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Oct 25, 2023

TREM2+ et interstitiel

Volume Communication Nature

Nature Communications volume 14, Numéro d'article : 1914 (2023) Citer cet article

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Les mécanismes immunopathologiques à l'origine du développement du COVID-19 sévère restent mal définis. Ici, nous utilisons un modèle de macaque rhésus d'infection aiguë par le SRAS-CoV-2 pour délimiter les perturbations du système immunitaire inné. Le SRAS-CoV-2 initie une infiltration rapide des cellules dendritiques plasmacytoïdes dans les voies respiratoires inférieures, proportionnelle à la production d'IFNA, à l'activation des cellules tueuses naturelles et à une augmentation significative des monocytes sanguins CD14-CD16+. Pour disséquer la contribution des sous-ensembles myéloïdes pulmonaires à l'inflammation des voies respiratoires, nous générons un ensemble de données longitudinales scRNA-Seq de cellules des voies respiratoires et cartographions ces sous-ensembles aux populations correspondantes dans le poumon humain. L'infection par le SARS-CoV-2 provoque un recrutement rapide de deux sous-ensembles de macrophages : les populations CD163+MRC1- et TREM2+ qui sont la source prédominante de cytokines inflammatoires. Le traitement par le baricitinib (Olumiant®), un inhibiteur de JAK1/2, est efficace pour éliminer l'afflux de macrophages non alvéolaires, avec une réduction des cytokines inflammatoires. Cette étude délimite les principaux sous-ensembles de macrophages pulmonaires à l'origine de l'inflammation des voies respiratoires lors de l'infection par le SRAS-CoV-2.

La pandémie de COVID-19 a commencé par une série de rapports d'épidémies localisées de pneumonie causées par un nouveau coronavirus, le SRAS-CoV-2, à Wuhan, en Chine, en décembre 20191,2. Au début de 2023, il y avait eu plus de 672 millions d'infections documentées et près de 7 millions de décès attribués aux séquelles de COVID-19. Le développement rapide et la disponibilité de vaccins efficaces3,4,5 contre l'infection par le SRAS-CoV-2 ont fourni l'optimisme bien nécessaire que les taux d'infection diminueront et que le confinement du virus au niveau de la population est possible. Malgré ces réalisations marquantes, des efforts de recherche continus sont essentiels pour se prémunir contre d'éventuelles variantes révolutionnaires, pour développer des thérapies pour les personnes atteintes pendant que le déploiement du vaccin se poursuit et pour prévenir ou minimiser l'impact de futures épidémies virales. Dans cette optique, la recherche fondamentale sur les réponses immunitaires innées et adaptatives au SRAS-CoV-2 continue d'être essentielle pour éclairer les approches vaccinales et thérapeutiques visant à mettre fin à la pandémie de COVID-19 ou à réduire la mortalité.

Depuis l'émergence de la pandémie de COVID-19, la recherche sur la virologie, les réponses immunitaires et la pathogenèse de l'infection par le SRAS-CoV-2 s'est amassée à un rythme sans précédent, et de nombreuses hypothèses ont surgi pour expliquer les mécanismes sous-jacents du COVID-19 sévère. Parmi ceux-ci, les concepts qui ont accumulé le plus de preuves à l'appui sont : (1) l'évasion ou l'altération des réponses précoces à l'interféron de type I (IFN)6, (2) les complications vasculaires résultant des syndromes d'hypercoagulabilité7 et (3) les perturbations des compartiments granulocytes et myéloïdes dans les voies respiratoires inférieures et le sang se manifestant par la production de cytokines inflammatoires8,9. Sur le plan immunologique, la maladie grave chez les patients COVID-19 a été associée à une augmentation généralisée des niveaux de médiateurs inflammatoires (par exemple, CXCL10, IL-6 et TNFα) dans le plasma et le liquide de lavage bronchoalvéolaire (BAL) dans ce que l'on appelle communément une "tempête de cytokines"10, et une expansion des macrophages, des neutrophiles et des lymphocytes dans les voies respiratoires inférieures8. Malgré cette accumulation impressionnante de données, les événements immunologiques précoces précis et l'infiltration de cellules immunitaires qui entraînent l'inflammation dans les voies respiratoires inférieures restent non caractérisés.

Les modèles de primates non humains (PNH) de l'infection par le SRAS-CoV-2 (principalement les espèces de macaques et les singes verts d'Afrique (AGM)) se sont révélés être des outils essentiels, principalement en raison de la capacité d'examiner les événements précoces après l'infection de manière longitudinale et dans des tissus non disponibles dans la plupart des études humaines11. Les PSN soutiennent des niveaux élevés de réplication virale dans les voies respiratoires supérieures et inférieures12,13,14, partagent la distribution tissulaire de l'ACE2 et du TMPRSS2 avec les humains15, et ont été des modèles précliniques inestimables de vaccins16,17,18 et thérapeutiques19,20. De plus, il a été démontré que la COVID-19 légère à modérée est récapitulée dans les PSN infectés par le SRAS-CoV-211 qui disparaissent généralement 10 à 15 jours après l'infection (dpi)11,20,21. Des études mécanistes de l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les PSN ont utilisé une variété de techniques à haut débit et ont rapporté (1) des réponses IFN de type I sont fortement induites dans le sang et les voies respiratoires inférieures très tôt après l'infection20,22, (2) des cytokines pro-inflammatoires élevées compatibles avec la « tempête de cytokines » observées chez l'homme sont détectables dans le plasma et le BAL23, (3) une pathologie vasculaire et une expression génique compatibles avec l'hypercoagulabilité sont évidentes dans les voies respiratoires inférieures22, et (4) augmentation de la production de cytokines inflammatoires par les cellules d'origine myéloïde20,24.

Dans la présente étude, nous avons utilisé des macaques rhésus (MR) infectés par le SRAS-CoV-2 pour étudier les événements inflammatoires précoces survenant dans le sang et les voies respiratoires inférieures à l'aide de la cytométrie en flux à haute dimension, de la détection de cytokines multi-analytes et de l'ARN-Seq en vrac et unicellulaire (scRNA-Seq). Pour disséquer le rôle de sous-ensembles immunitaires discrets au sein de la fraction myéloïde dans l'inflammation induite par le SRAS-CoV-2, nous avons utilisé deux stratégies différentes, en utilisant des ensembles de données de référence scRNA-Seq et bulk-RNA-Seq pour classer les populations de macrophages/monocytes et pour identifier des populations analogues dans les ensembles de données des voies respiratoires humaines. Avec cette approche, nous avons identifié les principaux sous-ensembles de macrophages pro-inflammatoires qui se développent après une infection par le SRAS-CoV-2 et sont la source prédominante de cytokines inflammatoires dans les voies respiratoires. Nous avons également observé une induction précoce des cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans le sang et les voies respiratoires inférieures qui a coïncidé avec le pic de la signalisation IFN. Enfin, nous avons décrit que le traitement des MR infectés par le SRAS-CoV-2 avec du baricitinib, un inhibiteur de JAK1/2 dont il a récemment été démontré qu'il réduisait le temps d'hospitalisation et la mortalité des patients atteints de COVID-19 sévère25, supprimait l'inflammation des voies respiratoires en supprimant l'infiltration de macrophages pro-inflammatoires dans l'espace alvéolaire. Collectivement, cette étude définit la cinétique précoce du recrutement des pDC et des réponses IFN de type I, et identifie des sous-ensembles discrets de macrophages infiltrants comme source prédominante de production de cytokines pro-inflammatoires dans l'infection par le SRAS-CoV-2.

Un aperçu de la conception de l'étude est présenté à la Fig. 1a. Nous avons analysé trois cohortes distinctes de macaques : la cohorte 1, traitée au baricitinib et la cohorte 2. Pour la cohorte 1 et traitée au baricitinib, un total de huit MR (âge moyen 14 ans ; intervalle 11-17 ans) ont été inoculés par voie intranasale et intratrachéale avec 1,1 × 106 unités formant plaque (PFU) de SARS-CoV-2 (2019-nCoV/USA- WA1/2020). À 2 dpi, quatre des huit animaux ont commencé à recevoir du baricitinib20. Pour cette étude, la ligne de base de pré-infection et les points de temps hyperaigus (1 à 2 dpi) incluent n = 8 MR, tous non traités, et les points de temps longitudinaux restants évalués pour déterminer la pathogenèse de l'infection par le SRAS-CoV-2 sont composés de n = 4 des MR qui sont restés non traités. L'inoculation avec le SRAS-CoV-2 a conduit à des titres viraux élevés reproductibles détectables dans les voies respiratoires supérieures et inférieures par des tests qPCR génomiques et sous-génomiques (Fig. 1b). Le pic de virémie dans les voies nasales, la gorge et le BAL était à 2–4 dpi (Fig. 1b). Pour augmenter la puissance de nos expériences de scRNA-Seq et de cytométrie en flux, nous avons analysé six macaques supplémentaires infectés par la même dose et la même souche de SRAS-CoV-2 (2019-nCoV/USA-WA1/2020) (âge moyen 10,5 ans ; intervalle de 6 à 19,5 ans), appelés Cohorte 2. Les animaux de la Cohorte 2 ont servi de témoins non traités infectés par le SRAS-CoV-2 dans le cadre d'une étude plus vaste tester l'impact du blocage de l'interféron26.

une conception de l'étude ; Les MR ont été infectés par voie intranasale et intratrachéale avec le SRAS-CoV-2 et suivis longitudinalement (cohorte 1 : n = 4, cohorte baricitnib : n = 4, cohorte 2 : n = 6). Le baricitinib a été administré quotidiennement à 4 MR (cohorte baricitinib) à partir de 2 dpi. Les 4 MR de la Cohorte 1 et 6 MR de la Cohorte 2 n'ont pas été traités. (Créé avec BioRender.com). b Après l'inoculation du SARS-CoV-2, des lavages nasaux, de la gorge et bronchoalvéolaires (BAL) ont été collectés et les charges virales ont été quantifiées par qRT-PCR pour l'ARNg total et l'ARNsg. c Niveaux longitudinaux de monocytes dans le BAL et le sang représentés en % de cellules CD45+. p valeurs : CD14−CD16+ Monocytes Sang : 1 dpi vs −5 dpi = 0,03 et 2 dpi vs −5 dpi = 0,004 ; CD14+CD16+ Monocytes Sang 2 dpi vs −5 dpi = 0,004. d Niveaux longitudinaux de cellules dendritiques plasmacytoïdes (pDC) dans le BAL et le sang représentés en pourcentage de cellules CD45+. Valeur p pour les pDC Sang 2 dpi vs −5 dpi = 0,02. e Niveaux longitudinaux de cellules NK exprimant la Granzyme B dans le BAL et le sang. Valeurs de p pour Granzyme B+ NK Cells 2 dpi vs −5 dpi BAL = 0,01 et sang = 0,008. n = 8 MR de la cohorte 1 et de la cohorte baricitinib. Les barres rouges représentent la moyenne. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test de rang signé Wilcoxon unilatéral dans Graphpad Prism v7.02 comparant chaque point temporel à -5 dpi. *valeur p <0,05, **valeur p <0,01. Les données source (b–e) sont fournies sous forme de fichier de données source.

Pour caractériser la réponse immunitaire innée suite à une infection par le SRAS-CoV-2, nous avons analysé les changements dans les populations innées à l'aide de la cytométrie en flux multiparamétrique dans des échantillons de sang et de BAL au cours des 2 premiers jours par pouce, ou phase "hyperaiguë" de l'infection (Fig. 1c – e et Supplémentaire Fig. 1), et pendant toute la durée de l'infection (Supplémentaire Fig. 2). Dans le sang, nous n'avons pas observé d'augmentation significative de la proportion de monocytes classiques (CD14 + CD16−) à 2 dpi (Fig. 1c) ni à des moments prolongés (Fig. 2a, d supplémentaires). Semblable aux rapports chez l'homme9, nous avons observé une augmentation rapide, mais transitoire, des monocytes sanguins CD14−CD16+ et CD14+CD16+ (Fig. 1c et Supplémentaires Fig. 2a, d). En utilisant ces marqueurs conventionnels pour les sous-ensembles de monocytes sanguins, nous n'avons observé aucun changement significatif dans CD14-CD16 +, CD14 + CD16 +, ni CD14-CD16 + dans le BAL (Fig. 1c et Supplémentaire Fig. 2a).

Nous avons observé un niveau significativement élevé de pDC dans le sang à 2 dpi et, de même, une tendance à l'élévation des pDC dans les échantillons BAL (Fig. 1d et Supplémentaires Fig. 2c, f). Cette expansion a été transitoire, car les nombres de pDC sont revenus à la ligne de base de 4 dpi. Alors que les fréquences globales des cellules tueuses naturelles (NK) n'ont pas été modifiées dans le sang ou le BAL (Fig. 2b, e supplémentaire), la fraction et le nombre absolu de cellules Granzyme B + NK ont augmenté de manière significative à 2 dpi dans le sang, passant de 4 à 25% (Fig. 1e) et est resté élevé tout au long de l'infection (Fig. 2b, e supplémentaire). De même, des augmentations de l'activation des cellules NK ont également été observées dans le BAL, passant de 12 à 33% à 2 dpi (Fig. 1e) et persistant à ce niveau jusqu'à la fin de l'étude à 10/11 dpi (Fig. Supplémentaire 2b, e). Collectivement, ces données indiquent que pendant la phase hyperaiguë de l'infection par le SRAS-CoV-2, il y a une mobilisation significative des cellules immunitaires innées capables d'initier et d'orchestrer les réponses effectrices du système IFN de type I.

Pour comprendre l'étendue des perturbations immunologiques induites par l'infection par le SRAS-CoV-2, nous avons effectué un profilage approfondi de l'expression génique des échantillons de PBMC et de BAL. Au cours de la phase hyperaiguë, le BAL présentait une induction généralisée de voies associées à l'immunité innée et à l'inflammation (Fig. 2a). Notamment, nous avons observé une induction rapide et robuste de gènes stimulés par l'interféron (ISG) dans les compartiments PBMC et BAL à partir de 1 ou 2 dpi (Fig. 2b et Fig. 3a supplémentaire). La réponse ISG, bien que généralisée, était largement revenue à la ligne de base à 10/11 dpi (Fig. 2b et Fig. 3a supplémentaire). Nous avons également détecté une tendance à l'élévation de la protéine IFNα chez 4/6 et 5/8 animaux dans le BAL et le plasma, respectivement (Fig. 2c, d) et une augmentation significative du nombre de lectures d'ARN-Seq cartographiant les gènes IFNA à 2 dpi dans le BAL (Fig. 2e), qui a coïncidé avec l'expansion des pDC dans les voies respiratoires et le sang (Fig. 1d). Un enrichissement significatif en gènes représentant la cytotoxicité des cellules NK (Fig. 2a) a été observé à 2 dpi dans BAL, ce qui correspond à notre observation de cellules Granzyme B + NK élevées par cytométrie en flux (Fig. 1e). Prises ensemble, ces données démontrent la présence de cellules primaires capables de produire des IFN de type I (c'est-à-dire des pDC), coïncidant avec des transcrits et des protéines IFNA détectables, et avec des fonctions effectrices induites par l'IFN en aval (ISG, activation des cellules NK) après l'infection par le SAR-CoV-2, et que ces réponses étaient transitoires, ayant largement diminué de 10/11 dpi.

n = 8 RM de la Cohorte 1 et de la cohorte baricitinib pour −5 dpi et 2 dpi sauf pour (c) où n = 6 (3 RM Cohorte 1 + 3 RM cohorte baricitnib) à 2 dpi. n = 4 RM de la Cohorte 1 à partir de 4 dpi. a Diagrammes en points montrant les scores d'enrichissement normalisés et les valeurs nominales de p pour les ensembles de gènes. L'enrichissement est indiqué par la couleur du point (rouge : enrichi positivement vs -5 dpi ; bleu : enrichi négativement), la taille du point indique la signification. Les scores d'enrichissement normalisés et les valeurs nominales de p ont été déterminés à l'aide de GSEA65. Les valeurs nominales exactes de p sont incluses dans les données supplémentaires 1. b Carte thermique des réponses longitudinales pour l'ensemble de gènes ISG. L'échelle de couleurs indique l'expression log2 par rapport à la médiane des échantillons de -5 dpi. c Évaluation des cytokines (Mesoscale) dans les valeurs BALF p pour 2 dpi vs −5 dpi : IL6 = 0,02 et IP-10 = 0,03 et d Plasma ; seules les cytokines significatives sont représentées (valeurs p pour 2 dpi vs -5 dpi : IP-10 = 0,008, MCP-1 = 0,008, MCP-2 = 0,004). e Somme de l'expression normalisée de tous les gènes IFNA dans BAL. *valeur p = 0,04. f Graphique d'enrichissement GSEA montrant un enrichissement négatif pour la signature du gène AM (dérivée de SingleR) lors de la comparaison d'échantillons BAL RNA-Seq en vrac de 4 dpi à -5 dpi (valeur p nominale = 0). La barre rouge représente la moyenne. L'analyse statistique pour (c) – (e) a été effectuée à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon unilatéral dans R v4.2.2 comparant chaque point dans le temps à -5 dpi. *valeur p <0,05, **valeur p <0,01. Les données source (c–e) sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Nous avons observé que l'infection par le SRAS-CoV-2 induisait un enrichissement significatif de plusieurs voies de signalisation des cytokines inflammatoires, à savoir IFNA, IL4, IL6, IL10, IL12, IL23 et TNF, et les voies de chimiokines CXCR4 et CXCR3, à la fois dans les PBMC et le BAL des MR, avec une ampleur plus élevée dans le BAL (Fig. 2a et données supplémentaires 1–3). Pour bon nombre de ces voies, nous avons pu quantifier des augmentations significatives du régulateur en amont au niveau de la protéine ou de l'ARNm, ou des deux : les niveaux de protéine IL6 ont été significativement augmentés dans le liquide BAL (BALF) (Fig. 2c), tout comme les transcrits d'ARN dans BAL (Fig. 3b supplémentaire). De même, l'induction de la signalisation des voies CXCR3 était cohérente avec la détection d'une augmentation de la protéine IP10 / CXCL10 dans BALF et de l'ARN à 2 dpi dans BAL (Fig. 2c et Fig. 3b supplémentaire). L'apparition de voies inflammatoires dans le sang et les voies respiratoires a été rapportée dans une multitude d'études humaines (examinées dans la réf. 27). Cependant, nous avons noté que l'infection par le SARS-CoV-2 conduisait également à l'expression précoce de plusieurs voies immunorégulatrices/immunosuppressives dans le BAL, à savoir : la signalisation PD1 et CTLA4, et les régulateurs négatifs de la MAP kinase et de la signalisation DDX58/RIG-I (Fig. 2a). Auparavant, nous avions signalé que la fraction myéloïde du BAL était principalement responsable de la production de médiateurs pro-inflammatoires, mais les immunophénotypes spécifiques n'étaient pas définis. Pour étudier plus avant la présence de différents sous-ensembles de macrophages dans les voies respiratoires inférieures après une infection par le SRAS-CoV-2, nous avons effectué une GSEA sur des données BAL en vrac en utilisant la signature du gène AM (obtenue à partir de SingleR28) spécifique aux macrophages pulmonaires RM. Nous avons observé que les gènes spécifiques des macrophages alvéolaires (MA) étaient significativement enrichis au départ (−5 dpi) par rapport à 4 dpi, indiquant une régulation à la baisse de cet ensemble de gènes après l'infection par le SRAS-CoV-2 (Fig. 2f). Collectivement, ces données en vrac d'ARN-Seq indiquent un changement rapide et significatif de l'équilibre des populations de macrophages dans les voies respiratoires inférieures après une infection par le SRAS-CoV-2.

Dans nos travaux antérieurs sur les MR, nous avons démontré que les cellules d'origine myéloïde étaient le sous-ensemble prédominant responsable de la production de cytokines inflammatoires dans les voies respiratoires inférieures après une infection par le SRAS-CoV-220. Bien que nos analyses précédentes de scRNA-Seq aient déterminé que la majorité des cellules du BAL après infection étaient d'origine monocyte/macrophage, avec relativement peu de neutrophiles ou de granulocytes, les immunophénotypes précis des cellules myéloïdes responsables de l'inflammation dans les voies respiratoires inférieures n'ont pas été définis avec précision.

La classification cellulaire basée sur les gènes marqueurs de surface cellulaire est généralement problématique dans les données scRNA-Seq en raison des abandons de gènes inhérents à la technologie. Une classification précise est encore compliquée dans le système de modèle rhésus, dans lequel les références génomiques ont une annotation incomplète, et les marqueurs d'autres espèces modèles peuvent ne pas être phénocopies. Plusieurs progrès significatifs ont été réalisés récemment pour élucider les sous-ensembles de macrophages tissulaires résidents dans les poumons et leur fonction lors d'une infection virale et d'une inflammation29,30,31,32. Cependant, l'analyse des données scRNA-Seq des suspensions pulmonaires RM et du BAL à l'état d'équilibre a indiqué que plusieurs marqueurs clés utilisés pour différencier les macrophages dans le poumon murin (par exemple, Lyve1) n'étaient pas exprimés à des niveaux suffisants pour distinguer les populations dans les populations myéloïdes pulmonaires rhésus (Fig. 7 supplémentaire). Par conséquent, nous avons utilisé deux stratégies alternatives qui se chevauchent pour classer avec précision les macrophages tissulaires et les macrophages dérivés de monocytes/infiltrants dans les voies respiratoires RM après l'infection par le SRAS-CoV-2 dans nos données scRNA-Seq. La première stratégie était basée sur l'utilisation de données de scRNA-Seq pulmonaires existantes provenant de MR non infectés comme référence pour cartographier et annoter les cellules BAL. Nous avons traité les données pulmonaires 10X de trois MR non infectés (NCBI GEO : GSE149758)33 via le pipeline Seurat34 et reproduit les quatre sous-ensembles de macrophages/monocytes rapportés : CD163+MRC1+, ressemblant à des macrophages alvéolaires ; les macrophages CD163+MRC1+TREM2+, similaires aux monocytes infiltrants ; CD163+MRC1−, semblable aux macrophages interstitiels ; et les monocytes non classiques CD16 + (Fig. 4a – d supplémentaires). Nous avons utilisé Seurat pour cartographier les macrophages/monocytes BAL des RM infectés par le SRAS-CoV-2 et transférer les annotations de la référence pulmonaire. La deuxième stratégie consistait à utiliser l'ARN-Seq en vrac sur AM et IM triés des poumons de trois RM non infectés35, selon le phénotype défini par Cai et al.36, basé sur l'expression de CD206/MRC1 et CD163, pour annoter les cellules en utilisant SingleR28 Supplémentaire Fig. 4e, f). Au total, 2069 gènes se sont avérés exprimés de manière différentielle entre les IM et les AM (FDR <0, 05, changement de pli> 2) (Fig. 4e supplémentaire). Il convient de noter que CX3CR1 était régulé à la hausse dans les MI, conformément aux définitions murines et humaines de ce sous-ensemble (Fig. 4f supplémentaire). APOBEC3A, une cytidine désaminase éditant l'ARN, a également été régulée positivement dans les MI avec PTGS2, une enzyme cyclooxygénase COX-2 pro-inflammatoire, TIMP1, qui permet la migration des cellules via la dégradation du tissu conjonctif, VCAN, un régulateur immunosuppresseur et PDE4B, qui régule l'expression du TNFα (Fig. 4f supplémentaire). Nous avons annoté les sous-ensembles de macrophages pulmonaires / monocytes à l'aide des ensembles de données AM et IM triés en vrac et avons constaté que presque tous les clusters CD163 + MRC1 + et certaines cellules CD163 + MRC1 + TREM2 + étaient annotés comme AM et le reste comme IM (Fig. 4g supplémentaire). Ainsi, l'analyse comparative de notre référence basée sur le scRNA-Seq pulmonaire par rapport aux signatures transcriptomiques en vrac rudimentaires a démontré leur précision dans la résolution du phénotype AM du non-AM dans des conditions d'état d'équilibre.

Nous avons ensuite analysé les changements dans les populations myéloïdes au sein du BAL des MR après l'infection par le SRAS-CoV-2 en appliquant ces signatures à deux ensembles de données scRNA-Seq indépendants de macaques rhésus infectés par voie intranasale et intratrachéale avec 1,1 × 106 PFU de la souche USA-WA1/2020 de SARS-CoV-2 : Cohorte 1, composée d'un ensemble de données de n = 3 (ligne de base et 4 dpi)20 et Co hort 2, composé de n = 5 (ligne de base) et n = 6 (4 dpi)26. En utilisant la référence lung/scRNA-Seq, nous avons constaté que la plupart des macrophages/monocytes BAL appartenaient au sous-ensemble de macrophages CD163 + MRC1 + de type AM à -5 dpi, ainsi que certaines cellules du sous-ensemble de macrophages CD163 + MRC1 + TREM2 + (Fig. 3a, b et Fig. 5a supplémentaire). À 4 dpi, il y avait un afflux de macrophages CD163 + MRC1 + TREM2 + et de macrophages CD163 + MRC1− de type IM avec quelques cellules annotées en tant que monocytes non classiques CD16 +. L'expression de marqueurs géniques tels que MARCO, FABP4 et CHIT1 a également soutenu les annotations du sous-ensemble de cellules (Fig. 3c). Nous avons également observé une augmentation similaire d'APOBEC3A et une diminution de l'expression des gènes MARCO et CHIT1 associés aux macrophages alvéolaires dans des échantillons de BAL analysés par ARN-Seq en vrac, indiquant une perte de cellules CD163 + MRC1 + (Fig. 3d). En analysant les ensembles de données sc-RNA-Seq, le pourcentage total de macrophages CD163 + MRC1 + au départ par rapport à 4 dpi est passé de 93, 3% à 55% et de 89, 3% à 63, 1% de tous les macrophages / monocytes dans BAL dans les cohortes 1 et 2, respectivement (Fig. 3e, f). Les estimations des fréquences cellulaires dans les ensembles de données scRNA-Seq regroupés peuvent être déterminées par des comptages cellulaires déséquilibrés d'échantillons individuels. Pour tenir compte de ce biais potentiel, nous avons examiné les changements dans les populations myéloïdes par des animaux individuels. Nous avons observé que dans la cohorte 1, les cellules CD163 + MRC + ont diminué de la moyenne de 90, 2% (sd = 5, 2%) à la moyenne de 65, 4% (sd = 32%), p = ns, et dans la cohorte 2, elles ont diminué de manière significative de la moyenne de 92% (sd = 5, 1%) à la moyenne de 65, 7% (sd = 16, 4%) p = 0, 0087 (Fig. 3g, h). À l'inverse, nous avons constaté une augmentation globale du pourcentage de macrophages CD163 + MRC1 + TREM2 + de 6, 5 à 36, 8% (cohorte 1) et de 10, 3 à 19, 8% (cohorte 2) (Fig. 3e, f). Au niveau individuel, nous avons observé que les niveaux de cellules CD163 + MRC1 + TREM2 + ont augmenté de 9,7 % (sd = 5,3 %) à 28,6 % (sd = 25,2 %) dans la cohorte 1 (p = ns) et de 7,7 % (sd = 4,9 %) à 20,0 % (sd = 10,4 %) (p = 0,03) (Fig. 3g, h ). De plus, nous avons observé des augmentations des macrophages CD163 + MRC1− de type IM : dans les données groupées de scRNA-Seq de 0,2 à 8 % dans la cohorte 1 et de 0,4 à 17 % dans la cohorte 2 (Fig. 3e, f). En considérant les animaux individuellement, les cellules CD163 + MRC1− ont augmenté de 0,15 % (sd = 0,19 %) à 5,9 % (sd = 6,9 %) dans la cohorte 1 et significativement de 0,28 % (sd = 0,18 %) à 14,2 % (sd = 9,1 %) (p = 0,004) (Fig. 3g, h). Ainsi, l'infection par le SRAS-CoV-2 a entraîné un afflux de macrophages dérivés de monocytes et de type IM dans le BAL à 4 dpi.

a Projection de macrophages/monocytes unicellulaires à partir d'échantillons 10X BAL de -5 dpi (vert) et 4 dpi (magenta) obtenus à partir de trois macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 (cohorte 1) sur l'UMAP de référence de macrophages/monocytes pulmonaires de macaques rhésus non infectés (NCBI GEO : GSE14975833). b Projections UMAP montrant les annotations de type cellulaire prédites sur la base de la référence pulmonaire non infectée divisée par heure de prélèvement de l'échantillon (cohorte 1). c DotPlots montrant l'expression de gènes marqueurs pour les différents sous-ensembles de macrophages/monocytes dans des échantillons de BAL infectés par le SRAS-CoV-2 (cohorte 1). d Changements de pli Log2 par rapport à -5 dpi pour APOBEC3A, CHIT1 et MARCO dans les données BAL RNA-Seq en vrac (cohorte 1). La signification a été déterminée à l'aide de DESeq2. Les valeurs de p corrigées par la méthode Benjamini et Hochberg par défaut ont été utilisées *valeur de p adj <0,05, ***valeur de p adj <0,001. Les valeurs exactes de p sont incluses dans les données supplémentaires 2. Pourcentage d'un sous-ensemble donné parmi tous les sous-ensembles de macrophages/monocytes à -5 dpi et 4 dpi des trois animaux regroupés (cohorte 1) (e) et à -7 dpi et 4 dpi des six animaux regroupés (cohorte 2) (f). Pourcentage d'un sous-ensemble donné sur tous les sous-ensembles de macrophages/monocytes pour chaque animal à -5 dpi et 4 dpi de la cohorte 1 (n = 3) (g) et à -7 dpi (n = 5) et 4 dpi (n = 6) pour la cohorte 2 (h). Les lignes noires indiquent la médiane. Valeurs de p pour la cohorte 2 (f) pour 4 dpi vs −7 dpi : CD163+MRC1+ = 0,009, CD163+MRC1+TREM2+ = 0,03 et CD163+MRC1− = 0,004. Contribution de chaque sous-ensemble de macrophages/monocytes à la production des gènes pro-inflammatoires et de l'ISG - Cohorte 1 regroupée (i), Cohorte 2 regroupée (j), Cohorte 1 individuelle (k) et Cohorte 2 individuelle (l). p valeurs pour (l) : * = 0,03. La contribution en pourcentage a été calculée en divisant la somme de l'expression normalisée d'un gène donné dans un sous-ensemble de macrophages/monocytes par la somme de l'expression normalisée du gène dans tous les sous-ensembles de macrophages/monocytes. a–c, e, g, i, k Cohorte 1 : n = 3 pour −5 dpi et 4 dpi, d Cohorte 1 : n = 8 pour 2 dpi et n = 4 pour 4 dpi, f, h, j, l Cohorte 2 : n = 5 pour −7 dpi et n = 6 pour 4 dpi. Les lignes noires indiquent la médiane. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test de rang Wilcoxon bilatéral pour (g, k, l) et du test U bilatéral de Mann – Whitney pour (h) dans R v4.2.2. *valeur p <0,05, **valeur p <0,01. Les données source (d–l) sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Pour valider davantage notre classification cellulaire et étayer l'observation selon laquelle ce sont les cellules infiltrantes qui augmentent en nombre et produisent principalement des médiateurs inflammatoires, nous avons utilisé la deuxième stratégie consistant à utiliser l'expression génique de cellules AM et IM triées en vrac pour classer les macrophages/monocytes BAL. En utilisant cette définition, nous avons confirmé qu'il y a une augmentation du pourcentage de la population non AM avec une diminution correspondante de la population AM (Fig. 5b, d supplémentaires). Il a également été constaté que la population non AM présentait une expression plus élevée de cytokines pro-inflammatoires (Fig. 5e supplémentaire).

L'analyse de l'expression différentielle des macrophages / monocytes BAL à 4 dpi et -5 dpi a montré que CHIT1, MARCO et MRC1 figuraient parmi les gènes de premier plan présentant une régulation négative dans le BAL, tandis que des gènes tels que ADAMDEC137 et S100A838 associés aux macrophages dérivés de monocytes étaient parmi les plus régulés à la hausse (données supplémentaires 4). Ces données démontrent que notre observation d'un afflux de macrophages infiltrants dans le BAL à 4 dpi était cohérente à travers plusieurs définitions de ce phénotype.

Compte tenu de notre observation de la dynamique des macrophages pulmonaires dans l'espace alvéolaire au cours de l'infection précoce par le SRAS-CoV-2, nous avons caractérisé les changements transcriptionnels dans chaque population de macrophages/monocytes (Fig. 3), ainsi que dans les cellules dendritiques myéloïdes conventionnelles. Les CD myéloïdes étaient présentes à des fréquences très basses (<2%), et pas plus de 70 cellules au total ont été détectées comme hébergeant l'ARNm du TNF, de l'IL6 ou de l'IL10 après l'infection. L'expression de l'IL1B était légèrement plus élevée, mais représentait <2, 5% des cellules exprimant l'IL1B dans le BAL à 4 dpi (Fig. 6a – e supplémentaire). Plusieurs chimiokines (CCL4L1, CCL3, CXCL3, CCL2), plusieurs ISG, NFKB1A, S100A8 et GZMB figuraient parmi les gènes les plus régulés positivement à 4 dpi dans les populations BAL (données supplémentaires 4). Une expression élevée de plusieurs gènes inflammatoires, notamment IL6, TNF, IL10 et IL1B, a été observée dans les sous-ensembles CD163 + MRC1 + TREM2 Mac et CD163 + MRC1− dans les cohortes 1 et 2 (Fig. 3i – l et Fig. 7 supplémentaire) après l'infection. Il a également été observé que les macrophages infiltrants régulaient à la hausse plusieurs chimiokines, y compris celles spécifiques au recrutement des neutrophiles (CXCL3, CXCL8), des macrophages (CCL2, CCL3, CCL5, CCL4L1) et des lymphocytes T activés (CXCL10) ainsi que plusieurs ISG (Figs. 7 et 8 supplémentaires). Lorsque nous avons examiné les macrophages CD163 + MRC1 +, bon nombre des mêmes cytokines inflammatoires et ensembles de gènes observés dans les macrophages infiltrants étaient élevés à 4 dpi, bien qu'à une ampleur beaucoup plus faible (Figs. 7 et 8 supplémentaires). Ayant observé une expression moyenne significativement plus élevée des cytokines inflammatoires dans les macrophages infiltrants par rapport aux macrophages CD163 + MRC1 +, nous avons comparé les fractions de lectures de séquençage détectées dans chacun des sous-ensembles pour évaluer la contribution globale à la production de cytokines inflammatoires (Fig. 3i). Dans la cohorte 1, à 4 dpi, nous avons observé que les macrophages CD163 + MRC1 + TREM2 + représentaient 55% de l'IL6, 57% du TNF et 86% de l'expression de l'IL10 tandis que les macrophages CD163 + MRC1− représentaient 20% de l'IL6, 21% du TNF et 6% de l'expression de l'IL10 (Fig. 3i). Dans la Cohorte 2, nous avons également observé que les macrophages infiltrants contribuaient davantage à l'expression de la plupart des cytokines inflammatoires que les macrophages alvéolaires : l'expression dans les cellules CD163+MRC1+TREM2+ et CD163+MRC1− était de 39,2% et 47% pour l'IL10, 17,4% et 74,9% pour l'IL6, et 22,4% et 46,6% pour le TNF, respectivement (Fig. 3j). Pour tenir compte du biais potentiel dans le nombre de cellules dans nos données regroupées, nous avons également examiné les contributions des cytokines à l'expression de BAL chez des animaux individuels (Fig. 3k, l). Dans la cohorte 1, la tendance globale à une contribution plus élevée à l'expression inflammatoire dans les populations de macrophages infiltrants observée dans les données regroupées n'a été observée que pour IL10 et CCL4L1, en grande partie en raison de déséquilibres dans le nombre de cellules et d'une faible puissance statistique (Fig. 3k). Cependant, dans la cohorte 2, nous avons observé des niveaux constamment élevés dans les populations de macrophages infiltrants CD163 + MRC1 + TREM2 + et CD163 + MRC1− (Fig. 3l). Pour l'IL10, l'expression moyenne ± sd dans CD163 + MRC1 + était de 17, 3 ± 12, 4%, contre 40, 4 ± 12, 1% dans les cellules CD163 + MRC1 + TREM2 + (p = 0, 03) et 42, 3 ± 21, 2% pour CD163 + MRC1 - (ns) (Fig. 3l). Pour IL6, l'expression moyenne ± sd dans CD163+MRC1+ était de 9,4 ± 12,2 %, contre 12,2 ± 24,5 % dans les cellules CD163+MRC1+TREM2+ (ns) et 78,4 ± 28,8 % pour CD163+MRC1− (p = 0,065). De plus, alors que notre observation pour IL6 avait tendance à être significative, nous avons trouvé une grande variabilité dans les pourcentages de cellules CD163 + MRC1- ; pour résoudre ce problème, nous avons analysé un autre ensemble de données26 dans lequel nous avons obtenu l'expression de scRNA-Seq du macrophage BAL après 2 dpi d'infection par le SRAS-CoV-2 - ces données ont également tendance à une expression beaucoup plus élevée d'IL6 dans les cellules CD163 + MRC1− (67, 1 ± 32, 4%) par rapport aux macrophages CD163 + MRC1 + (27, 7 ± 29, 5%) (Fig. 9 supplémentaire). Pour CCL4L1, CD163+MRC1+ a contribué à 9,6 ± 6,3 % de l'expression, contre 23,7 ± 13,5 % dans les cellules CD163+MRC1+TREM2+ (p = 0,03) et 66,7 ± 18,2 % dans les cellules CD163+MRC1− (p = 0,03). La contribution des différents sous-ensembles à l'expression de CXCL10 était de 19,2 ± 16,7 % pour CD163+MRC1+, contre 15,3 ± 9,3 % pour les populations CD163+MRC1+TREM2+ et 65,4 ± 15,2 % pour les populations CD163+MRC1−. Dans l'ensemble, ces données indiquent que les populations de macrophages infiltrant sont responsables de la majorité de la production de cytokines inflammatoires des voies respiratoires inférieures lors d'une infection aiguë par le SRAS-CoV-2.

Pour valider l'augmentation des populations myéloïdes infiltrantes, nous avons quantifié par cytométrie en flux la fréquence des populations myéloïdes CCR2 + dans le sang périphérique et le BAL de six autres macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 (Fig. 10 supplémentaire). Il a été démontré que le CCR2 régule l'infiltration des monocytes dans le parenchyme pulmonaire des souris infectées par le SRAS-CoV-239 et son expression est régulée à la hausse dans le BAL des macrophages infiltrants chez les PNH infectés par le virus de la grippe35. Conformément à notre observation de cellules myéloïdes infiltrantes élevées par scRNA-Seq, nous avons constaté qu'il y avait une augmentation concomitante de la fréquence des monocytes CCR2 + CD14-CD16 + et CD14 + CD16 + à 2 dpi. Ces résultats soutiennent davantage l'infiltration de monocytes inflammatoires dans le BAL après une infection par le SRAS-CoV-2.

Pour traduire nos découvertes dans le modèle NHP à l'infection humaine par le SRAS-CoV-2, nous avons utilisé une approche bioinformatique similaire à celle utilisée pour définir le myéloïde rhésus. Nous avons utilisé des macrophages/monocytes à partir d'un ensemble de données scRNA-Seq de poumons de six donneurs humains en bonne santé (GEO : GSE13589340) et les avons classés sur la base d'une classification récente en FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi et les macrophages proliférants41 (Fig. 4a). Lorsque les gènes marqueurs canoniques ont été comparés entre les macrophages / monocytes pulmonaires sains de l'homme et du macaque rhésus, nous avons constaté qu'il existait des populations comparables entre les deux (Fig. 4a – c). À savoir, le sous-ensemble rhésus CD163 + MRC1 + était très similaire au sous-ensemble humain FABP4hi; le sous-ensemble CD163+MRC1+TREM2+ rhésus était congruent avec le sous-ensemble humain SPP1hi ; et les macrophages CD163 + MRC1− et les monocytes CD16 + rhésus étaient transcriptionnellement similaires au sous-ensemble humain FCN1hi. Ensuite, nous avons combiné les données de toutes les cellules macrophages / monocytes des six échantillons humains sains avec les trois échantillons de rhésus sains et appliqué l'intégration basée sur la référence dans Seurat en utilisant les échantillons humains comme référence (Fig. 11a, b supplémentaires). Nous avons examiné la distribution de différents types de cellules humaines et rhésus dans chaque groupe et avons constaté que les observations antérieures concernant la similitude des sous-ensembles basés sur des marqueurs canoniques étaient en outre étayées par l'expression génique globale de ces cellules (Fig. 11c supplémentaire). Enfin, pour tester la robustesse de nos classifications cellulaires pour identifier avec précision les sous-ensembles de macrophages entre les espèces, nous avons généré des signatures génétiques pour chaque combinaison sous-ensemble/espèce et testé l'enrichissement dans les espèces opposées ; pour toutes les comparaisons, une signature a obtenu le score le plus élevé avec son sous-ensemble opposé correspondant (Fig. 11d supplémentaire).

une UMAP de sous-ensembles de macrophages dans les poumons de six donneurs humains sains (GEO : GSE135893). b UMAP de sous-ensembles de macrophages dans les poumons de trois macaques rhésus sains (GEO : GSE149758). c DotPlots montrant l'expression de gènes marqueurs. Le dégradé de couleur représente le niveau d'expression et la taille du point représente le pourcentage de cellules exprimant un gène donné. d UMAP d'échantillons de BAL provenant de donneurs humains en bonne santé (n = 3) ou souffrant de COVID-19 modéré (n = 3) ou sévère (n = 6) (GEO : GSE145926) cartographié à la référence pulmonaire saine à l'aide de la fonction Seurat MapQuery. e Pourcentage de types de cellules prédits sur tous les macrophages/monocytes dans chaque échantillon de BAL humain. La barre noire indique la médiane. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test Mann-Whitney U bilatéral par paires dans R v4.2.2. valeur p * = 0,02. Contribution de chacun des sous-ensembles de macrophages / monocytes prédits dans le BAL humain à la production des gènes pro-inflammatoires et de l'ISG - regroupés (f) et individuels (g). La contribution en pourcentage a été calculée en divisant la somme de l'expression normalisée d'un gène donné dans un sous-ensemble de macrophages/monocytes par la somme de l'expression normalisée du gène dans tous les sous-ensembles de macrophages/monocytes. Les barres noires représentent la médiane. L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du test de rang signé Wilcoxon bilatéral dans R v4.2.2. *valeur p 0,03 pour tous sauf FABP4 vs proliférant pour IL6, IL1B, TNF, CXCL3, CXCL8 et SPP1hi vs proliférant pour CCR2 : valeur p = 0,04. Les données source (e–g) sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

En utilisant l'ensemble de données humaines en bonne santé comme référence, nous avons classé les macrophages / monocytes du cluster myéloïde (Fig. 11e, f supplémentaires) dans un ensemble de données scRNA-Seq accessible au public d'échantillons de BAL humains provenant de donneurs sains ou de sujets atteints d'une infection COVID-19 modérée ou sévère8 (Fig. 4d et Fig. 11g supplémentaire). Comme indiqué dans l'étude originale8, nous avons constaté qu'il y avait une augmentation significative des sous-ensembles SPP1hi et FCN1hi avec une infection au COVID-19, tandis que la population FABP4hi, largement représentative des macrophages alvéolaires résidents, s'est avérée significativement réduite dans les cas d'infection au COVID-19 modérée et sévère (Fig. 4d, e). De plus, nous avons également examiné la contribution de ces différentes populations à l'inflammation et avons constaté que les sous-ensembles SPP1hi et FCN1hi non résidents étaient largement responsables de l'expression de médiateurs pro-inflammatoires chez les patients atteints de COVID-19 sévère (Fig. 4f et Fig. 12 supplémentaire). Respectivement, (FABP4hi, SPP1hi et FCN1hi) la contribution de chaque population à l'expression globale était : IL10 (1,3 %, 56,7 %, 42 %), IL1B (6,6 %, 37 %, 56 %), IL6 (2,4 %, 40,8 %, 56,7 %), TNF (1,6 %, 44,1 %, 54,1 %), CXCL10 (1. 8 %, 36,5 %, 61,7 %) et CXCL8 (2,6 %, 48,1 %, 49,1 %) (Fig. 4f). Il convient de noter que l'expression de l'ISG (IFI27, ISG15, ISG20, MX2) était significativement régulée positivement dans les populations SPP1hi et FCN1hi par rapport à la FABP4hi dans les cas graves mais pas dans les cas modérés. Enfin, lorsque nous avons examiné la contribution de l'expression des cytokines par des patients individuels dans cet ensemble de données, nous avons noté que pour le COVID-19 sévère, nous avons observé que les populations infiltrantes avaient une expression significativement plus élevée d'IL10 (moyenne ± sd SPP1hi 50,9 ± 8,7 %, p = 0,03 ; FCN1hi 46,9 ± 8,3 %, p = 0,03), IL1B (moyenne ± sd SPP1hi 31. 7 ± 14,9 %, p = 0,03 ; FCN1hi 63,3 ± 20,1 %, p = 0,03), TNF (moyenne ± sd SPP1hi 43,4 ± 9,3 %, p = 0,03 ; FCN1hi 53,7 ± 13,7 %, p = 0,03), CXCL10 (moyenne ± sd SPP1hi 27,3 ± 9,5 %, p = 0,03 ; FCN1hi 69,8 ± 11,1 %, p = 0,03), CXCL3 (moyenne ± sd SPP1hi 55,9 ± 9,6 %, p = 0,03 ; FCN1hi 37,6 ± 13 %, p = 0,06) et CXCL8 (moyenne ± sd SPP1hi 42,7 ± 14 %, p = 0,03 ; FCN1hi 53,4 ± 17,4 %, p = 0,03) par rapport à la population FABP4hi (moyenne ± écart type pour IL10 2,2 ± 2,8 %, IL1B 4,7 ± 8,2 %, TNF 2,7 ± 4,5 %, CXCL10 2,6 ± 2,9 %, CXCL3 6,4 ± 9,5 % et CXCL8 3,8 ± 5,9 %) (figure 4g). Collectivement, ces analyses démontrent que les sous-ensembles myéloïdes définis de manière transcriptionnelle dans les MR ont des populations analogues dans le poumon humain, et une concordance globale dans leur expansion et leur contribution à l'inflammation induite par le SRAS-CoV-2 dans les voies respiratoires inférieures.

Le baricitinib est un inhibiteur de JAK1/2 approuvé pour le traitement de la polyarthrite rhumatoïde active qui a été récemment approuvé par la FDA pour le traitement du COVID-19 chez certains adultes hospitalisés42, et dont il a été rapporté qu'il réduit la mortalité lorsqu'il est administré en monothérapie43 ou en association avec le remdesivir25. Dans notre étude précédente, en utilisant les données de la cohorte 1 et des animaux traités au baricitinib (Fig. 1a), nous avons constaté que le baricitinib était capable de supprimer l'expression des cytokines pro-inflammatoires dans le BAL des MR infectés par le SRAS-CoV-220. Ici, nous avons étendu cette étude pour caractériser davantage l'impact du baricitinib sur les populations myéloïdes dans les voies respiratoires de cinq MR avant l'infection (−5 dpi) et à 4 dpi, avec trois MR qui sont restés non traités et deux qui ont reçu du baricitinib. Nous avons constaté que 2 jours d'administration de baricitinib supprimaient pratiquement l'afflux de macrophages infiltrants dans l'espace alvéolaire à 4 dpi, car nous n'avons détecté aucune augmentation des populations de CD163 + MRC1 - ou de CD163 + MRC1 + TREM2 + chez les animaux traités au baricitinib (Fig. 5a – d). Cette observation était cohérente en utilisant les classifications des macrophages soit sur la base de la cartographie à la référence pulmonaire 10X, soit sur l'utilisation de cellules AM / IM triées en vrac (Fig. 5a – d et Supplémentaire Fig. 5a – d). En plus d'empêcher l'afflux de macrophages infiltrants, le traitement au baricitinib a également entraîné une expression significativement plus faible des cytokines et des chimiokines inflammatoires, mais l'expression de l'ISG est restée comparable à celle des animaux non traités (Fig. 5e – g et Supplémentaire Fig. 5e). En résumé, ces données élucident davantage le mécanisme d'action par lequel le traitement au baricitinib supprime l'inflammation des voies respiratoires dans l'infection par le SRAS-CoV-220, en démontrant sa capacité à bloquer l'infiltration de populations discrètes de macrophages pro-inflammatoires dans le compartiment alvéolaire. Semblable à nos observations utilisant la cytométrie en flux, il y a eu une augmentation de l'abondance de pDC à 4 dpi dans le BAL détecté par les données scRNA-Seq, mais cette augmentation a été abrogée chez les animaux traités au baricitinib (Fig. 5h, i).

a Projection de macrophages/monocytes à partir d'échantillons BAL 10X à -5 dpi et 4 dpi provenant de trois macaques rhésus non traités et de deux macaques rhésus traités au baricitinib sur l'UMAP de référence des macrophages/monocytes pulmonaires non infectés (NCBI GEO : GSE149758). b UMAP divisé par traitement et point de temps montrant les annotations cellulaires prédites basées sur la cartographie des macrophages/monocytes pulmonaires de référence. Pourcentage d'un sous-ensemble de macrophages/monocytes donné de tous les macrophages/monocytes dans les échantillons BAL - regroupés (c) et individuels (d). Graphiques de violon montrant l'expression de cytokines pro-inflammatoires (e), de chimiokines (f) et d'ISG (g) dans les différents sous-ensembles de macrophages/monocytes dans des échantillons BAL 10X provenant d'échantillons traités et non traités au baricitinib. h Nombre absolu de pDC dans les échantillons BAL de scRNA-Seq et i Pourcentage de pDC sur toutes les cellules dans les échantillons BAL de scRNA-Seq. Les données source (c, d, h, i) sont fournies sous la forme d'un fichier de données source.

Les mécanismes par lesquels l'infection par le SRAS-CoV-2 établit une maladie grave restent largement inconnus, mais restent une priorité essentielle pour réduire le bilan de la pandémie de COVID-19. Comme l'apparition des symptômes varie de 2 à 14 jours après l'infection par le SRAS-CoV-2, la caractérisation des événements immunologiques précoces à l'aide d'échantillons cliniques est difficile. Ici, nous avons utilisé le modèle RM de l'infection par le SRAS-CoV-2 et une analyse des systèmes intégrés pour disséquer la réponse immunitaire lors d'une infection hyperaiguë. Nos résultats étaient les suivants : (1) l'infection par le SRAS-CoV-2 a déclenché une réponse IFN de type I robuste dans le sang et les voies respiratoires inférieures apparente à 1-2 dpi ; (2) le SRAS-CoV-2 a induit un afflux rapide de deux populations de macrophages infiltrants, dans l'espace bronchoalvéolaire, qui ont produit la majorité de la production de cytokines inflammatoires ; et (3) le mécanisme d'action du baricitinib, un médicament récemment autorisé par la FDA pour une utilisation dans le traitement du COVID-19 pour certains adultes hospitalisés42, est d'abroger l'infiltration de ces cellules inflammatoires dans les voies respiratoires. Nos données présentent, à ce jour, l'analyse la plus complète des événements immunopathologiques survenant lors d'une infection hyperaiguë par le SARS-CoV-2.

À l'aide de nos ensembles de données de référence sur les macrophages pulmonaires RM, nous avons identifié deux sous-ensembles de cellules myéloïdes, tous deux clairement distincts des macrophages alvéolaires, infiltrant les voies respiratoires après une infection par le SRAS-CoV-2, qui étaient les principaux producteurs de cytokines et de chimiokines inflammatoires des voies respiratoires inférieures. Une population, définie comme les cellules CD163 + MRC1 + TREM2 +, était très similaire aux définitions murines des monocytes CCR2 + infiltrants. Le second, CD163+MRC1−, ressemblait largement aux macrophages interstitiels. Nos données sont cohérentes avec une observation récente d'une augmentation rapide (3 dpi) des MI dans le BAL des MR en utilisant la cytométrie en flux21. De même, une accumulation de non-MA (définis comme CD16 + CD206-HLA-DR + / CD11b +) et une réduction réciproque des MA ont été observées dans le BAL et les poumons des MR et AGM infectés23. Nous avons constaté que ces sous-ensembles myéloïdes, définis de manière transcriptionnelle dans les PSN, avaient des populations analogues dans le poumon humain. Enfin, nos données sont cohérentes avec nos découvertes récentes dans le modèle murin, dans lequel le SRAS-CoV-2 a provoqué le recrutement de monocytes circulants dans le parenchyme pulmonaire, mais a été significativement abrogé chez les souris déficientes en CCR239. Le sous-ensemble de type CD163 + MRC1 + Mac / AM a également contribué au milieu inflammatoire, produisant de l'IL6, du TNF et de l'IL10, bien qu'en quantités significativement plus faibles.

Il est important de noter que nos observations ont eu lieu lors d'une infection hyperaiguë et que nos animaux n'ont pas développé de maladie grave, donc bien que nos données indiquent que ces populations infiltrantes orchestrent une inflammation précoce et peuvent contribuer à la pathogenèse des voies respiratoires, nous ne pouvons pas formellement établir ce lien. Cependant, ce modèle est cohérent avec les données récentes de Ren et al.44, qui ont observé une perte significative d'expression de MARCO dans les populations myéloïdes résidentes de BAL de patients atteints de COVID-19 sévère par rapport à ceux atteints d'une maladie modérée, similaire à nos observations, dans lesquelles l'apparition de macrophages infiltrants a dilué la population de macrophages MARCO+. Ces observations, combinées à nos données, suggèrent que le phénotype de macrophage inflammatoire que nous identifions ici peut être préférentiellement retenu dans les voies respiratoires inférieures des patients atteints de COVID-19 sévère. De plus, nous avons démontré qu'un traitement in vivo avec le baricitinib, un inhibiteur de JAK1/2, qui a démontré son efficacité dans la réduction des maladies graves, était capable d'abroger pratiquement le recrutement de ces macrophages inflammatoires dans les voies respiratoires, fournissant un lien mécaniste supplémentaire avec le développement de la pathogenèse liée au COVID-19.

En plus des cytokines inflammatoires, nous avons observé que les sous-ensembles de macrophages infiltrants produisaient des niveaux élevés d'IL10 et étaient enrichis en voies de signalisation IL10. Les MI pulmonaires sont considérées comme une "cellule professionnelle productrice d'IL10" produisant de l'IL10 à la fois à l'état d'équilibre et en réponse à des stimuli innés (LPS, CpG non méthylés)45. La majorité des données à ce jour ont démontré un rôle immunorégulateur et protecteur des MI dans des modèles murins d'asthme, de fibrose pulmonaire et d'inflammation induite par des allergènes30. Cependant, alors que le potentiel pro-inflammatoire des MI a été relativement peu étudié, il a été démontré qu'ils sont efficaces pour produire de l'IL6 et du TNF en réponse aux ligands du TLR46. Compte tenu de nos observations de production élevée d'IL10 dans les macrophages infiltrants, nous ne pouvons pas exclure un rôle immunorégulateur potentiel pour ce sous-ensemble, et en effet, il présente une hypothèse intéressante dans laquelle l'équilibre des macrophages infiltrants IM vs TREM2+ dans l'espace bronchoalvéolaire détermine le résultat pathogène de l'infection par le SRAS-CoV-2. Enfin, des publications récentes ont rapporté que les MI pulmonaires pouvaient être composées de deux, voire trois populations fonctionnellement distinctes, définies par un axe d'expression de Lyve1, MHC, CD169 et CD11c29,30,31,32. Nous n'avons pas observé de regroupement séparé parmi les IM BAL, ni d'expression différentielle entre ces marqueurs, et des travaux supplémentaires sont nécessaires pour comprendre la congruence des sous-ensembles de macrophages macaques avec ceux identifiés dans le modèle murin.

Nous avons observé une induction très rapide et robuste de la voie IFN de type I à 1–2 dpi, caractérisée par des pDC élevés dans les voies respiratoires et le sang, des transcrits et des protéines IFNA et IFNB, des ISG régulés positivement et une augmentation du granzyme B dans les cellules NK. La réponse IFN de type I dans l'infection SARS-COV-2 a été intensément étudiée: une infection in vitro des cellules épithéliales des voies respiratoires a systématiquement entraîné une incidence ISG en sourdine, et les patients développant une Covid-19 sévère ont été plus élevés de mutations dans les gènes de réponse IFN, ou des niveaux élevés d'auto-bodys contre les gènes IFN-52,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5,5. 3,54,55). Nos données, dans lesquelles la réponse IFN a culminé à 2 dpi et s'étaient largement atténuées à 10/11 dpi, fournissent une cinétique bien définie de la réponse ISG, et des observations similaires ont été rapportées dans d'autres études sur le NHP21,22. La nature rapide et de courte durée de la réponse IFN souligne la difficulté d'interpréter la réponse IFN dans les échantillons cliniques.

Nos analyses multiparamétriques ont démontré une augmentation des pDC à 2 dpi qui coïncidait avec le pic de production d'ISG, la détection IFNA/B et l'activation des cellules NK, impliquant ainsi les pDC comme la cellule primaire orchestrant la réponse IFN dans les voies respiratoires inférieures. Nous avions précédemment observé une réduction des fréquences et de l'activité des pDC du sang périphérique dans l'infection par le SRAS-CoV-2 humain56, et d'autres ont signalé des signatures d'apoptose des pDC qui prédisaient des réponses IFN-I plus faibles57. Pris dans le contexte de ces résultats cliniques, notre observation de l'accumulation de pDC dans le BAL indique qu'ils subissent une mobilisation rapide du sang vers les voies respiratoires inférieures, ce qui suggère qu'ils entraînent probablement des réponses immunitaires innées protectrices précoces. Cependant, les pDC peuvent également contribuer à l'inflammation pathologique ; et de futures études interventionnelles ciblant l'axe pDC/IFN dans des modèles animaux seront nécessaires pour tester ces hypothèses.

Dans notre étude précédente, nous avons démontré la capacité du baricitinib à bloquer la production de cytokines pro-inflammatoires des voies respiratoires dans les MR infectés par le SRAS-CoV-2 tout en préservant les réponses IFN de type I20. L'efficacité du baricitinib pour traiter le COVID-19 sévère a récemment été testée dans deux essais cliniques de phase 3 (ACTT-2 et COV-BARRIER) et a récemment été approuvée en tant que monothérapie pour traiter le COVID-19 chez les patients nécessitant de l'oxygène supplémentaire ou une ventilation mécanique42. À ce jour, près d'un million de patients ont reçu du baricitinib pour traiter la forme grave de la COVID-19, ce qui souligne l'importance de comprendre son mécanisme d'action. Ici, nous avons étendu nos découvertes originales pour démontrer que le baricitinib bloquait l'afflux de macrophages inflammatoires dans l'espace bronchoalvéolaire. Ces données s'ajoutent à notre compréhension mécaniste de l'action du baricitinib et fournissent une explication potentielle de la disparité de l'impact du baricitinib sur la signalisation IFN par rapport à IL6/TNF lorsque l'on considère le moment de l'administration du médicament. Nous avons administré le baricitinib à 2 dpi, après le pic d'afflux de pDC, mais avant l'apparition probable des macrophages inflammatoires à 3-4 dpi. La réponse ISG en cours et la réponse TNF/IL6 supprimée suggèrent que le principal mécanisme par lequel le baricitinib protège les voies respiratoires consiste à bloquer le recrutement de cellules inflammatoires dans l'espace bronchoalvéolaire. Il convient de noter qu'en présence de baricitinib et d'élimination concomitante des monocytes/macrophages infiltrants, la charge virale dans le BAL était inchangée par rapport aux témoins, ce qui suggère que ces populations exercent un contrôle minimal des niveaux de virus. Cependant, comme le modèle rhésus du SRAS-CoV-2 a tendance à être compatible avec le COVID-19 léger dans la majorité des études, il sera essentiel d'examiner le mécanisme du baricitinib dans un modèle de maladie grave. En ce qui concerne l'orientation des futures applications cliniques du baricitinib, nos données suggèrent que le moment est critique et favoriserait une administration précoce du médicament. De plus, étant donné l'omniprésence du SRAS-CoV-2 et la capacité croissante de réinfection, de futures études sur l'application du baricitinib pour le traitement des infections secondaires seraient bénéfiques.

Notre étude avait quelques limitations; Premièrement, alors que le modèle RM/SARS-CoV-2 a été rapidement adopté par plusieurs groupes pour les tests précliniques de médicaments et de vaccins anti-COVID, aucun groupe n'a démontré une maladie symptomatique manifeste et reproductible11. Ainsi, lier les événements immunologiques précoces au développement de COVID-19 sévère nécessite une validation dans des études humaines, telles que les observations de l'expression réduite de MARCO dans les populations myéloïdes des voies respiratoires des patients atteints de COVID-19 sévère notées ci-dessus44. De plus, pour estimer la contribution globale à la production de cytokines inflammatoires dans les macrophages, nous avons calculé la fraction de lectures de séquençage pour un transcrit d'ARNm donné attribué à un sous-ensemble, mais nous n'avons pas mesuré les quantités de protéines au niveau d'une seule cellule et nous nous sommes plutôt limités à évaluer les niveaux globaux dans BALF. Des études antérieures ont tenté d'estimer la corrélation entre l'ARNm des cytokines et les niveaux de protéines sécrétées et ont rapporté une bonne concordance pour le TNF, l'IL6, la CXCL10 et la CXCL8, mais une moins bonne concordance pour l'IL10 et l'IL1B58. Un autre inconvénient était la puissance relativement faible de notre étude. Alors que nos observations à 0, 1 et 2 dpi étaient n = 8, nous étions limités à n = 4 pour les observations des jours 4 à 10. Pour notre expérience scRNA-Seq, nous avons abordé les problèmes de puissance en menant notre analyse sur deux cohortes indépendantes pour un total de neuf animaux. Dans l'ensemble, la puissance statistique de nos principales observations ne manquait pas.

Alors que le déploiement mondial du vaccin a fait de grands progrès pour réduire la transmission et la gravité de l'infection par le SRAS-CoV-2, des millions de personnes restent vulnérables. Comprendre les événements précoces de l'infection par le SRAS-CoV-2 et les mécanismes par lesquels les médicaments cliniquement approuvés offrent une protection reste une priorité mondiale. Dans cette étude, nous avons identifié deux populations de cellules myéloïdes inflammatoires qui sont responsables de la prépondérance de l'inflammation des voies respiratoires dans l'infection aiguë par le SRAS-CoV-2. Nous avons également démontré que le traitement au baricitinib, recommandé par l'Organisation mondiale de la santé pour le traitement du COVID-19 sévère en janvier 2022, bloquait l'infiltration de ces cellules inflammatoires dans l'espace alvéolaire. Ces données identifient à la fois une cible médicamenteuse clé (macrophages infiltrant les voies respiratoires) et un mécanisme efficace par lequel réduire l'inflammation des voies respiratoires, et devraient s'avérer utiles pour identifier des médicaments supplémentaires pour réduire l'incidence et la mortalité de la maladie COVID-19 sévère.

Les installations de soins aux animaux de l'ENPRC sont accréditées par l'Association pour l'évaluation et l'accréditation des soins aux animaux de laboratoire (AAALAC) ainsi que par le Département américain de l'agriculture (USDA). Le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Université Emory (IACUC) a examiné et approuvé toutes les expérimentations animales sous le permis PROTO202000035. Toutes les procédures ont été effectuées conformément aux réglementations et directives institutionnelles énoncées par le Guide des NIH pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire (8e édition) et ont été menées sous anesthésie et suivi approprié de la gestion de la douleur afin de minimiser la souffrance des animaux. Huit (4 femelles, 4 mâles, âgés de plus de 11 ans) macaques rhésus d'origine indienne exempts d'agents pathogènes spécifiques ont été infectés par voie intranasale et intratrachéale avec 1,1 × 106 unités formant plaque (PFU) SARS-CoV-2 comme décrit précédemment20 et ont été maintenus dans l'ABSL3 au YNPRC (permis IACUC PROTO202000035). Le traitement des écouvillons nasopharyngés, du BAL et des cellules mononucléaires a été effectué comme décrit précédemment20. Six (2 femelles, 4 mâles, âgés de plus de 6 ans) d'autres macaques rhésus d'origine indienne exempts d'agents pathogènes spécifiques ont été ajoutés à l'étude (permis IACUC PROTO202100003) et ont également été infectés par voie intranasale et intratrachéale avec 1,1 × 106 unités formant plaque (PFU) SARS-CoV-2 pour la caractérisation de l'expression du CCR2 dans le sang total et le BAL.

Les huit animaux sous le permis IACUC PROTO202000035 étaient appariés selon l'âge et le sexe entre les bras témoins non traités et les bras expérimentaux traités au baricitinib, avec deux femelles et deux mâles affectés à chaque bras respectif. La cohorte 2 (permis IACUC PROTO202100003) était composée de deux femmes et de quatre hommes, qui ont tous servi de témoins non traités. Des efforts ont été faits pour inclure un nombre égal de femmes et d'hommes dans la cohorte 2. Cependant, les femelles macaques étaient limitées au moment de l'affectation des animaux de la cohorte 2 en raison des exigences de reproduction. Au total, entre les cohortes 1 et 2, quatre femmes et six hommes témoins non traités ont été inclus dans cette étude.

Les stocks viraux utilisés pour infecter les 8 MR du permis IACUC PROTO202000035 ont été précédemment décrits20. Le SARS-CoV-2 (NR-52281 : BEI Resources, Manassas, VA ; USA-WA1/2020, Lot n° 70033175) a été passé sur la lignée cellulaire Vero E6 (lignée cellulaire African Green Monkey Kidney ; CRL-1586, ATCC) à un MOI de 0,01. La méthode TCID50 a été utilisée pour propager et titrer le SARS-CoV-2 suivi du stockage des aliquotes à -80 °C. La dose infectieuse délivrée a été déterminée par titrage en retour des stocks viraux via un test de plaque. Le stock de virus a été séquencé pour confirmer la présence du motif de clivage de la furine. Les stocks viraux utilisés avaient moins de 6% de génomes avec une mutation qui peut abroger le clivage de la furine. Les 6 MR sur le permis IACUC PROTO202100003 étaient infectés par le stock viral NR-53899 : BEI Resources, Manassas, VA ; États-Unis-WA1/2020.

L'ARN génomique et sous-génomique du SARS-CoV-2 a été quantifié dans des écouvillons nasopharyngés, des écouvillons de gorge et des BAL comme décrit précédemment18,20. Les écouvillons ont été conservés dans 1 ml de milieu de transport viral (VTM-1L, Labscoop, LLC). L'ARN viral a été extrait manuellement d'échantillons frais d'écouvillons nasopharyngés (NP), d'écouvillons de gorge et de BAL à l'aide du mini kit QiaAmp Viral RNA conformément au protocole du fabricant. Pour l'ARN génomique, l'ensemble d'amorces et de sondes N2 conçu par le CDC : CoV2-N2-F : 5'-TTACAAACATTGGCCGCAAA-3', CoV2-N2-R : 5'-GCGCGACATTCCGAAGAA-3' et CoV2-N2-Pr : 5'-FAM-ACAATTTGCCCCAGCGCTTCAG-BHQ-3'59 ont été utilisés pour la PCR quantitative (qPCR). Pour l'ARN sous-génomique, les séquences d'amorce et de sonde pour le transcript60 de l'ARNm sous-génomique du gène E ont été utilisées : SGMRNA-EF : 5'-CGATCTCTTGTAGATCTGTTCTC-3', SGMRNA-ER : 5'-ATATTGCAGCAGTACGCACACA-3' et SGMRNA-E-Pr : 5'-FAM-ACACTAGCCATCCTTACTGCGCTTCG-3'. Les réactions qPCR ont été réalisées avec le mélange maître en 1 étape TaqMan Fast Virus en utilisant les conditions de cycle du fabricant, 200 nM de chaque amorce et 125 nM de la sonde en double. Au total, 257 copies/ml de VTM/plasma/BAL étaient la limite de détection pour ce test. La qPCR de la sous-unité CDC RNase P p30, modifiée pour les polymorphismes spécifiques du macaque rhésus, a été utilisée pour vérifier la qualité de l'échantillon à l'aide des séquences d'amorce et de sonde suivantes : RM-RPP30-F 5'-AGACTTGGACGTGCGAGCG-3', RM-RPP30-R 5'-GAGCCGCTGTCTCCACAAGT-3' et RPP30-Pr 5'-FAM-TTCTGACCTGAAG GCTCTGCGCG-BHQ1-3'. L'intégrité de l'ARN et la qualité de l'échantillon ont été vérifiées en exécutant un seul puits à partir de chaque extraction.

Les écouvillons NP ont été prélevés sous anesthésie à l'aide d'un écouvillon propre à pointe de rayonne (Thermo Fischer Scientific, BactiSwab NPG, R12300) placé à environ 2 à 3 cm dans les narines. Des écouvillons oropharyngés ont été prélevés sous anesthésie à l'aide d'écouvillons à pointe en polyester (applicateur Puritan Standard Polyester Tipped, poignée en polystyrène, 25-806 2PD, VWR International) pour strier les amygdales et le fond de la gorge bilatéralement (gorge/pharynx). Les écouvillons ont été plongés dans 1 ml de milieu de transport viral (Viral transport Media, VTM-1L, Labscoop, LLC) et vortexés pendant 30 s, et l'éluat a été recueilli.

Pour prélever le BAL, un bronchoscope à fibre optique (Olympus BF-XP190 EVIS EXERA III ULTRA SLM BRNCH et BF-P190 EVIS EXERA 4,1 mm) a été manipulé dans la trachée, dirigé dans la bronche primaire et fixé dans une bronche sous-segmentaire distale sur laquelle 35 à 50 ml de solution saline normale (0,9 % de NaCl) ont été administrés dans la bronche et réaspirés pour obtenir un minimum de 20 ml de liquide de lavage. Le BAL a été filtré à travers un tamis cellulaire de 70 μm et plusieurs aliquotes ont été prélevées pour les charges virales. Ensuite, le BAL restant a été centrifugé à 2200 tr/min pendant 5 min et le surnageant du fluide BAL a été collecté pour une analyse à méso-échelle. Les cellules BAL culottées ont été remises en suspension dans R10 et utilisées pour les analyses en aval.

Les cellules mononucléaires ont été comptées pour leur viabilité à l'aide d'un compteur de cellules automatisé Countess II (Thermo Fisher) avec coloration au bleu trypan et ont été cryoconservées dans des aliquotes allant jusqu'à 2 × 107 cellules dans du DMSO à 10% dans du FBS inactivé par la chaleur. Des segments de tissu entiers (0, 5 cm3) ont été congelés à sec ou stockés dans du RNAlater (Qiagen) ou du tampon de lyse Nuclisens (Biomerieux) pour les analyses de la distribution des composés, de l'ARN-seq et de la quantification virale tissulaire, respectivement.

Au total, une analyse cytométrique en flux à 23 paramètres a été effectuée sur du sang total EDTA frais61 et des cellules mononucléaires BAL de MR infectés par le SRAS-CoV-2 comme décrit précédemment20 en utilisant des anticorps monoclonaux anti-humains (mAbs), que nous et d'autres20,62,63, y compris les bases de données maintenues par la NHP Reagent Resource (MassBiologics), avons montré comme étant à réaction croisée dans les MR.

Un panel des mAbs suivants a été utilisé pour le phénotypage longitudinal des cellules immunitaires innées dans le sang total (500 μl) et des cellules mononucléaires (106 cellules) dérivées du BAL de la cohorte 1 et des animaux traités au baricitinib : anti-CD20-BB700 (clone 2H7 ; 2,5 ul ; cat. # 745889), anti-Ki-67-BV480 (clone B56 ; 5 ul ; cat. # 566109), anti-CD14-BV605 (clone M5E2 ; 2,5 ul ; cat. # 564054), anti-CD56-BV711 (clone B159 ; 2,5 ul ; cat. # 740781), anti-CD115-BV750 (clone 9-4D2-1E4 ; 2,5 ul ; cat. 747093), anti-CD3-BUV395 (clone SP34-2 ; 2,5 ul ; cat. # 564117), anti-CD8-BUV496 (clone RPA-T8 ; 2,5 ul ; cat. # 612942), anti-CD45-BUV563 (clone D058-1283 ; 2,5 ul ; cat. # 7414 14), anti-CCR2-BUV661 (clone LS132.1D9 ; 2,5 ul ; cat. # 750472), anti-CD16-BUV737 (clone 3G8 ; 2,5 ul ; cat. # 564434), anti-CD69-BUV805 (clone FN50 ; 5 ul ; cat. # 748763) et Fixable Viability S tain 700 (2 ul ; cat. # 564997) tous de BD Biosciences ; anti-CD38-FITC (clone AT1 ; 5 ul ; cat. # 60131FI) de STEMCELL Technologies ; anti-CD161-BV421 (clone HP-3G10 ; 5 ul ; cat. # 339914), anti-HLA-DR-BV650 (clone L243 ; 5 ul ; cat. # 307650), anti-CD11c-BV785 (clone 3.9 ; 5 ul ; cat. # 301644), anti-CD11b-PE (clone IC RF44; 2,5 ul; cat. # 301306) et anti-CD123-APC-Fire750 (clone 315; 2,5 ul; cat. # 306042) tous de Biolegend; anti-GranzymeB-PE-TexasRed (clone GB11; 2,5 ul; cat. # GRB17) de Thermo Fisher; anti-CD66abce-PE-Vio770 (clone TET2; 1 ul; cat. # 130-119-849) de Miltenyi Biotec; et anti-CD27-PE-Cy5 (clone 1A4CD27; 2,5 ul; cat. # 6607107) et anti-NKG2A-APC (clone Z199; 5 ul; cat. # A60797) de Beckman Coulter (Fig. 4 supplémentaire).

Pour les animaux de la cohorte 2, un panel différent des mAb suivants a été utilisé pour le phénotypage longitudinal des cellules immunitaires innées dans le sang total (500 μl), comme décrit dans la réf. 26, et des cellules mononucléaires (2 × 106 cellules) dérivées de BAL : anti-CD20-BB700 (clone 2H7 ; 2,5 μl ; cat. # 745889), anti-CD11b-BV421 (clone ICRFF44 ; 2,5 μl ; cat. # 562632), anti-Ki-67-BV480 (clone B56 ; 5 μl ; cat. # 566109), anti-CD14-BV605 (clone M5E2 ; 2,5 μl ; cat. # 564054), anti-CD56-BV711 (clone B159 ; 2,5 μl ; cat. # 740781), anti-CD163-BV750 (clone GHI/61 ; 2,5 μl ; cat. # 747185), anti-CD3-BUV395 (clone SP34-2 ; 2,5 μl ; cat. # 564117), anti-CD8-BUV496 (clone RPA-T8 ; 2,5 μl ; cat. # 612942), anti-CD45-BUV563 (clone D058-1283 ; 2,5 μ l; cat. # 741414), anti-CCR2-BUV661 (clone LS132.1D9; 2,5 μl; cat. # 750472), anti-CD16-BUV737 (clone 3G8; 2,5 μl; cat. # 564434), anti-CD101-BUV805 (clone V7.1; 2,5 μ l; cat. # 749163), anti-CD169-PE (clone 7-239; 2,5 μl; cat. # 565248) et anti-CD206-PE-Cy5 (clone 19.2; 20 μl; cat. # 551136) et Fixable Viability Stain 700 (2 μl; cat. # 564997) tous de BD Biosciences ; anti-ACE2-AF488 (clone Polyclonal ; 5 μl ; cat. # FAB9332G-100UG) de R&D ; anti-HLA-DR-BV650 (clone L243 ; 5 μl ; cat. # 307650), anti-CD11c-BV785 (clone 3.9 ; 5 μl ; cat. # 301644) et anti-CD123-APC-Fire750 (clone 315 ; 2,5 μl ; cat. # 306042) biolégende ; anti-GranzymeB-PE-TexasRed (clone GB11 ; 2,5 µl ; cat. # GRB17) de Thermo Fisher ; anti-CD66abce-PE-Vio770 (clone TET2 ; 1 µl ; cat. # 130-119-849) de Miltenyi Biotec ; anti-NKG2A-APC (clone Z199 ; 5 µl ; cat. # A60797) de Beckman Coulter. Les mAb pour les récepteurs de chimiokines (c'est-à-dire CCR2) ont été incubés à 37 °C pendant 15 min, et les cellules ont été fixées et perméabilisées à température ambiante pendant 15 min avec le kit de solution de fixation/perméabilisation (BD Biosciences ; cat. #554714). Pour chaque échantillon, un minimum de 1,2 × 105 événements de porte d'arrêt (cellules T CD3+ vivantes) ont été enregistrés. Tous les échantillons ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % et acquis dans les 24 h suivant la fixation. L'acquisition des données a été réalisée sur un FACSymphony A5 (BD Biosciences) piloté par le logiciel FACS DiVa Version 8.0 et analysé avec FlowJo (version 10.7 ; Becton, Dickinson, and Company). La stratégie de déclenchement est illustrée dans la Fig. 1 supplémentaire.

Les données pour -5 dpi, 2 dpi et 4 dpi pour les échantillons BAL en vrac ont été obtenues à partir de notre étude précédente20. Ici, nous avons élargi notre étude pour inclure des échantillons de 7 dpi et 10 dpi/11 dpi pour BAL et -5 dpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi et 10/11 dpi pour PBMC. Les suspensions cellulaires ont été préparées dans BSL3, pour l'ARN-Seq en vrac, 250 000 cellules (PBMC) ou 100 000 cellules (BAL) ont été lysées directement dans 700 ul de réactif QIAzol. Les kits RNeasy Mini ou Micro (QIAGEN) avec digestion à la DNase sur colonne ont été utilisés pour isoler l'ARN. La qualité de l'ARN a été déterminée à l'aide d'un bioanalyseur Agilent et la synthèse d'ADNc a été réalisée à l'aide de l'ARN total avec le kit Clontech SMARTSeq v4 Ultra Low Input RNA (Takara Bio) conformément aux instructions du fabricant. Des codes-barres à double index ont été ajoutés à l'ADNc amplifié après fragmentation à l'aide du kit de préparation de bibliothèque d'ADN NexteraXT (Illumina). Agilent 4200 TapeStation a été utilisé pour valider les bibliothèques par électrophorèse capillaire et les bibliothèques ont été regroupées à des concentrations équimolaires. Les bibliothèques ont été séquencées sur un Illumina NovaSeq6000 à 100SR, produisant 20 à 25 millions de lectures par échantillon.

Les fichiers BCL ont été convertis en Fastq à l'aide de bcl2fastq v2.20.0.422. Les séquences génomiques de Macaca mulatta (Mmul10 Ensembl release 100), SARS-CoV-2 (souche MN985325.1—NCBI) et les séquences ERCC ont été combinées pour construire un index STAR (v2.7.3a) comme décrit précédemment et les lectures ont été alignées sur cette référence20. Les fichiers ReadsPerGene ont été convertis au format htseq puis importés dans DESeq2 v1.24.064 à l'aide de la fonction DESeqDataSetFromHTSeqCount. La conception utilisée était la suivante : ∼ Sujet + Groupe * Moment où le groupe a fait la distinction entre les échantillons qui n'ont pas été traités ou qui ont été traités avec du baricitinib au cours du temps. Les gènes différentiellement exprimés pour BAL et PBMC ont été déterminés en utilisant un seuil de padj <0, 05, un facteur de changement> 2 et en filtrant les gènes faiblement exprimés où tous les échantillons à un moment donné devaient avoir une expression détectable par des lectures normalisées> 0 pour ce gène.

L'entrée pour GSEA v4.1.065 était les valeurs d'expression logarithmique régularisées obtenues à partir de DESeq2. Les ensembles de gènes suivants ont été utilisés pour l'analyse GSEA : voies Hallmark et canoniques (MsigDB), NHP ISGs66 et polyarthrite rhumatoïde (KEGG map05323). Étant donné que les noms de gènes sont largement cohérents entre les références du singe rhésus et du génome humain, ils ont été utilisés sans modification avec les ensembles de gènes MsigDB humains. Les paramètres par défaut ont été utilisés pour exécuter GSEA avec le type de permutation gene_set. Des parcelles de volcan d'expression différentielle à chaque instant ont été générées avec la bibliothèque EnhancedVolcano (v1.8.0) R67. Les valeurs d'expression de journal régularisées de DESeq2 ont été utilisées pour générer des cartes thermiques à l'aide de la bibliothèque R ComplexHeatmap (v2.0.0)68.

Les matrices de comptage filtrées pour BAL ont été obtenues auprès de GEO GSE15921420. Pour chaque échantillon BAL de macaque rhésus infecté par le SRAS-CoV-2, la matrice de comptage a été filtrée pour inclure uniquement les gènes codant pour les protéines. Les gènes codés sur le chromosome Y, les gènes mitochondriaux, les gènes RPS et RPL, les gènes des récepteurs des cellules B et des récepteurs des cellules T et le HBB ont été filtrés. La bibliothèque Seurat v4.0.434 a été utilisée pour effectuer l'analyse. Les paramètres suivants ont été utilisés pour filtrer les cellules : (1) nFeature_RNA ≥ 200 et ≤4000, (2) % de gène HBB <10, (3) % de gènes mitochondriaux <20, (4) % de gènes RPS/RPL <30 et (5) log10(nFeature_RNA) / log10(nCount_RNA) ≥ 0,8. Le nombre de cellules de chaque échantillon qui ont passé les mesures QC sont inclus dans les données supplémentaires 5. Tous les échantillons BAL de chaque animal à -5 dpi et 4 dpi ont ensuite été intégrés selon le pipeline d'intégration Seurat69 en utilisant la méthode CCA par défaut après avoir normalisé les échantillons en utilisant la méthode SCTransform. Les 30 premières dimensions ont été utilisées avec les fonctions RunUMAP et FindNeighbors.

Pour l'identification des DC, tous les échantillons BAL de -5 dpi et 4 dpi pour les macaques rhésus traités et non traités ont été intégrés à l'aide de CCA. Les clusters ont été déterminés à l'aide de la fonction FindClusters dans Seurat et les cellules ont été annotées à l'aide de SingleR (v1.4.0) (Fig. 10a, b supplémentaires). Le cluster seurat 11 a été classé comme pDC sur la base de l'expression de marqueurs canoniques (Fig. 10c supplémentaire). Les clusters 17 et 22 ont été classés comme mDC et mDC activés sur la base de l'expression des gènes marqueurs rapportés précédemment70.

Pour obtenir le sous-ensemble de macrophages/monocytes, le plus grand groupe composé principalement de macrophages/monocytes annotés par SingleR (base de données BluePrintEncode) a été sélectionné. Les cellules annotées comme un autre type de cellule dans ce groupe ont été filtrées. Les macrophages/monocytes de tous les échantillons BAL ont ensuite été divisés en échantillons individuels, normalisés à l'aide de la méthode SCTransform, puis intégrés à nouveau à l'aide de 30 dimensions. Nous avons utilisé la fonction FindMarkers de Seurat pour tester l'expression différentielle à l'aide de la méthode MAST (v1.16.0)71.

Les macrophages/monocytes des échantillons de BAL ont été annotés en sous-ensembles à l'aide de deux approches : (1) la cartographie des macrophages/monocytes à partir de la référence pulmonaire à l'aide de Seurat et (2) l'utilisation de cellules triées en vrac comme référence avec SingleR28. Les données de scRNA-seq pulmonaire 10X de trois macaques non infectés ont été obtenues à partir d'une étude publiée (NCBI GEO : GSE149758)33. Les paramètres suivants ont été utilisés pour filtrer les cellules : (1) nFeature_RNA ≥ 200 et ≤4000, (2) % de gènes mitochondriaux < 20, (3) % de gènes RPS/RPL < 50 et (4) log10(nFeature_RNA) / log10(nCount_RNA) ≥ 0,8. Les échantillons ont été normalisés à l'aide de SCTransform et intégrés. Les 40 premières dimensions ont été utilisées pour le regroupement initial. Les cellules macrophages/monocytes annotées par SingleR ont ensuite été sélectionnées, divisées en échantillons individuels et réintégrées à l'aide de 30 dimensions. Le regroupement de Louvain a abouti à quatre groupes qui ont été annotés en fonction de l'expression de gènes marqueurs. Cet ensemble de données intégré a servi de référence pour cartographier les macrophages/monocytes du BAL infecté par le SRAS-CoV-2 à l'aide de FindTransferAnchors et MapQuery avec reference.reduction défini sur pca et umap comme reduction.model.

Les échantillons BAL ont également été annotés à l'aide de la bibliothèque SingleR avec les cellules triées en vrac IM et AM comme référence. Afin d'obtenir des références pour l'attribution des types de cellules dans les données unicellulaires, les données d'ARN-Seq en masse des macrophages interstitiels (IM) et alvéolaires (AM) de trois macaques cynomolgus non infectés ont été analysées à l'aide de DESeq2. Les valeurs d'expression logarithmique régularisées ont été obtenues à l'aide de la fonction rlog avec les paramètres blind = FALSE et filtType = "parametric". Les gènes significatifs ont été filtrés sur la base des critères suivants : padj < 0,05 ; changement de pli> 2 et expression moyenne normalisée> 5000 pour les échantillons IM ou AM.

Pour l'analyse des données pulmonaires humaines, nous avons obtenu l'objet rds pour GEO GSE13589340 et filtré toutes les cellules à l'exception de celles annotées comme macrophages, monocytes et macrophages proliférants à partir d'échantillons de contrôle. Il y avait un total de dix échantillons de contrôle provenant de deux sites différents. Nous avons observé certains effets de lot potentiels dans UMAP et sélectionné seulement sept échantillons du site "Vanderbilt". Nous avons en outre abandonné un échantillon car le nombre de macrophages/monocytes était faible, ce qui a donné un total de six échantillons sains. L'objet a été divisé en fonction de Sample_Name et réintégré à l'aide de la méthode CCA dans Seurat. Sur la base de l'expression des gènes marqueurs décrite dans Morse et al.41, les quatre groupes de seurat obtenus en utilisant 15 dimensions et une résolution de 0,1 ont été annotés comme FABP4hi, SPP1hi, FCN1hi et Proliferating macrophages. Les macrophages/monocytes rhésus et humains d'individus sains ont ensuite été intégrés en utilisant l'approche basée sur la référence avec des échantillons humains comme référence en utilisant des gènes classés comme orthologues un à un selon ENSEMBL entre GRCh38 et Mmul10 et partageant le même nom de gène. Le package UCell (v1.3.1)72 a été utilisé pour obtenir des scores d'enrichissement pour l'expression des gènes marqueurs entre les sous-ensembles rhésus et macrophages/monocytes humains. Les marqueurs pour chaque sous-ensemble ont été obtenus à l'aide de la fonction FindMarkers dans Seurat pour chaque espèce à l'aide de la méthode MAST et filtrés pour inclure ceux avec une valeur p ajustée <0,05 et un changement de facteur >1,5. Ceux-ci ont ensuite été filtrés pour n'inclure que les gènes classés comme orthologues un à un et partageant le même nom de gène entre GRCh38 et Mmul10 (Données supplémentaires 6).

Pour le BAL humain, nous avons utilisé les échantillons disponibles dans le cadre de GEO : GSE1459268. Les cellules ont été filtrées sur la base des critères suivants : nFeature_RNA > 100, nFeature_RNA < 3500 et percent.mito <10 et les échantillons ont été intégrés en utilisant l'ACP réciproque. Les cellules ont été annotées à l'aide de la base de données BPEncode dans SingleR et seules les cellules annotées en tant que macrophages/monocytes dans le plus grand groupe comprenant des macrophages/monocytes ont été utilisées pour une analyse plus approfondie (Fig. 8d, e supplémentaires). Ces cellules ont ensuite été annotées en utilisant le macrophage/monocyte pulmonaire sain comme référence à l'aide des fonctions FindTransferAnchors et MapQuery dans seurat. L'expression de gènes marqueurs a été utilisée pour évaluer l'exactitude des prédictions (Fig. 8f supplémentaire).

Pour calculer la contribution de chaque type de cellule vers l'expression d'un gène, les valeurs CPM ont été obtenues en utilisant la méthode de normalisation RC avec un facteur d'échelle de 1e6. La valeur totale de CPM a été calculée par gène et la somme des valeurs de CPM pour un type de cellule donné a été divisée par le total pour obtenir une valeur en pourcentage.

Les dosages U-PLEX (Meso Scale MULTI-ARRAY Technology) ont été utilisés pour la détection des cytokines plasmatiques et BALF conformément aux instructions du fabricant, en utilisant 25 microlitres comme entrée.

Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. La taille de l'échantillon a été largement déterminée par (1) la disponibilité de PSN qui, au moment de l'étude (mars 2020), pourrait être infecté par le SRAS-CoV-2 et hébergé dans le BSL-3 et (2) le fort impact anticipé du baricitinib dans le blocage de l'inflammation induite par le SRAS-CoV-2. Les 8 MR de la Cohorte 1 ont été randomisés 2 jours après l'infection dans un groupe traité et non traité comprenant chacun 4 MR. La cohorte 2 était composée de 6 MR infectés par le SARS-CoV-226. Les charges virales nasales sgRNA à 2 dpi n'ont pas été mesurées pour 4 animaux (n = 2 Cohorte 1 et n = 2 cohorte baricitinib) et les charges virales sgRNA de la gorge à 6 dpi et 8 dpi n'ont pas été mesurées pour un animal de la Cohorte 1 en raison d'un ARN limité. Le sang total n'a pas été coloré pour la cytométrie en flux à 1 dpi pour un animal de la cohorte 1 et deux animaux baricitinib et à 6 dpi pour un animal de la cohorte 1. Le surnageant du liquide BAL n'a pas été collecté pour un animal de la cohorte 1 et un animal baricitinib à 2 dpi et n'a ensuite pas été analysé pour une analyse à méso-échelle. Un échantillon de base de scRNA-Seq de la cohorte 2 a été abandonné en raison d'une grande fraction de cellules épithéliales. Les enquêteurs n'ont pas été aveuglés à l'allocation pendant les expériences et l'évaluation des résultats. Les tests statistiques ont été effectués avec R (version 4.2.2) ou GraphPad Prism v7.02 et ont été répertoriés en conséquence. Les tests spécifiques qui ont été utilisés : test de rang signé Mann-Whitney U/Wilcoxon unilatéral/bilatéral ont été indiqués pour chaque comaprison. Pour l'analyse différentielle de l'expression génique des données d'ARN-Seq en vrac et unicellulaires, les valeurs p ajustées après correction de plusieurs tests, déterminées dans le cadre des analyses DESeq2 et MAST, ont été utilisées.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données d'ARN-Seq en masse générées dans cette étude pour les échantillons 7 dpi et 10 dpi/11 dpi pour BAL et -5 dpi, 1 dpi, 2 dpi, 4 dpi, 6 dpi, 7 dpi, 8 dpi et 10/11 dpi pour PBMC ont été déposées dans NCBI GEO (GSE198882). Les données scRNA-Seq pour BAL de macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2 et les données RNA-Seq en vrac pour -5 dpi, 2 dpi et 4 dpi pour le vrac ont été obtenues auprès de GEO GSE15921420. Les échantillons de poumon de macaque rhésus non infectés à cellule unique 10X ont été obtenus auprès de GEO GSE14975833. Les données d'ARN-Seq en vrac pour les macrophages interstitiels et alvéolaires triés de macaque cynomolgus ont été obtenues auprès de GEO GSE22531635. Les échantillons de poumon humain non infecté à cellule unique et les échantillons de BAL humain ont été obtenus auprès de GEO GSE13589340 et GSE1459268 respectivement. Les données sources sont fournies avec ce document.

Les scripts utilisés pour l'analyse sont disponibles sur https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_273.

Zhou, P. et al. Une épidémie de pneumonie associée à un nouveau coronavirus d'origine probable de chauve-souris. Nature 579, 270-273 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhu, N. et al. Un nouveau coronavirus provenant de patients atteints de pneumonie en Chine, 2019. N. Engl. J. Med. 382, 727–733 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Baden, LR et al. Efficacité et sécurité du vaccin mRNA-1273 SARS-CoV-2. N. Engl. J. Med. https://doi.org/10.1056/nejmoa2035389 (2020).

Mulligan, MJ et al. Étude de phase I/II du vaccin à ARN COVID-19 BNT162b1 chez l'adulte. Nature 586, 589–593 (2020).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Polack, FP et al. Innocuité et efficacité du vaccin BNT162b2 ARNm Covid-19. N. Engl. J. Med. 383, 2603–2615 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Carvalho, T., Krammer, F. & Iwasaki, A. Les 12 premiers mois de COVID-19 : une chronologie des connaissances immunologiques. Nat. Rév. Immunol. 21, 245-256 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wichmann, D. et al. Résultats d'autopsie et thromboembolie veineuse chez les patients atteints de COVID-19 : une étude de cohorte prospective. Anne. Interne. Méd. 173, 268-277 (2020).

Article PubMed Google Scholar

Liao, M. et al. Paysage unicellulaire des cellules immunitaires bronchoalvéolaires chez les patients atteints de COVID-19. Nat. Méd. 26, 842–844 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Silvin, A. et al. Une calprotectine élevée et des sous-ensembles de cellules myéloïdes anormales distinguent le COVID-19 sévère du léger. Cellule 182, 1401–1418.e18 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Moore, JB & June, CH Syndrome de libération de cytokines dans le COVID-19 sévère. Sciences 368, 473–474 (2020).

Article ADS CAS PubMed Google Scholar

Muñoz-Fontela, C. et al. Modèles animaux pour COVID-19. Nature 586, 509-515 (2020).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Munster, VJ et al. Maladie respiratoire chez les macaques rhésus inoculés avec le SRAS-CoV-2. Nature 585, 268-272 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rockx, B. et al. Pathogenèse comparative de COVID-19, MERS et SRAS dans un modèle de primate non humain. Sciences 368, 1012-1015 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chandrashekar, A. et al. L'infection par le SRAS-CoV-2 protège contre la rechallenge chez les macaques rhésus. Sciences 369, 812–817 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ziegler, CGK et al. Le récepteur ACE2 du SRAS-CoV-2 est un gène stimulé par l'interféron dans les cellules épithéliales des voies respiratoires humaines et est détecté dans des sous-ensembles de cellules spécifiques à travers les tissus. Cellule 181, 1016–1035.e19 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Corbett, KS et al. Évaluation du vaccin ARNm-1273 contre le SRAS-CoV-2 chez les primates non humains. N. Engl. J. Med. 383, 1544-1555 (2020).

Article CAS PubMed Google Scholar

Mercado, N.-B. et al. Le vaccin Ad26 à injection unique protège contre le SRAS-CoV-2 chez les macaques rhésus. Nature 586, 583–588 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Routhu, NK et al. Le vaccin modifié à base de vecteur de la vaccine Ankara protège les macaques contre l'infection par le SRAS-CoV-2, la pathologie immunitaire et le dysfonctionnement pulmonaire. Immunité 54, 542–556 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Williamson, BN et al. Bénéfice clinique du remdesivir chez les macaques rhésus infectés par le SARS-CoV-2. Nature 585, 273–276 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Hoang, TN et al. Le traitement au baricitinib résout l'inflammation des macrophages des voies respiratoires inférieures et le recrutement des neutrophiles chez les macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2. Cellule 184, 460–475.21 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Singh, DK et al. Réponses à une infection aiguë par le SRAS-CoV-2 dans les poumons des macaques rhésus, des babouins et des ouistitis. Nat. Microbiol. 6, 73–86 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Aid, M. et al. Maladie vasculaire et thrombose chez les macaques rhésus infectés par le SRAS-CoV-2. Cellule 183, 1354–1366.e13 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Fahlberg, MD et al. Événements cellulaires de COVID-19 aigu, résolutif ou progressif chez les primates non humains infectés par le SRAS-CoV-2. Nat Commun. 11, 6078 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Speranza, E. et al. Le séquençage de l'ARN unicellulaire révèle la dynamique de l'infection par le SRAS-CoV-2 dans les poumons des singes verts d'Afrique. Sci. Trad. Méd. 13, eabe8146 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Kalil, AC et al. Baricitinib plus remdesivir pour les adultes hospitalisés atteints de Covid-19. N. Engl. J. Med. 384, 795–807 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoang, TN et al. La modulation des réponses à l'interféron de type I inhibe puissamment la réplication et l'inflammation du SRAS-CoV-2 chez les macaques rhésus. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2022.10.21.512606 (2022).

Schultze, JL & Aschenbrenner, AC COVID-19 et le système immunitaire inné humain. Cellule 184, 1671–1692 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Aran, D. et al. L'analyse basée sur la référence du séquençage d'une seule cellule pulmonaire révèle un macrophage profibrotique transitionnel. Nat. Immunol. 20, 163–172 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Gibbings, SL et al. Trois macrophages interstitiels uniques dans le poumon murin à l'état d'équilibre. Suis. J. Respir. Cellule Mol. Biol. 57, 66-76 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Chakarov, S. et al. Deux populations distinctes de macrophages interstitiels coexistent à travers les tissus dans des niches sous-tissulaires spécifiques. Sciences 363, eaau0964 (2019).

Article CAS PubMed Google Scholar

Oural, BB et al. Identification d'un sous-ensemble de macrophages interstitiels pulmonaires associés aux nerfs avec une localisation distincte et des propriétés immunorégulatrices. Sci. Immunol. 5, eaax8756 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Schyns, J. et al. Des monocytes tissulaires non classiques et deux populations fonctionnellement distinctes de macrophages interstitiels peuplent le poumon de la souris. Nat. Commun. 10, 3964 (2019).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Esaulova, E. et al. Le paysage immunitaire de la tuberculose révèle des populations liées à la maladie et à la latence. Microbe hôte cellulaire 29, 165–178.e8 (2021).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hao, Y. et al. Analyse intégrée de données unicellulaires multimodales. bioRxiv 184, 3573–3587.e29 (2020).

Google Scholar

Corry, J. et al. Infiltration de macrophages et de neutrophiles inflammatoires et pyroptose généralisée dans la létalité de la grippe pulmonaire chez les primates non humains. PLoS Pathog. 18, e1010395 (2022).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Cai, Y. et al. Caractérisation in vivo des macrophages pulmonaires alvéolaires et interstitiels chez les macaques rhésus : implications pour la compréhension des maladies pulmonaires chez l'homme. J. Immunol. 192, 2821–2829 (2014).

Article CAS PubMed Google Scholar

Kumagai, T., Fan, S. & Smith, AM ADAMDEC1 et son rôle dans les maladies inflammatoires et le cancer. Métalloprotéinases Med. 7, 15–28 (2020).

Article CAS Google Scholar

Coillard, A. & Segura, E. Différenciation in vivo des monocytes humains. Devant. Immunol. 10, 1907 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Vanderheiden, A. et al. Les cellules dérivées de monocytes CCR2-dépendantes limitent l'infection par le SRAS-CoV-2. bioRxiv https://doi.org/10.1101/2021.05.03.442538 (2021).

Habermann, AC et al. Le séquençage d'ARN unicellulaire révèle les rôles profibrotiques de lignées épithéliales et mésenchymateuses distinctes dans la fibrose pulmonaire. Sci. Adv. 6, eaba1972 (2020).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Morse, C. et al. Macrophages proliférants exprimant SPP1/MERTK dans la fibrose pulmonaire idiopathique. EUR. Respir. J. 54, 1802441 (2019).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Rubin, R. Baricitinib est le premier traitement immunomodulateur COVID-19 approuvé. JAMA 327, 2281 (2022).

CAS PubMed Google Scholar

Brontë, V. et al. Le baricitinib limite la dérégulation immunitaire chez les patients atteints de COVID-19 sévère. J.Clin. Investir. 130, 6409–6416 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Ren, X. et al. Caractéristiques immunitaires du COVID-19 révélées par un atlas de transcriptome unicellulaire à grande échelle. Cellule 184, 1895–1913 e1819 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Liegeois, M., Legrand, C., Desmet, CJ, Marichal, T. & Bureau, F. Le macrophage interstitiel : une pièce longtemps négligée dans le puzzle de l'immunité pulmonaire. Cellule. Immunol. 330, 91–96 (2018).

Article CAS PubMed Google Scholar

Hoppstädter, J. et al. Réaction cellulaire différentielle lors de l'activation des récepteurs de type Toll 4 et 9 dans les macrophages interstitiels alvéolaires et pulmonaires humains. Respir. Rés. 11, 124 (2010).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Blanco-Melo, D. et al. La réponse déséquilibrée de l'hôte au SRAS-CoV-2 entraîne le développement du COVID-19. Cellule 181, 1036–1045.e9 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Asano, T. et al. Déficit récessif en TLR7 lié à l'X chez environ 1 % des hommes de moins de 60 ans atteints de COVID-19 menaçant le pronostic vital. Sci. Immunol. 6, eabl4348 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bâtard, P. et al. Les auto-anticorps neutralisant les IFN de type I sont présents chez environ 4 % des personnes non infectées de plus de 70 ans et représentent environ 20 % des décès dus au COVID-19. Sci. Immunol. 6, eabl4340 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Bâtard, P. et al. Les auto-anticorps préexistants contre les IFN de type I sous-tendent la pneumonie COVID-19 critique chez les patients atteints d'APS-1. J. Exp. Méd. 218, e20210554 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Bâtard, P. et al. Auto-anticorps dirigés contre les IFN de type I chez les patients atteints de COVID-19 menaçant le pronostic vital. Sciences 370, eabd4585 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Lopez, J. et al. L'immunité nasale précoce des IFN de type I contre le SRAS-CoV-2 est compromise chez les patients présentant des auto-anticorps contre les IFN de type I. J. Exp. Méd. 218, e20211211 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Solanich, X. et al. Auto-anticorps préexistants neutralisant de fortes concentrations d'interférons de type I chez près de 10% des patients COVID-19 admis en soins intensifs à Barcelone. J.Clin. Immunol. 41, 1733–1744 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

van der Wijst, MGP et al. Les auto-anticorps anti-interféron de type I sont associés à des altérations immunitaires systémiques chez les patients atteints de COVID-19. Sci. Trad. Méd. 13, eabh2624 (2021).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Zhang, Q. et al. Erreurs innées de l'immunité IFN de type I chez les patients atteints de COVID-19 potentiellement mortel. Sciences 370, eabd4570 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Arunachalam, PS et al. Évaluation biologique des systèmes de l'immunité à l'infection légère par rapport à l'infection COVID-19 sévère chez l'homme. Sciences 369, eabc6261 (2020).

Article Google Scholar

Liu, C. et al. L'immunologie des systèmes résolus dans le temps révèle un stade tardif lié au COVID-19 mortel. Cellule 184, 1836–1857.e22 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Shebl, FM et al. Comparaison des mesures d'ARNm et de protéines des cytokines après la vaccination avec des particules de type virus du papillomavirus humain-16 L1. Épidémiologie du cancer. Biomarqueurs Préc. 19, 978–981 (2010).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Waggoner, JJ et al. RT-PCR triplex en temps réel pour le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère 2. Emerg. Infecter. Dis. 26, 1633-1635 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Wolfel, R. et al. Bilan virologique des patients hospitalisés atteints de COVID-2019. Nature 581, 465–469 (2020).

Article ADS PubMed Google Scholar

Kuri-Cervantès, L. et al. Cartographie complète des perturbations immunitaires associées au COVID-19 sévère. Sci. Immunol. 5, eabd7114 (2020).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

McGary, CS et al. Les lymphocytes T CD4(+) CTLA-4(+)PD-1(-) mémoire contribuent de manière critique à la persistance virale chez les macaques rhésus infectés par le SIV et sous traitement antirétroviral. Immunité 47, 776–788.e5 (2017).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Micci, L. et al. L'interleukine-21 associée à l'ART réduit l'inflammation et le réservoir viral chez les macaques infectés par le SIV. J.Clin. Investir. 125, 4497–4513 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Love, MI, Huber, W. & Anders, S. Estimation modérée du changement de pli et de la dispersion des données ARN-seq avec DESeq2. Génome Biol. 15, 550 (2014).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Subramanian, A. et al. Analyse d'enrichissement d'ensembles de gènes : une approche basée sur les connaissances pour interpréter les profils d'expression à l'échelle du génome. Proc. Natl. Acad. Sci. États-Unis 102, 15545–15550 (2005).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Sandler, NG et al. Les réponses à l'interféron de type I chez les macaques rhésus préviennent l'infection par le SIV et ralentissent la progression de la maladie. Nature 511, 601–605 (2014).

Article ADS CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Blighe, K., Rana, S. & Lewis, M. EnhancedVolcano : parcelles de volcan prêtes à être publiées avec coloration et étiquetage améliorés. https://github.com/kevinblighe/EnhancedVolcano (2020).

Gu, Z., Eils, R. & Schlesner, M. Les cartes thermiques complexes révèlent des modèles et des corrélations dans les données génomiques multidimensionnelles. Bioinformatique 32, 2847–2849 (2016).

Article CAS PubMed Google Scholar

Butler, A., Hoffman, P., Smibert, P., Papalexi, E. & Satija, R. Intégration de données transcriptomiques unicellulaires dans différentes conditions, technologies et espèces. Nat. Biotechnol. 36, 411–420 (2018).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Tang-Huau, TL et al. Les cellules dendritiques et les macrophages dérivés de monocytes humains générés in vivo présentent des antigènes croisés par une voie vacuolaire. Nat. Commun. 9, 2570 (2018).

Article ADS PubMed PubMed Central Google Scholar

Finak, G. et al. MAST : un cadre statistique flexible pour évaluer les changements transcriptionnels et caractériser l'hétérogénéité dans les données de séquençage d'ARN unicellulaire. Génome Biol. 16, 278 (2015).

Article PubMed PubMed Central Google Scholar

Andreatta, M. & Carmona, SJ UCell : score de signature génétique unicellulaire robuste et évolutif. Calcul. Structure. Biotechnol. J. 19, 3796–3798 (2021).

Article CAS PubMed PubMed Central Google Scholar

Upadhyay, AA & Tharp, GK TREM2+ et les macrophages de type interstitiel orchestrent l'inflammation des voies respiratoires dans l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les macaques rhésus, NHP_COVID-19_2. https://github.com/BosingerLab/NHP_COVID-19_2 ; https://doi.org/10.5281/zenodo.7626608 (2023).

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Nous remercions chaleureusement le directeur du Emory National Primate Research Center (ENPRC), Paul Johnson ; Division des ressources animales, en particulier Joyce Cohen, Stephanie Ehnert, Stacey Weissman, Sherrie Jean, Jennifer S. Wood, Fawn Connor-Stroud, Rachelle L. Stammen, Racquel A. Sampson-Harley, Denise Bonenberger, John M. Wambua, Dominic M. D'Urso et Sanjeev Gumber pour leur soutien en matière de soins et de pathologie animale. De plus, nous remercions Kalpana Patel et Maureen Thompson pour les conseils en matière de biosécurité et Ernestine Mahar, Kyndal Goss, Christina Gavegano et Sudhir Kasturi pour le soutien technique, informatique et de cytométrie. Nous sommes reconnaissants à Raymond F. Schinazi d'avoir fourni le baricitinib et le virus ainsi que l'idée originale. Nous nous excusons pour les publications clés omises en raison du manque d'espace. NIH Office of Research Infrastructure Programs (ORIP) P51 OD11132 qui fournit un financement de base à ENPRC et Emory NPRC Genomics Core ; et P51 OD11132-61S1 et P51 OD11132-60S4 à M.Pa. Emory University COVID-19 Molecules and Pathogens to Populations and Pandemics (MP3) Initiative Seed Grant to M.Pa., AP, and RFS YNPRC Coronavirus Pilot Research Project Program grant (to M.Pa. under award P51 OD11132). Fast Grants #2144 à M.Pa. La bourse de la Fondation William IH et Lula E. Pitts à M.Pa. Subvention NIH 5R01-MH-116695 attribuée à RFS Les données de séquençage ont été acquises sur un Illumina NovaSeq6000 financé par NIH S10 OD026799 à SEB. On se souviendra du Dr Hoang pour son intelligence, son dynamisme et son amour pour la science et pour toutes les vies qu'il a touchées au cours de sa courte mais percutante carrière.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang.

Ces auteurs ont conjointement supervisé ce travail : Mirko Paiardini, Steven E. Bosinger.

Décédé : Timothy N. Hoang.

Division de microbiologie et d'immunologie, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, États-Unis

Amit A. Upadhyay, Elise G. Viox, Timothy N. Hoang, Maria Pino, Michelle Y.-H. Lee, Zachary Strongin, Justin L. Harper, Christopher T. Edwards, Kevin Nguyen, Rama R. Amara, Thomas H. Vanderford, Mirko Paiardini et Steven E. Bosinger

Emory NPRC Genomics Core Laboratory, Emory National Primate Research Center, Emory University, Atlanta, GA, États-Unis

Arun K. Boddapati, David A. Cowan, Elizabeth N. Beagle, Tristan R. Horton, Sydney Hamilton, Hadj Aoued, Kathryn L. Pellegrini et Gregory K. Tharp

Département des maladies infectieuses et de microbiologie, Université de Pittsburgh, Pittsburgh, PA, États-Unis

Jacqueline Corry et Simon M. Barratt-Boyes

Département de pathologie et de médecine de laboratoire, École de médecine, Université Emory, Atlanta, GA, États-Unis

Anne Piantadosi, Susan P. Ribeiro, Rafick P. Sekaly, Mirko Paiardini et Steven E. Bosinger

Département de médecine, École de médecine, Université Emory, Atlanta, GA, États-Unis

Rebecca D. Levitt

Département de microbiologie et d'immunologie, Emory School of Medicine, Emory University, Atlanta, GA, États-Unis

Rama R. Amara

Département d'immunologie, Université de Pittsburgh, Pittsburgh, Pennsylvanie, États-Unis

Simon M. Barratt-Boyes

Département de pédiatrie, École de médecine, Université Emory et Children's Healthcare of Atlanta, Atlanta, GA, États-Unis

Raymond F. Schinazi

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Conceptualisation : AAU, TNH, EGV, M. Pino, M. Paiardini, RFS et SEB ; Méthodologie : TNH, M. Pino, EGV, SPR, MY-HL, JC, ZS, DAC, ENB, TRH, SH, HA, JLH, KN, KLP, AP, RDL et THV ; Analyse formelle : AAU, TNH, M. Pino, AKB, MY-HL, CTE, ZS, EGV, GKT et THV ; Enquête : AAU, EGV, TNH, M. Pino, M. Paiardini et SEB ; Ressources : SEB, SMBB, RRA, RFS, RPS, M. Paiardini et SEB ; Rédaction—Brouillon original : AAU, M. Pino et SEB ; Rédaction, révision et édition : TNH, SPR, EGVM Paiardini et RFS Visualisation : AAU, TNH, M. Pino, AKB et GKT Encadrement : M. Paiardini et SEB ; Financement acquisition : M. Paiardini, SEB et RFS

Correspondance à Mirko Paiardini ou Steven E. Bosinger.

RFS a servi dans le passé en tant que consultant non rémunéré pour Eli Lilly dont les médicaments sont évalués dans la recherche décrite dans cet article, et détient des actions d'Eli Lilly. Il reçoit également des redevances sur les ventes de baricitinib pour COVID-19 aux États-Unis et au Mexique. Les termes de cet accord ont été examinés et approuvés par l'Université Emory conformément à ses politiques sur les conflits d'intérêts. Tous les autres auteurs n'ont aucun conflit à déclarer.

Nature Communications remercie Jincun Zhao et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International License, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur n'importe quel support ou format, tant que vous donnez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Upadhyay, AA, Viox, EG, Hoang, TN et al. TREM2 + et les macrophages de type interstitiel orchestrent l'inflammation des voies respiratoires dans l'infection par le SRAS-CoV-2 chez les macaques rhésus. Nat Commun 14, 1914 (2023). https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

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Reçu : 04 octobre 2021

Accepté : 16 mars 2023

Publié: 06 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41467-023-37425-9

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