et FOLFOX. (E) Les cellules tumorales CT-26 ont été traitées avec OXP ou FOLFOX, et l'expression de CD47 a été analysée par cytométrie en flux. (F) les cellules tumorales ont été traitées avec OXP ou FOLFOX, et l'expression de PD-L1 a été analysée par cytométrie en flux.

Nous avons ensuite examiné l'effet du régime OXP et FOLFOX sur l'expression de CD47 et de PD-L1 invivo (Fig. 2A – G). Des souris portant une tumeur CT-26, traitées avec OXP ou FOLFOX, et 3 jours après le traitement, les souris ont été euthanasiées et des cellules individuelles ont été obtenues à partir de la masse tumorale. Le régime FOLFOX et l'OXP ont augmenté de manière significative l'expression de PD-L1 dans les cellules tumorales extraites de souris (P < 0,0001 et P = 0,048, respectivement). De plus, comme le montre la figure 2C, FOLFOX augmente également l'expression de PD-L1 par rapport à OXP. L'expression de CD47 n'a augmenté de manière significative que lorsque les souris ont été traitées avec FOLFOX (P <0,0001), mais OXP n'a pas réussi à augmenter l'expression de CD47 de manière significative.

Effet de FOLFOX et OXP sur l'expression de surface cellulaire de CD47 et PD-L1 dans des tumeurs inoculées CT-26. (A – E) Stratégies de déclenchement pour l'analyse de l'expression de la surface cellulaire CD47 et PD-L1 dans la tumeur CT-26 chez la souris après un traitement avec OXP et FOLFOX. (F) Les cellules tumorales CT-26 ont été traitées avec OXP ou FOLFOX, et l'expression de CD47 a été analysée par cytométrie en flux. (G) Les cellules tumorales ont été traitées avec OXP ou FOLFOX, et l'expression de PD-L1 a été analysée par cytométrie en flux.

Ensuite, nous avons cherché à déterminer si l'association d'une thérapie avec des agents chimiothérapeutiques anti-CD47, anti-PD-L1 et immunologiques inducteurs de la mort (OXP ou FOLFOX) pouvait générer une réponse anti-tumorale par rapport à une chimiothérapie ou une thérapie bi-associant une chimiothérapie et des bloqueurs de points de contrôle. Lorsque le modèle de tumeurs de souris CT-26 s'est établi, chaque groupe a reçu les agents thérapeutiques correspondants. le programme détaillé d'injection d'agents chimiothérapeutiques et/ou d'anti-CD47 et d'anti-PD-L1 est résumé sur la figure 3A. Pour surveiller les effets secondaires et la toxicité éventuelle de notre régime combiné, les souris ont été pesées au cours de l'étude. Aucune perte de poids significative n'a été observée dans aucun des groupes thérapeutiques (Fig. 3B).

La combinaison de FOLFOX, anti-CD47 et anti-PD-L1 a montré le meilleur potentiel dans le modèle de tumeur syngénique CT-26. (A) Calendrier détaillé pour l'injection d'agents thérapeutiques. (B) Changements dans le poids corporel moyen (g) des souris porteuses de tumeurs dans les groupes témoins et différents groupes traités. (C) Survie des souris en jours, avec survie médiane indiquée. Les significations ont été déterminées par le test du log-rank (MantelCox) ; n = 5 souris par groupe. (D) Des souris BALB/c porteuses d'une tumeur CT-26 ont reçu une injection du régime thérapeutique correspondant selon le calendrier indiqué. Le volume de la tumeur a été mesuré aux moments indiqués. (E–K) volume tumoral de chaque souris dans tous les groupes thérapeutiques.

La combinaison d'anti-CD47 et d'anti-PD-L1 avec le régime OXP ou FOLFOX a entraîné une augmentation significative de la survie des souris recevant trois régimes combinés par rapport aux monothérapies avec des agents chimiothérapeutiques et au régime bicombinig (anti-CD47 ou anti-PD-L1 avec OXP) (Fig. 3C). Ces données sont également étayées par les données sur le temps nécessaire pour atteindre le point final (TTE) et le pourcentage de retard de croissance tumorale (TTG) dans le tableau 1. L'analyse de la taille de la tumeur a également montré que les souris recevant des anti-CD47, des anti-PD-L1 et du FOLFOX avaient le taux de croissance tumorale le plus lent (Fig. 3D – K).

Pour déterminer les facteurs possibles qui ont conduit à une meilleure réponse thérapeutique au régime de combinaison triple chez des souris porteuses de tumeur CT-26, nous avons examiné le contenu des lymphocytes Treg et CD8+/INF-γ+ dans la rate et les ganglions lymphatiques. Le profilage des cellules immunitaires dans les ganglions lymphatiques drainant la tumeur n'a montré aucun changement significatif entre les groupes thérapeutiques (Fig. S1 supplémentaire). Dans la rate, l'OXP et la monothérapie FOLFOX ont entraîné une augmentation de la population de Treg, bien que cette augmentation de la population de Treg n'ait pas été significative. L'association d'OXP sans anti-CD47 ni anti-PD-L1 n'a pas d'impact significatif sur la population Treg. Le régime triple combinaison a diminué de manière significative la teneur en Treg par rapport à la monothérapie OXP et FOLFOX (Fig. 4A, B). Les lymphocytes T CD8+/INF-γ+ augmentent également dans la rate des souris recevant OXP ou FOLFOX + anti-CD47 et anti-PD-L1 par rapport aux souris du groupe contrôle et aux souris recevant OXP ou FOLFOX. De plus, FOLFOX + anti-CD47 et anti-PD-L1 a augmenté les lymphocytes T CD8 + / INF-γ + par rapport à OXP + anti-PD-L1 (Fig. 4C, D).

L'association d'un traitement avec OXP ou FOLFOX avec anti-CD47 et anti-PD-L1 a diminué le Treg dans les cellules CD4 + et augmenté les cellules CD8 + / INF-γ + dans la population CD45 + de la rate. (A) Stratégie de déclenchement utilisée pour l'analyse Treg dans la rate. (B) OXP et FOLFOX ont augmenté les Treg dans les cellules CD4+, mais cette augmentation n'était pas significative. L'OXP ou le FOLFOX combinés à l'anti-CD47 et à l'anti-PD-L1 ont diminué le Treg dans les cellules CD4 +, et cette diminution était significative par rapport aux souris recevant le régime OXP ou FOLFOX seul. (C) Stratégie de déclenchement utilisée pour l'analyse CD8+/INF-γ+ dans la population CD 45+ de la rate. (D) L'OXP ou le FOLFOX combinés à l'anti-CD47 et à l'anti-PD-L1 ont augmenté les CD8+/INF-γ+ dans la population CD45+. Cette augmentation était significative par rapport à la plupart des autres groupes thérapeutiques.

Sur la base des preuves mentionnées ci-dessus, il est fort probable que la thérapie combinée ait entraîné une modification du microenvironnement tumoral en faveur de l'activation du système immunitaire. Nous avons donc étudié l'évolution de différentes populations de cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral après les traitements. Le nombre de Treg par gramme de tumeur n'a augmenté qu'après une monothérapie avec des chimiothérapies, mais cette augmentation de la teneur en Treg était significative chez les souris recevant FOLFOX. Lorsque l'anti-CD47 et l'anti-PD-L1 sont administrés simultanément avec l'OXP et le FOLFOX, cela entraîne une diminution du contenu tumoral en Treg par rapport à la monothérapie avec des agents chimiothérapeutiques. Cependant, cette diminution de la teneur en Treg n'était significative que chez les souris recevant FOLFOX + anti-CD47 et anti-PD-L1 par rapport aux souris recevant FOLFOX seul (Fig. 5A).

Analyse des cellules immunitaires dans le microenvironnement tumoral de souris porteuses d'une tumeur CT-26. (A) Nombre de Treg par gramme de tumeur. Le nombre de Treg a augmenté dans le microenvironnement tumoral après un traitement avec les régimes OXP et FOLFOX, cependant, il n'était significatif que dans le groupe recevant FOLFOX. L'association anti-CD47 et anti-PD-L1 avec FOFOX entraîne une diminution significative des Treg par gramme de tumeur par rapport aux souris recevant FOLFOX seul. (B) Nombre de cellules CD8+T par gramme de tumeur. OXP et FOLFOX et FOLFOX n'ont pas changé, le nombre de lymphocytes T CD8+, mais dans les groupes qui ont reçu des anti-CD47 dans le cadre de leur traitement, le nombre de lymphocytes T CD8+ par gramme de tumeur a augmenté de manière significative. (C) Numéro MDSC par gramme de tumeur. (C) OXP et FOLFOX ont augmenté le nombre de MDSC, mais cela n'était significatif que dans le groupe recevant FOLFOX lorsque nous avons ajouté l'anti-CD47 dans le régime combiné, cela entraîne une diminution significative du nombre de MDSC par rapport aux souris recevant OXP, FOLFOX et OXP + PD-L1. D, rapport macrophage M1/M2 dans le microenvironnement tumoral. L'ajout d'anti-CD47 aux régimes combinés augmente le rapport des macrophages M1/M2 par rapport aux autres groupes.

Les lymphocytes T CD8+ par gramme de tumeur ont augmenté de manière anti-CD47 ; presque tous les groupes thérapeutiques qui ont reçu de l'anti-CD47 dans le schéma thérapeutique ont montré une augmentation significative des lymphocytes T CD8+ par rapport aux groupes qui n'en ont pas reçu (Fig. 5B). Le MDSC par gramme de tumeur a également augmenté de manière significative après les traitements OXP et FOLFOX. De plus, la monothérapie FOLFOX a augmenté la teneur en MDSC dans les tumeurs par rapport à la monothérapie OXP. Cette augmentation de MDSC par gramme de tumeur a été inversée en utilisant l'anti-CD47 conformément à son effet sur la teneur en Treg de la tumeur (Fig. 5C). Nous étudions également l'effet d'un schéma thérapeutique sur le rapport M1/M2 dans le microenvironnement tumoral. La monothérapie FOLFOX ou OXP n'affecte pas significativement le rapport M1/M2 dans une tumeur. Mais chez les souris recevant des anti-CD47 sous forme de bithérapie avec OXP et de tricombinaison avec OXP ou FOLFOX, le rapport M1/M2 a augmenté de manière significative (Fig. 5D).

Dans cette étude, nous avons évalué le potentiel de combiner la chimiothérapie avec le blocage des récepteurs de point de contrôle immunitaire innés et adaptatifs dans le modèle de souris CT-26. L'importance de combiner les bloqueurs de points de contrôle innés et adaptatifs a été soulignée dans plusieurs rapports publiés. Le rationnel derrière la combinaison de bloqueurs de points de contrôle innés et adaptatifs est d'orchestrer les réponses des cellules DC, macrophages et T contre les cellules tumorales20,21. Les schémas thérapeutiques OXP et FOLFOX sont signalés comme des inducteurs efficaces de DCI et sont en clinique pour le traitement de routine des patients atteints de CCR.

Conformément à de nombreuses études qui ont rapporté une augmentation des récepteurs de points de contrôle après un traitement de chimiothérapie, nous constatons une augmentation de l'expression de CD47 et de PD-L1 après un traitement avec OXP et FOLFOX11,22. En raison de la toxicité du schéma de chimiothérapie OXP et FOLFOX, l'analyse in vitro de l'expression de CD47 et PD-L1 n'a pu être évaluée que six heures après le traitement des cellules CT-26. Compte tenu de cette limitation, l'expression de PD-L1 a augmenté à la fois par OXP et FOLFOX dans des expériences in vitro et in vivo, et une augmentation de l'expression de surface cellulaire CT-26 de CD47 a été constatée après un traitement avec OXP et FOLFOX, in vitro. Chez les souris porteuses de tumeurs, seul FOLFOX a induit une augmentation de l'expression de CD47, et même si le traitement OXP a augmenté l'expression de CD47 à la surface des cellules CT-26, cette augmentation était insignifiante. Plusieurs études ont révélé que la digestion enzymatique a une influence sur l'expression des marqueurs de surface cellulaire ; par conséquent, l'absence d'augmentation significative de l'expression de CD47 par OXP peut être attribuée à une perte partielle de CD47 après la digestion enzymatique de la tumeur23,24. Plusieurs mécanismes pourraient être impliqués dans l'augmentation de l'expression des récepteurs de points de contrôle après les chimiothérapies. Dans une étude récente, Samanta et al. ont rapporté un mécanisme dépendant de HIF pour une augmentation de l'expression de PD-L1 et de CD47 après un traitement avec des agents chimiothérapeutiques11. De plus, les chimiothérapies inductrices de CIM augmentent l'infiltration des lymphocytes T et de l'INF-γ sécrété par les lymphocytes infiltrés. Cette augmentation de l'infiltration des cellules effectrices et de la sécrétion d'INF-γ a suggéré d'être un autre facteur qui augmente l'expression des points de contrôle inhibiteurs, tels que PD-L1 et CD47 sur les cellules tumorales25,26,27,28.

L'anti-CD47 et l'anti-PDL-1 ont été utilisés en association avec différents schémas de chimiothérapie et ont montré des résultats prometteurs chez la souris et les essais cliniques. Cependant, notre étude est la première à étudier la synergie possible en utilisant la triple combinaison de chimiothérapie et d'immunothérapie. L'OXP combiné à l'anti-CD47 et à l'anti-PD-L1 a augmenté la survie des souris et réduit la croissance tumorale par rapport à l'OXP seul. Ce résultat est cohérent avec une augmentation de l'expression de CD47 et PD-L1 après traitement OXP conduisant à une suppression de la phase d'activation et de la phase effectrice de la réponse immunitaire. En utilisant des anti-CD47 et des anti-PD-L1, nous avons pu supprimer le signal de point de contrôle négatif et orchestré une réponse immunitaire contre la tumeur. FOLFOX a même montré plus de potentiel lorsqu'il est utilisé en association avec l'anti-CD47 et l'anti-PD-L1. La raison derrière cette observation pourrait être une plus forte libération de DAMP par les cellules tumorales après une chimiothérapie avec FOLFOX sur OXP, qui a été rapportée par Dosset et al.1.

Comme nous nous y attendions, nos protocoles de traitement ont eu un impact significatif sur le profil des cellules immunitaires dans le microenvironnement de la rate et de la tumeur. Dans la rate, les régimes OXP et FOLFOX ont augmenté la fréquence des Treg ; cependant, cette augmentation n'était pas statistiquement significative. Mais lorsque nous avons utilisé l'anti-CD47 et l'anti-PD-L1 combinés avec OXP ou FOLFOX, cela a entraîné une diminution significative de la fréquence des Treg par rapport au traitement avec OXP et FOLFOX seuls. Nous n'avons pas observé cette diminution des Treg lorsque les souris étaient traitées avec de l'OXP en agent double associé à un anti-CD47 ou un anti-PD-L1. Dans le microenvironnement tumoral, la variation du nombre de Treg par gramme de tumeur a suivi le même schéma que la variation de la fréquence des Treg dans la rate. Mais seul FOLFOX a apporté des modifications statiquement significatives. Les anti PD-L1 et les anti CD47 ont été capables de supprimer la fonction Treg et de réduire le nombre de Treg dans la tumeur et les organes lymphatiques dans des études antérieures29,30. Dans notre étude, leur effet bénéfique n'a été observé que lorsque les anti-CD47 et anti-PD-L1 étaient utilisés en triple association avec des agents chimiothérapeutiques.

Nous avons montré que l'infiltration des lymphocytes T CD8+ augmentait significativement dans le microenvironnement tumoral des souris recevant des anti-CD47 dans le cadre de leurs schémas thérapeutiques. Dans des études récentes, le blocage de CD47/SIPR-α a entraîné une augmentation de la fréquence et de la fonction des lymphocytes T CD8+ dans le microenvironnement tumoral30,31. Liu et al. ont rapporté que dans le blocage de CD47, l'effet anti-tumoral dépend de l'amorçage croisé des cellules T CD8+ par les cellules DC32. Une augmentation du nombre de lymphocytes T CD8+ par gramme de tumeur dans la présente étude confirme le bénéfice de survie et la diminution des résultats de la taille de la tumeur, sauf que nous n'avons pas observé le bénéfice de la survie des souris recevant OXP et anti-CD47. L'OXP et l'anti-CD47 n'ont pas réussi à réduire la teneur en Treg dans le microenvironnement de la rate et de la tumeur ; cet échec pourrait être la raison pour laquelle dans cette stratégie de traitement, malgré une augmentation des lymphocytes T CD8+, nous n'avons pas vu la réponse thérapeutique.

Outre leur effet cytotoxique, les agents chimiothérapeutiques augmentent la fréquence des MDCS par l'action de médiateurs inflammatoires, notamment le GM-CSF, le G-CSF, l'IL1β, l'IL6 et le CCL233,34. Nous analysons également le nombre de MDSC par gramme de tumeur et le rapport M1/M2 dans le microenvironnement tumoral. Le nombre de MDSC par gramme de tumeur a augmenté après la monothérapie avec les régimes OXP et FOLFOX. Lorsque nous ajoutons l'anti-CD47 dans le schéma thérapeutique combiné, cette augmentation des MDSC s'est inversée et le nombre de MDSC par gramme de tumeur a diminué. Conformément à notre étude, Wu et al. ont également rapporté une diminution de la population MDSC suite à un traitement par anti-CD4735. Les macrophages M2 jouent un rôle important dans la progression du cancer en fournissant un microenvironnement immunosuppresseur pour la croissance tumorale36. Zhang et al. ont rapporté la repolarisation des macrophages M2 en M1 suite à un traitement anti-CD4737. Dans notre étude sur trois groupes de souris recevant des anti-CD47 en combinaison de traitements, le rapport macrophages M1/M2 a été augmenté.

Nos résultats ont validé le concept d'utilisation de bloqueurs de points de contrôle innés et adaptatifs en combinaison avec des agents chimiothérapeutiques. Sur la base de nombreuses études, parmi différents agents chimiothérapeutiques, ceux qui ont la capacité d'induire la CIM semblent mieux s'adapter aux thérapies combinées avec des inhibiteurs de point de contrôle. Sinon pour tous les cancers, du moins dans le modèle de tumeur CT-26, il semble que le blocage des axes CD47 et PD-L1 soit nécessaire pour la meilleure réponse thérapeutique.

Les anticorps monoclonaux IgG anti-souris CD47 et IgG anti-souris PD-L1 bloquant (clone : MIAP301 et 10F.9G2 respectivement) ont été achetés auprès de Bioxcell (NH, USA). PerCP Rat anti-souris CD4 anticorps (clone RM4-5), Rat anti-souris CD8a marqué PE (clone 53-6.7), Rat anti-souris CD25 marqué PE (clone PC61), Rat anti-souris Foxp3 marqué Alexa-flour® 488 (clone MF-14), Alexa Fluor® 488 anti-souris CD47 (MIAP301), PE anti-souris CD274 (B7-H 1, anticorps PD-L1) (clone 10F.9G2), anticorps PerCPanti-souris/humain CD11b (clone M1/70), anticorps Alexa Fluor® 488 anti-souris CD80 (clone 16-10-A1), PE anti-souris CD206 (MMR) anticorps (clone C068C2), anticorps anti-souris CD45 marqué APC (clone 30F11), NIR Zombie die (pour la discrimination vivant/mort), comme ainsi que des anticorps de contrôle d'isotype appropriés et un ensemble de tampons de facteur de transcription True-Nuclear™ ont été achetés auprès de Biolegend (CA, San Diego). La collagénase de type I a été achetée chez Gibco (NY, USA). La DNase de type I a été achetée chez Roche (USA). Les solvants et réactifs chimiques restants étaient de qualité chimique.

Pour déterminer l'effet de l'OXP et du FOLFOX sur l'expression à la surface cellulaire de CD47 et PD-L1, la lignée cellulaire CT-26 (Pasture Institute, Téhéran, Iran) a été cultivée dans du RPMI 1560 Gibco (NY, USA) avec 10 % de FBS Gibco (NY, USA), de la pénicilline et de la streptomycine, puis ensemencées dans une plaque à 6 puits. Après 24 h, les cellules ont été traitées avec 50 µM d'OXP (Sobhan, Téhéran, Iran) ou 50 µM d'OXP (Sobhan, Téhéran, Iran) plus 10 µM de 5-fluorouracile (régime FOLFOX), (Alhavi, Téhéran, Iran). La concentration d'agent chimiothérapeutique utilisée pour l'étude in vitro était basée sur des études antérieures, qui ont conduit à une induction maximale de la CIM1. Six heures après que les cellules tumorales CT-26 ont été traitées avec des agents chimiothérapeutiques, les cellules ont été récoltées, colorées avec des anticorps conjugués au fluorochrome et analysées pour l'expression de surface cellulaire de CD47 et PD-L1 avec un cytomètre en flux BD FACSlyric (Becton Dickinson, États-Unis).

Des souris BALB/c femelles âgées de six à huit semaines ont été achetées à l'Institut Pasteur, Thran, Iran et logées dans des conditions appropriées. Toutes les études animales ont été réalisées conformément aux directives et réglementations pertinentes et aux directives ARRIVE. L'étude animale a également été approuvée par le comité d'éthique institutionnel et le comité consultatif de recherche de l'Université des sciences médicales Shahid Beheshti avec le numéro de code d'éthique : IR. SBMU. MSP.REC.1396.370. Une procédure d'induction tumorale détaillée est décrite précédemment38,39. En bref, 106 cellules tumorales CT-26 ont été injectées dans le flanc droit de chaque souris BALB/c. Lorsque la tumeur a atteint 150 mm3, les souris ont été réparties au hasard dans des groupes de traitement en fonction du volume de leur tumeur, comme suit : contrôle (souris recevant un placebo), OXP (souris recevant de l'oxaliplatine, 6 mg/kg), FOLFOX (souris recevant de l'oxaliplatine, 6 mg/kg + 5FU, 50 mg/kg + flavinine 90 mg/kg), OXP + anti-CD47 (100 µg par souris), OXP + anti-PD-L 1 (200 µg par souris), OXP + anti-CD47 + anti-PD-L1 et FOLFOX + anti-CD47 + anti-PD-L1. La dose et le calendrier utilisés pour les schémas thérapeutiques OXP et FOLFOX étaient basés sur des études antérieures, avec une induction maximale de la CIM et une cytotoxicité minimale1. Nous avons commencé les injections d'agents chimiothérapeutiques après que les tumeurs aient atteint 150 mm3 (7 jours après l'inoculation de la tumeur). Le programme détaillé pour l'injection d'agents thérapeutiques est illustré sur la figure 3A. La taille de la tumeur des souris portant la tumeur CT-26 a été mesurée avec des pieds à coulisse numériques tous les trois jours, et le volume de la tumeur a été calculé comme a × b2/2, où a est le plus grand diamètre et b le plus petit diamètre. Les mesures de la taille de la tumeur ont été poursuivies jusqu'à ce que la taille de la tumeur atteigne 2000 mm3. Le calcul détaillé du temps nécessaire pour atteindre le point final (TTE), le retard de croissance tumorale (%TGD) et l'augmentation de la durée de vie (ILS) de chaque souris a été décrit dans nos études précédentes40,41.

Vingt-deux jours après l'inoculation de la tumeur (7 jours après la dernière injection dans les groupes thérapeutiques), trois souris de chaque groupe ont été sacrifiées par asphyxie au CO2 sous euthanasie à l'isoflurane, et leurs ganglions lymphatiques drainants, leur rate et leurs tumeurs ont été analysés pour la population de cellules immunitaires. Dans le cas des ganglions lymphatiques drainants et de la rate, la fréquence des lymphocytes Treg et CD8+/INF-γ+ a été analysée dans la population de cellules vivantes CD45+. Pour la séparation unicellulaire, nous avons utilisé une passoire cellulaire de 70 µm (SPL, Corée du Sud), et toutes les procédures de coloration pour la cytométrie en flux étaient basées sur les instructions du fabricant. Pour l'analyse de la tumeur, nous avons digéré la tumeur avec 2 mg/ml de collagénase de type I et 10 UI/ml de DNase de type I dans le milieu RPMI. Après 90 min de digestion, les cellules individuelles ont été séparées de la suspension cellulaire à l'aide d'un tamis cellulaire de 70 µm. Pour analyser l'effet de l'oxaliplatine et du FOLFOX sur l'expression à la surface cellulaire de CD 47 et PD-L1 Invivo, leur expression a été analysée dans CD45-live cell gate. Nous avons également analysé la population exacte de T reg, de lymphocytes T CD8+/INF-γ+, de MDCS et de macrophages M1/M2 dans le microenvironnement tumoral. Pour quantifier le nombre exact de cellules infiltrées, nous avons calculé les cellules séparées par gramme de tumeur. En utilisant la fréquence de chaque population cellulaire dans la porte de la cellule vivante, nous avons pu modifier la fréquence de chaque population cellulaire en nombre de cellules spécifiques par gramme de tumeur. La stratégie de déclenchement utilisée pour chaque population cellulaire est résumée dans les figures correspondantes.

L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism (CA, USA). Pour les comparaisons à deux groupes, le test t et le test de Mann-Whitney ont été utilisés. Pour la comparaison de plusieurs groupes, le test ANOVA unidirectionnel ou bidirectionnel a été utilisé. Toutes les différences ont été considérées comme statistiquement significatives au niveau de p < 0,05 (*p < 0,05, **p < 0,01). L'analyse de la survie a été faite avec un test de Mantel-Cox. Les valeurs de p < 0,05 ont été considérées comme statistiquement significatives.

Les données à l'appui des conclusions de cette étude sont disponibles sur demande auprès de l'auteur correspondant, Seyed Amir Jalali par e-mail ([email protected]).

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Cet article est extrait de la thèse rédigée par M. Reza Alimohammadi à l'École de médecine de l'Université des sciences médicales Shahid Beheshti (numéro d'enregistrement : 364). ID d'approbation du comité d'éthique : IR. SBMU. MSP.REC.1396.370. Ce travail a été soutenu par l'Université des sciences médicales Shahid Beheshti (Grant no: 10244).

Département d'immunologie, École de médecine, Université des sciences médicales Shahid Beheshti, Téhéran, 198571-7443, Iran

Reza Alimohammadi, Esmail Mortaz, Nariman Mossafa & Seyed Amir Jalali

Groupe Immunothérapie Tumorale et Microenvironnement (TIME), Département d'Oncologie, Luxembourg Institute of Health (LIH), Luxembourg Ville, Luxembourg

Ghanbar Mahmoodi Chalbatani

Département d'immunologie, École de médecine, Université des sciences médicales de Téhéran, Téhéran, Iran

Masoumeh Alimohammadi

Département d'immunologie, Faculté des sciences médicales, Université des sciences médicales de Mashhad, Mashhad, Iran

Haniyeh Ghaffari-Nazari

Département d'immunologie, Faculté des sciences médicales, Université Tarbiat Modares, Téhéran, Iran

Arezou Rahimi

JJP Biologics, Varsovie, Pologne

Louis Bean

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Les auteurs RA & SAJ ont conçu l'étude. RA a conçu et mené une expérience de cytométrie en flux multicolore. RA, GMC, MA, HG & AR, ont mené les expériences in vitro et in vivo. RA, MA & AR ont rédigé le manuscrit. RA, MA, EM, NM, LB, SAJ et AR ont édité le manuscrit. SAJ a financé le projet.

Correspondance à Seyed Amir Jalali.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Alimohammadi, R., Mahmoodi Chalbatani, G., Alimohammadi, M. et al. Le double blocage de PD-L1 et de CD47 améliore l'effet thérapeutique de l'oxaliplatine et du FOLFOX dans le modèle tumoral de souris CT-26. Sci Rep 13, 2472 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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Reçu : 24 août 2022

Accepté : 03 février 2023

Publié: 11 février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-29363-9

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