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May 22, 2023

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Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 622 (2023) Citer cet article

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La leucémie aiguë myéloïde est la leucémie aiguë la plus fréquente chez l'adulte, la barrière de la résistance réfractaire et médicamenteuse n'a pas encore été conquise en clinique. L'expression anormale des gènes et les changements épigénétiques jouent un rôle important dans la pathogenèse et le traitement. Un super-amplificateur est un modificateur épigénétique qui favorise les gènes pro-tumoraux et la résistance aux médicaments en activant la transcription oncogène. L'analyse intégrative multi-omique identifie le gène CAPG associé au super-amplificateur et son niveau d'expression élevé a été corrélé à un mauvais pronostic dans la LAM. Le CAPG est une protéine du cytosquelette mais sa fonction n'est pas claire dans la LAM. Ici, nous montrons la fonction moléculaire de CAPG dans la régulation de la voie de signalisation NF-κB par analyse protéomique et épigénomique. L'inactivation de Capg dans le modèle murin AML a entraîné l'épuisement des cellules AML et la survie prolongée des souris AML. En conclusion, le gène CAPG associé aux SE peut contribuer à la progression de la LAM par NF-κB.

La leucémie myéloïde aiguë (LMA) est une hémopathie maligne agressive causée principalement par l'accumulation de mutations génétiques et la prolifération maligne des cellules souches hématopoïétiques (CSH)1,2,3,4,5. Les taux élevés de résistance aux médicaments et de récidive sont le défi actuel des essais cliniques6. La LAM peut survenir et progresser à la suite de mutations génétiques aléatoires et d'altérations épigénétiques7,8,9,10.

Ces dernières années ont mis en évidence des progrès significatifs dans la compréhension des schémas épigénétiques anormaux sous-jacents de plusieurs cancers. Les anomalies épigénétiques activent les proto-oncogènes11 et provoquent une instabilité chromosomique12,13, tandis que le silence transcriptionnel des gènes suppresseurs de tumeurs14,15. La détection d'événements moléculaires épigénétiques au cours du développement et de la progression de la LAM pourrait être précieuse pour le développement de traitements plus efficaces.

Le super-amplificateur (SE) est essentiellement un groupe d'amplificateurs typiques actifs (TE)16. Par rapport aux TE, les SE ont une taille plus grande et une capacité accrue à activer la transcription. Au cours du développement, les SE jouent un rôle essentiel dans la régulation du destin cellulaire et la détermination des gènes16. Les cellules cancéreuses acquièrent des SE dans des régions oncogènes telles que MYC, BCL2, et leur phénotype cancéreux repose sur une transcription anormale16,17. Des modifications épigénétiques telles que la méthylation de l'ADN, l'acétylation des histones peuvent réguler l'activation anormale des effecteurs en aval via les SE18,19,20. Les SE se sont également avérés être des médiateurs des gènes liés à la tumeur21,22, du point de contrôle immunitaire23, de la transcription des cytokines24 inflammatoires25,26. Ceux-ci suggèrent que les SE sont impliquées dans l'apparition et le développement de la récurrence de la tumeur et de la résistance aux médicaments.

La protéine de coiffage de l'actine, de type gelsoline (CAPG) est une protéine de liaison à l'actine de la superfamille des gelsolines qui joue un rôle crucial dans l'organisation du cytosquelette d'actine27. Les preuves suggèrent que les protéines appartenant à la superfamille des gelsolines peuvent être impliquées dans d'autres processus, y compris la régulation de l'expression génique28,29. Contrairement aux autres membres de la superfamille des gelsolines, le CAPG se trouve principalement dans le noyau plutôt que dans le cytoplasme30. Des études antérieures ont démontré que le CAPG est un biomarqueur du cancer du sein pour le développement et le traitement des métastases osseuses31. Cependant, le modèle d'expression et la fonction de CAPG dans la LAM restent à étudier.

Dans cette étude, nous avons identifié un gène CAPG associé à un super-amplificateur spécifique à la LAM. et vérifié que CAPG peut réguler la progression de la LAM par la voie de signalisation NF-κB.

Une compréhension approfondie de la pathogenèse de la LMA, conférant une nouvelle cible de traitement pour la thérapie de la LMA, nous avons d'abord identifié des super-amplificateurs spécifiques à la LMA et des gènes associés aux SE. Les super-amplificateurs sont importants pour contrôler et définir l'expression de gènes spécifiques aux cellules16. Pour identifier les SE spécifiques à la LMA et les gènes associés, nous avons intégré des données multi-omiques pour caractériser le gène associé au super-amplificateur spécifique à la LMA dans le but de fournir de nouvelles cibles pour le traitement de la LMA. Nous avons identifié les SE spécifiques à la leucémie myéloïde aiguë et les gènes associés aux SE en analysant les données de séquençage d'immunoprécipitation de la chromatine AML H3K27ac (ChIP-seq). Pendant ce temps, les gènes associés aux SE des cellules sanguines normales, y compris les neutrophiles (NE), les monocytes (MO) et les cellules progénitrices des cellules souches hématopoïétiques (HSPC) ont été identifiés (Fig. 1 supplémentaire). De plus, nous avons analysé l'ensemble de données RNA-seq accessible au public (GSE128910) de l'étude précédente, calculé les gènes exprimés de manière différentielle entre les volontaires de santé et les patients atteints de LMA, sélectionné les gènes qui étaient exprimés dans la LMA (RPKM> 1) et étaient 3 fois plus élevés que la normale (Fig. 1a)32,33,34,35.

un schéma expérimental pour rechercher des gènes associés à un super-amplificateur spécifiques et hautement exprimés dans les cellules AML. Les neutrophiles (NE), les monocytes (MO) et les cellules progénitrices des cellules souches hématopoïétiques (HSPC) représentent les cellules sanguines normales. Le cercle bleu représente les gènes associés au super-amplificateur dans les cellules hématopoïétiques normales. Le cercle vert représente les gènes régulés positivement chez les patients atteints de LAM. Le cercle gris représente les gènes associés au super-amplificateur dans les cellules AML. b Les pistes ChIP-seq montrent le signal H3K27ac représentatif chez les volontaires sains et les patients atteints de LAM. Les super-amplificateurs sont représentés par des cases grises.

Selon l'analyse ci-dessus, nous avons éliminé 6 gènes associés aux SE spécifiques à la LAM (CAPG, CD207, GPR132, SLC7A11, HIPK3 et FCER1G) qui ont une expression significativement élevée (Fig. 1b). Ces régions géniques sont enrichies en SE et fortement exprimées dans l'AML (Fig. 2a, Fig. 2a supplémentaire). Nous avons sélectionné le CAPG comme objet de notre recherche, qui a été rapporté à une expression élevée dans la LAM.

a Les données ARN-seq (GSE128910) montrent que CAPG est fortement exprimé chez les patients atteints de LAM. Volontaires sains (n ​​= 4) ou patients LAM (n = 7). b Les courbes de survie de Kaplan-Meier de CAPG dans la base de données The Cancer Genome Atlas (TCGA)-LAML. Les lignes pointillées représentent une limite de confiance de 95 %. c Comparer le niveau d'expression de CAPG dans le carcinome invasif du sein (BRCA), le carcinome à cellules papillaires rénales (KIPR), le cystadénocarcinome séreux ovarien (OV), l'adénocarcinome pancréatique (PAAD), l'adénocarcinome du rectum (READ) et les tumeurs germinales testiculaires (TGCT) de la tumeur et du tissu normal. La somme des rangs de Wilcoxon et le test des rangs signés ont été utilisés pour analyser la signification des différences. La médiane est indiquée par la ligne à l'intérieur de la boîte. d Schéma expérimental pour les souris AML induites par MLL-AF9 établi. e RT-qPCR montrant que l'expression de CAPG était augmentée dans les cellules leucémiques murines de souris transplantées primaires par rapport aux cellules de moelle osseuse de souris normales (n = 5 souris). Chaque point représente une souris. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD. *p < 0,05 par rapport au groupe témoin. f Western blot montrant que l'expression de CAPG était augmentée dans les cellules leucémiques de souris transplantées primaires par rapport aux cellules de moelle osseuse de souris normales. GAPDH a été utilisé pour montrer une charge égale. Chaque bande représente une souris individuelle.

Nous avons analysé la base de données du Cancer Genome Atlas (TCGA) et avons constaté que le niveau d'expression de CAPG était positivement associé à un mauvais pronostic dans la LAM (Fig. 2b). En parallèle, l'expression d'autres gènes associés aux SE était également corrélée au pronostic à des degrés divers (Fig. 3 supplémentaire). De plus, une enquête par la base de données TCGA a révélé que CAPG était statistiquement significativement fortement exprimé dans une variété de tissus tumoraux par rapport aux tissus normaux (Fig. 2c). Cela implique que le CAPG est étroitement lié au développement de la tumeur.

Pour valider davantage si les gènes associés aux SE sont exprimés de manière différentielle dans la maladie et affectent le pronostic de la LAM, les niveaux d'expression dans les échantillons de sang périphérique collectés des patients et les échantillons de moelle osseuse de modèles murins ont ensuite été comparés (Fig. 2d). Nous avons observé que l'expression de CAPG dans les cellules AML murines induites par MLL-AF9 était significativement élevée par rapport aux cellules de moelle osseuse murine normales (Fig. 2e, f et Fig. 2b supplémentaire).

En général, les oncogènes de l'AML peuvent être criblés avec précision par des gènes associés aux super-amplificateurs, et le gène CAPG associé aux super-amplificateurs est lié à la progression de l'AML.

Le CAPG est connu comme un membre de la superfamille des protéines de la gelsoline, qui régule la longueur des filaments d'actine en coiffant ou en coupant les filaments36. Le CAPG est situé dans le cytoplasme et le noyau cellulaires, contrairement aux autres membres de cette famille37. Le CAPG a été lié à un mauvais pronostic dans le cancer du pancréas38 et du sein31,39, mais aucune recherche sur la LAM n'a été menée. Dans la LAM, il existe une tendance à la hausse de l'expression de l'actine (Fig. 2c supplémentaire). Pour examiner comment le CAPG contribue à la progression de la LAM, nous avons purifié et caractérisé les complexes protéiques CAPG dans la lignée cellulaire de LAM humaine THP-1 pour construire des interactomes CAPG par immunoprécipitation avec spectrométrie de masse (IP-MS) (Fig. 3a et données supplémentaires 3).

un schéma montrant le système IP-MS dépendant des anticorps pour identifier les interactomes CAPG dans la cellule THP-1. b Connexion de CAPG avec plusieurs complexes protéiques. Résumé des principaux complexes protéiques (cercle en pointillés) associés à l'interactome CAPG. La taille du cercle représente la fiabilité de l'interaction protéine-protéine et l'épaisseur de la ligne de connexion représente l'intensité de l'interaction. c Co-IP montre les interactions entre CAPG et les protéines apparentées à NF-κB (RPL4, ZFP91, CCAR2).

Nous avons identifié 79 protéines interagissant avec CAPG dans THP-1 (matériel supplémentaire). De plus, l'analyse d'enrichissement via l'ontologie des gènes et la conclusion avec visualisation graphique des interactomes ont été utilisées pour déterminer les fonctions biologiques cellulaires. Gene Ontology a été utilisé pour sélectionner les clusters d'annotations fonctionnelles. L'analyse fonctionnelle a révélé qu'en tant que protéine de liaison à l'actine, les partenaires protéiques CAPG des extraits protéiques totaux sont intimement associés à la liaison de l'acide nucléaire et du filament d'actine et sont également impliqués dans les activités moléculaires cellulaires. Les catégories GO étaient impliquées dans des processus liés au métabolisme cellulaire, à la localisation et à la stabilité des biomolécules. Il est également impliqué dans l'épissage de l'ARN et peut influencer l'expression des gènes, engagé dans le contrôle épigénétique, lié au remodelage de la chromatine et à la modification des histones. CAPG a été trouvé dans le ribosome, le nucléaire et le nucléoplasme, en particulier dans le cytosquelette d'actine, selon l'analyse des composants cellulaires. CAPG également associé au complexe de modification épigénétique. Le résultat a indiqué que CAPG en tant que protéine de gelsoline constitue non seulement le cytosquelette, mais joue également une fonction essentielle dans les processus de croissance cellulaire (Fig. 4a supplémentaire).

Pour interpréter plus en détail le rôle fonctionnel potentiel du CAPG, les résultats de l'interactome ont été soumis à une analyse du réseau d'interactions protéine-protéine (PPI) (Fig. 3b). Notamment, nous avons observé que CAPG interagit physiquement avec plusieurs complexes protéiques du cytosquelette impliquant le complexe de myosine, le complexe de troponine, le complexe de tubuline et le complexe d'actine. Ce résultat est cohérent avec la fonction de CAPG en tant que protéine de gelsoline.

De plus, l'analyse des caractéristiques de l'interactome a révélé que le CAPG est associé à de multiples complexes régulateurs épigénétiques, qui n'ont pas été signalés auparavant. Il convient de noter que trois protéines en interaction (CCAR2, RPL4, ZFP91) ont été signalées comme activateurs de la voie de signalisation du facteur nucléaire-κB (NF-κB)40,41,42 (Fig. 3c). De plus, le complexe SNW1 a été identifié comme un nouveau régulateur transcriptionnel de la voie NF-κB43 (Fig. 4b supplémentaire). Les recherches montrent que le déséquilibre de l'activité de NF-κB provoque des maladies liées à l'inflammation telles que les cancers, de sorte que NF-κB est considéré comme une cible potentielle pour le traitement du cancer44. L'activation des voies NF-κB contribue à la transformation leucémique initiée par certaines kinases oncogènes cruciales45. Nous avons détecté que le CAPG caractérisé interagit avec le complexe de voies de signalisation NF-κB dans les cellules AML, nous avons donc émis l'hypothèse que le CAPG a le potentiel en tant que cible pour réguler le processus pathologique de la LMA.

Pour élucider le lien entre CAPG et NF-κB au cours du développement de l'AML, nous avons collecté des cellules de moelle osseuse de souris normales et AML. Nous avons effectué des tests CAPG ChIP-seq pour identifier le réseau de régulation des gènes et évalué les données pour sélectionner des pics spécifiques à la LAM enrichis en régions géniques (Fig. 4a).

un diagramme de Venn des loci de liaison CAPG dans les cellules de moelle osseuse normales et les cellules de moelle osseuse AML. b Analyse d'enrichissement du terme Gene Ontology des gènes régulés par CAPG uniquement dans les cellules AML, P <0, 05 pour chaque résultat affiché sur la figure. c Les niveaux d'ARNm de CAPG dans le groupe témoin, knockdown et stimulé par TNF-α à 10 ng/mL ont été comparés. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET. ***p < 0,001. Les résultats proviennent de trois répétitions biologiques. d L'ajout de TNF-α a inversé l'inhibition de l'activité de la voie NF-κB induite par l'inactivation de CAPG dans les cellules THP-1. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET. **p < 0,01, ***p < 0,001. Les résultats proviennent de trois répétitions biologiques. e L'analyse KEGG a révélé que les gènes CAPG en aval étaient principalement enrichis dans la voie de signalisation NF-κB, P < 0,05 pour chaque résultat affiché sur la figure. f niveaux d'ARNm de la leucémogenèse dans le groupe contrôle, CAPG knockdown. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± ET. **p < 0,01, ***p < 0,001.

L'analyse GO a montré que les gènes régulés par CAPG étaient substantiellement liés à la voie NF-κB en termes de composant cellulaire et de fonction moléculaire (Fig. 4b). Nous avons également évalué les cibles des facteurs de transcription et les gènes en aval, identifié CAPG comme un gène potentiel impliqué dans la régulation de l'activité transcriptionnelle de la voie NF-κB (Fig. 5a, b supplémentaires). Toutes ces preuves impliquent que le CAPG est lié à l'activation de la voie NF-κB.

Pour démontrer davantage notre conclusion, nous avons étudié l'enrichissement de CAPG dans le génome des cellules THP-1. L'analyse ChIP-qPCR a montré que CAPG était significativement enrichi dans la région des facteurs de transcription de NF-κB dans les cellules THP-1 (Fig. 5c supplémentaire).

De plus, nous avons régulé à la baisse l'expression de CAPG dans les cellules THP-1 (Fig. 4c et Fig. 5d supplémentaire)) et évalué les niveaux d'expression des gènes en aval de NF-κB (Fig. 4d). Notamment, l'inactivation de CAPG a entraîné une réduction marquée de l'expression de plusieurs gènes de réponse apoptotique et immunitaire qui ont été associés à la progression de la LAM (Fig. 4d) 46,47. Nous avons également collecté des données d'ARN-seq après avoir renversé CAPG et effectué une analyse KEGG, qui a révélé que les gènes régulés à la baisse étaient considérablement enrichis dans la voie NF-κB (Fig. 4e et données supplémentaires 4).

Pour démontrer la régulation directe de la voie NF-κB par CAPG, nous avons activé la voie en stimulant les cellules THP-1 avec du TNF-α et avons observé un sauvetage significatif de l'expression des gènes en aval (Fig. 4d). De plus, lorsque CAPG est épuisé, le niveau d'expression de la leucémogenèse est considérablement réduit (Fig. 4f). Ces observations impliquent que le CAPG peut moduler directement la voie NF-κB, qui à son tour affecte la progression de l'AML.

Pour déterminer si le CAPG est associé à la progression de la LAM, nous avons mené des expériences de knockdown CAPG pour vérifier sa fonction. L'inactivation de CAPG peut inhiber la croissance des cellules AML (Fig. 6a supplémentaire). Pour explorer davantage le rôle pro-tumoral potentiel de CAPG dans la LAM, un nombre égal de cellules de LAM murines témoins (Ctrl) ou Capg knockdown (shCapg) ont été transplantées chez des receveurs syngéniques de type sauvage (WT) (Fig. 5a).

un schéma expérimental pour le renversement de Capg in vivo. b Analyse Western blot montrant l'inactivation de Capg dans des cellules AML triées provenant de la moelle osseuse de souris AML. c Analyse RT-qPCR montrant l'inactivation de Capg dans des cellules AML triées de la moelle osseuse de souris AML de contrôle de brouillage (Ctrl) et Capg knockdown (shCapg) au jour 45 après la transplantation. Les données sont présentées sous forme de moyennes ± SD. **p < 0,01 par rapport au groupe témoin. Les résultats proviennent de trois répétitions biologiques. d Parcelles de flux cytométriques représentatives, pourcentage de cellules GFP + AML dans la moelle osseuse (BM) au jour 45 après la transplantation (n = 5 souris). Chaque point représente une souris. ***p < 0,001 par rapport au groupe témoin. e Des diagrammes de flux cytométriques représentatifs et des résultats statistiques montrent que l'inactivation de Capg diminue la charge de leucémie dans le sang périphérique (PB) au jour 28 et au jour 45 après la transplantation (n = 5 souris). Chaque point représente une souris. *p < 0,05, ***p < 0,001 par rapport au groupe témoin. f Image représentative de la rate (en haut à gauche), du foie (en bas à gauche) et analyse quantitative du poids de la rate (au milieu) et du poids du foie (à droite) à partir de souris de contrôle de brouillage et de souris Capg knockdown AML (n = 5 souris). Chaque point représente une souris. **p < 0,01, ***p < 0,001 par rapport au groupe témoin. g Coloration Wright-Giemsa d'un frottis sanguin de souris témoins et de souris Capg knockdown AML. Barre d'échelle 20 µm. h Analyse de survie de souris transplantées avec des cellules de contrôle de brouillage ou des cellules AML knockdown Capg. Les données présentées sont combinées à partir de deux greffes indépendantes (n = 5 souris). p = 0,0018, test du log-rank.

Pour évaluer les effets de la réduction de Capg, nous avons d'abord trié les cellules de leucémie à protéine fluorescente verte (GFP) + de souris Vector et shCapg AML et avons prouvé que les niveaux d'expression du groupe shCapg étaient réduits par RT-qPCR et western blot (Fig. 5b, c).

Nous avons constaté que la déficience en Capg épuisait de manière significative les cellules AML dans le sang périphérique (PB) (Fig. 5e) et réduisait la charge de morbidité dans la moelle osseuse (Fig. 5d).

De plus, la rate et le foie des souris AML étaient considérablement agrandis, tandis que le renversement de Capg soulageait considérablement ces symptômes (Fig. 5f). De manière cohérente, l'analyse histologique a montré que les souris AML du groupe shCapg avaient moins d'infiltration de cellules leucémiques dans le sang périphérique (Fig. 5g). Il est important de noter que le renversement de Capg a prolongé de manière significative la survie des souris AML, la survie globale médiane (MOS) étant passée à 83 jours dans le groupe shCapg contre 51 jours dans le groupe témoin (Fig. 5h). Ces résultats indiquent que le renversement de Capg supprime la progression de la LAM induite par MLL-AF9 chez la souris, ce qui confirme notre hypothèse selon laquelle Capg est oncogène dans la LAM.

En outre, résumez le schéma, CAPG agit sur la voie de signalisation NF-κB par les interactomes protéiques pour activer l'expression des gènes en aval. Il peut accélérer la progression de la LAM en se liant directement aux régions des facteurs de transcription de la famille NF-κB et en activant la régulation de l'expression des gènes en aval.

Pris ensemble, les données montrent que le CAPG joue un rôle important dans la progression de la LAM en régulant la voie de signalisation NF-κB. Notre étude a identifié un gène CAPG associé à un super-amplificateur comme oncogène dans la LMA, ce qui a conféré une nouvelle cible de traitement pour la thérapie de la LMA.

Les modifications épigénétiques jouent souvent un rôle clé dans l'apparition et le développement de diverses tumeurs, et les super-amplificateurs (SE) sont un élément épigénétique qui peut réguler l'expression des gènes spécifiques au type de cellule et jouer un rôle crucial dans les décisions du destin cellulaire, y compris la transcription des molécules de point de contrôle immunitaire des cellules tumorales23, l'échappement immunitaire25,26 et l'expression des cytokines inflammatoires24. L'analyse de l'ARN-seq au niveau du transcriptome peut générer un grand nombre de gènes exprimés de manière différentielle, ce qui rend difficile l'identification des gènes qui ont un impact significatif sur la progression de la maladie. En revanche, les super-amplificateurs sont hautement spécifiques au type de cellule et ont de puissantes fonctions de régulation de l'expression génique, qui peuvent piloter l'expression de gènes qui contrôlent et définissent l'identité cellulaire16. En intégrant des données de super-enhancer avec des données transcriptomiques, nous pouvons réduire la plage cible et améliorer la précision. Il reste à vérifier et à explorer si la combinaison de SE spécifiques de type cellulaire et de la transcriptomique peut permettre un dépistage plus précis et efficace des gènes pro-tumoraux.

Dans cette étude, nous avons identifié les gènes associés au SE en intégrant des SE spécifiques aux cellules avec des données d'ARN-seq et avons trouvé six gènes (CAPG, CD207, GPR132, SLC7A11, HIPK3 et FCER1G) qui sont corrélés à un mauvais pronostic chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë (LMA) selon la base de données TCGA-LAML. CD207 est un récepteur glycosylé qui agit comme un récepteur spécifique des cellules de Langerhans, traitant l'antigène pour le présenter aux cellules T48. GPR132 est un récepteur orphelin de la leucémie qui a le potentiel de déclencher la différenciation myéloïde49. Chez les patients atteints de leucémie myéloïde aiguë, une expression élevée de SLC7A11 est associée à un mauvais pronostic50,51. HIPK3 est impliqué dans le processus d'apoptose et est associé à un mauvais pronostic dans divers types de cancer52. Le FCER1G, en tant que composant du récepteur d'immunoglobuline E (IgE) de haute affinité, est associé à la réponse immunitaire dans divers types de cancer53,54. Il a été rapporté que le CAPG est étroitement associé aux protéines-tyrosine kinases dans la LAM, lié à la résistance aux médicaments dans la LAL55,56, et est associé à un mauvais pronostic dans le cancer du pancréas38 et du sein31,39. Il a été rapporté que CAPG était étroitement associé aux protéines-tyrosine kinases dans la LMA et lié à la résistance aux médicaments dans la LAL55,56. Ensuite, nous avons vérifié la fonction de Capg dans l'AML dans un modèle de souris et avons découvert qu'une expression réduite de Capg pouvait entraver la progression de la maladie AML. Prises ensemble, ces données suggèrent que le gène CAPG associé au super-amplificateur est une cible thérapeutique potentielle pour la LMA, et la fiabilité de l'approche d'analyse intégrée basée sur le super-amplificateur, également un outil prometteur pour prédire les biomarqueurs des maladies.

Les super-amplificateurs jouent un rôle important dans la tumorigenèse et la progression tumorale. Dans cette étude, nous avons trouvé le gène apparenté CAPG à travers le super-amplificateur et vérifié son rôle dans la LAM. Le mécanisme biologique fondamental est la promotion de l'AML par l'activation de l'expression de la leucémogenèse en aval par l'élément épigénétique SE, est un événement classique de la transition du destin cellulaire par des altérations épigénétiques dynamiques. Notre étude démontre au niveau génomique que le knockdown CAPG a entravé la progression de la maladie AML. La technologie d'édition de gènes permet des altérations moléculaires précises au niveau du génome pour le traitement de nombreuses maladies57. Ces dernières années, l'application de la technologie CRISPR à la modification moléculaire épigénétique a été fructueuse58. L'utilisation de CRISPR-dCas9 combiné à l'histone désacétylase pour effacer les modifications des histones et diminuer l'activité de la SE aura le potentiel de restreindre l'expression des gènes liés à la SE et d'entraver la progression de la maladie59. Nous supposons qu'au niveau épigénétique, l'expression du proto-oncogène CAPG sera réduite par l'activité inhibitrice de SE, ce qui limitera la progression de l'AML.

L'instabilité génomique et les anomalies épigénétiques peuvent directement faciliter l'apparition de la maladie. Il a été rapporté que les altérations épigénétiques, y compris la méthylation de l'ADN, la modification des histones et l'accessibilité de la chromatine jouent un rôle majeur dans la régulation de l'expression génique. Selon le "dogme central génétique" de la biologie moléculaire, l'information génétique est transmise par le biais de l'ADN-ARN-protéine. En tant que dernier maillon de ce processus, les protéines fonctionnent comme le principal entrepreneur du mouvement vital en formant des complexes macromoléculaires. Il existe de plus en plus de preuves décrivant le caractère essentiel des interactions protéine-protéine (IPP) régissant un large éventail de processus cellulaires.

Il a été rapporté que CAPG était une protéine de liaison à l'actine de la superfamille des gelsolines, associée à l'organisation du cytosquelette. Une expression accrue de CAPG a été trouvée dans plusieurs cancers métastatiques, suggérant son rôle dans l'invasion des cellules cancéreuses et les métastases60,61,62. Par conséquent, nous avons identifié les interactomes CAPG par immunoprécipitation avec spectrométrie de masse (IP-MS). Nous avons découvert dans l'interactome CAPG des composants de complexes protéiques régulateurs tels que le complexe NSL de protéine de remodelage de la chromatine, le complexe SNW1, le complexe MLL1-WDR5 et la protéine enzymatique de modification impliquant le complexe WMM. Plusieurs études indépendantes ont trouvé un lien physique entre l'agressivité du cancer et ces complexes régulateurs épigénétiques. Il est bien établi que le complexe NSL est corrélé à l'agressivité du cancer63 et à une faible survie64,65. De plus, la perturbation de l'interaction MLL1-WDR5 est considérée comme une approche thérapeutique pour la leucémie66. Indiquant l'importance de ces voies et facteurs de régulation épigénétiques pour la progression de la LAM. Ensuite, nous avons analysé la fonction moléculaire des partenaires d'interaction et découvert que trois d'entre eux (CCAR2, RPL4, ZFP91) ont été signalés comme activateurs de la voie de signalisation NF-κB. CCAR2, connu sous le nom de DBC1, peut réguler les anoikis via la voie NF-κB40,67. CCAR2 stimule la phosphorylation de relA nucléaire (RelA), améliorant l'activité transcriptionnelle de NF-κB et régulant à la hausse les gènes cibles associés à la résistance à l'anoikis40,67. Pendant ce temps, RPL4 et ZFP91, en tant qu'activateurs de la voie NF-κB, induisent la prolifération et favorisent le processus de cancer41,68,69. ZFP91 favorise la prolifération des cellules cancéreuses et la carcinogenèse en activant la protéine de corégulation transcriptionnelle HIF-1 via NF-κB68. RPL4 impliqué dans un complexe protéique ribosomique qui active NF-κB via CD4041. SWNI est également lié à la voie NF-κB dans l'interactome CAPG, son implication implique la liaison au NF-κB pour faciliter l'élongation transcriptionnelle des gènes cibles43. Les résultats ci-dessus indiquent que CAPG participe à la régulation des transductions de signal NF-κB qui n'ont pas été rapportées auparavant.

De plus, nous avons utilisé les données CAPG ChIP-seq pour confirmer les résultats susmentionnés. En plus des rôles bien connus dans la liaison moléculaire et la structure du cytosquelette, GO et l'analyse des motifs ont montré que les gènes régulés par CAPG étaient fortement liés à la voie NF-κB. L'inactivation de CAPG a considérablement réduit l'expression des gènes en aval de NF-κB. Tout cela corrobore l'affirmation faite ci-dessus selon laquelle CAPG est impliqué dans la régulation de la voie de signalisation NF-κB. Cela indique que l'identification des interactions protéiques peut fournir une base pour l'étude des fonctions des protéines, et constitue un moyen important et une tendance future pour étudier les fonctions potentielles des gènes codants.

Pris ensemble, l'expression du gène CAPG associé au super-amplificateur correspond à la progression de la LAM et est liée à l'activation de la voie NF-κB. Nous avons en outre postulé que CAPG pourrait être une cible thérapeutique viable pour la LAM, et la fiabilité de l'algorithme analytique complet repose sur un super-amplificateur, également un outil potentiel pour prédire les biomarqueurs de pathologies.

Les cellules THP-1 de la lignée cellulaire monocytaire humaine ont été achetées auprès de Solarbio (Chine), ont été cultivées dans un milieu RPMI (Corning, 10-040-CV) additionné de 10 % de FBS et de 1 % de pénicilline et de streptomycine et ont été régulièrement testées négatives pour la contamination par les mycoplasmes par PCR. Les cellules ont été stimulées avec du TNF-α (10 ng/ml) en réactivant l'expérience de la voie NF-κB.

Pour identifier les activateurs typiques, nous avons d'abord cousu la base de données publique H3K27ac ChIP-seq (NE SRR1915572, MO SRR787551, HSPC SRR2094192, AML1# SRR3503794, AML2# SRR3503797, AML2# SRR3503801) avec des pics à 500 pb, mais les rediviser si le la couverture des écarts est supérieure à 0,4. Ensuite, l'amplificateur brut cousu avec H3K27ac aligné et les lectures d'entrée ont été utilisés pour exécuter l'algorithme ROSE. En bref, les amplificateurs constitutifs ont été cousus ensemble s'ils se trouvent à une certaine distance et classés en fonction de leur signal soustrait d'entrée de H3K27ac. Et puis, nous avons séparé les super-amplificateurs des amplificateurs typiques en identifiant un point d'inflexion du signal H3K27ac ; la pente ici était de 1. Enfin, nous avons classé les gènes en tant que gènes associés au SE par Rose GeneMapper pour annoter les gènes dans la plage de 50 kb des super-amplificateurs.

Les données AML ont été utilisées pour effectuer la validation avec la base de données (http://gibk21.bse.kyutech.ac.jp/PrognoScan/index.html)70 et la base de données Gene Expression Profiling Interactive Analysis (GEPIA) (http://gepia.cancer-pku.cn)71. La survie globale (SG) a été estimée à l'aide du test du log-rank, et une valeur p < 0,05 a été considérée comme indiquant des données statistiquement significatives.

L'ARN total a été extrait des cellules GFP+ triées à l'aide du réactif TRIzol (15596026, Invitrogen) et l'ADNc a été synthétisé à l'aide du PrimeScript™ RT Master Mix (RR036A, Takara). La qPCR en temps réel a été réalisée à l'aide de SYBR® Premix Ex Taq™ II (RR820A, Takara) sur le système Applied Biosystems™ 7500 (Thermo Scientific). Les données présentées représentent le changement de facteur (FC) du groupe expérimental par rapport au groupe témoin. En bref, ΔCt a été calculé comme ΔCt = Ct (gène test) - Ct (gène réf.). ΔΔCt a été calculé comme ΔΔCt = ΔCt (groupe expérimental) - ΔCt (groupe témoin). Le FC d'un gène test dans le groupe expérimental par rapport au groupe témoin a été calculé comme FC = 2 (-ΔΔCt). Chaque gène a été testé en triple dans chaque expérience indépendante, et toutes les expériences ont été triplées.

Les cellules 293 T ont été transfectées avec les plasmides rétroviraux MSCVMLL-AF9-IRES-GFP contenant les séquences d'ADNc MLL-AF9 et GFP. Des cellules de moelle osseuse de souris C57 traitées avec du 5-fluorouracile (5-FU) pendant 5 jours ont été infectées par le rétrovirus deux fois à 24 h d'intervalle. Les cellules infectées à 400 K ont été mélangées à des cellules protectrices à 100 K pour être injectées par voie intraveineuse à des souris receveuses WT irradiées avec une dose létale de 9 Gy. Le nombre d'animaux utilisés par expérience est indiqué dans les légendes des figures. Capg knockdown et control lentivirus ont été préparés par HEK293T transfecté par pLKO.1-puro avec les vecteurs d'encapsidation psPAX2, pMD2.G. Des cellules de moelle osseuse MLL-AF9-GFP+ ont été récoltées à partir de souris AML 35 jours après la transplantation. Ces cellules ont été infectées avec Capg knockdown ou lentivirus contrôle et ensuite sélectionnées par 1 mg/ml de puromycine pendant 72 h. Les cellules 200 K GFP + criblées par la puromycine ont été mélangées à des cellules protectrices 100 K pour injecter par voie intraveineuse à des souris receveuses CD45.2 + irradiées avec une dose sublétale de 4, 5 Gy.

Pour identifier les partenaires CAPG dans les cellules AML humaines, nous avons extrait les complexes protéiques CAPG de l'extraction nucléaire dans THP-1 par l'anticorps CAPG (ab181092, abcam). Les cellules THP-1 ont été étendues à 10 boîtes de 150 mm de diamètre pour la préparation de protéines totales. La protéine a été pré-clarifiée avec 0,5 ml de billes de protéine A + G Agarose (P2055, Beyotime) dans 16 ml de tampon IP DNP (20 mM HEPES, pH 7,9, 20 % glycérol, 100 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 0,2 mM EDTA, 0,02 % NP-40, 0,5 mM DTT, 0,2 mM PM SF, cocktail d'inhibiteurs de protéase à 0,1 %) pendant une nuit à 4 °C. Dans le même temps, 25 μg d'anticorps CAPG ou d'IgG (12-370, Millipore) ont conjugué des billes d'agarose à la protéine G en incubant dans un tampon IP DNP pendant une nuit à 4 ° C. Les extraits nucléaires pré-clarifiés ont été combinés avec les billes conjuguées à l'anticorps et mis en rotation pendant 5 h à 4 ° C. Après cinq lavages dans le tampon D (20 mM HEPES pH = 7,6, 0,2 mM EDTA, 1,5 mM MgCl2, 100 mM KCl, 20 % de glycérol) additionné de 0,02 % de NP-40, le matériau lié a été élué par ébullition pendant 5 min dans un tampon de chargement 2xSDS. Mettre la solution dans les colonnes de concentration, centrifuger 14 000 × g 30 min à 20 °C. Centrifugez jusqu'à ce que la solution approche 40 μl. Les échantillons ont ensuite été fractionnés sur des gels Omni-PAGE ™ Hepes-Tris (LK206, Epizyme) et colorés avec InstantBlue Protein Stain (AQ211, Analysis Quiz). Les produits d'une seule purification ont été soumis à un séquençage LC-MS/MS sur toute la voie et à une analyse des données. Deux répétitions biologiques ont été réalisées pour chaque anticorps.

Les fichiers MS bruts ont été analysés et recherchés dans la base de données de protéines basée sur les espèces des échantillons à l'aide de MaxQuant (1.6.2.10)72.

Selon l'intensité de chaque protéine dans l'échantillon, avec l'IgG témoin comme dénominateur et le groupe expérimental CAPG comme numérateur, la valeur de changement de pli a été calculée. Nous sélectionnons des protéines avec FC> 2 comme interactome de CAPG.

L'interaction protéique et les données complexes ont été accessibles directement depuis :

CHAINE Version11.5 (https://cn.string-db.org/)73,

CORUM Version3.0 (https://mips.helmholtz-muenchen.de/corum/#)74,

UniProt (https://www.uniprot.org/)75.

Le réseau PPI confirmé final a été évalué par la base de données STRING, et les individus reconnus ont été interagis par le logiciel Cytoscape Version 3.9.1.

1% de formaldéhyde dans du PBS a été utilisé pour réticuler les cellules pendant 10 min, suivi d'une trempe avec 125 mM de glycine sur de la glace. Les cellules ont été collectées et congelées rapidement dans de l'azote liquide, puis stockées à -80 ° C pour être utilisées. Les cellules réticulées congelées ont été décongelées sur de la glace puis remises en suspension dans du tampon de lyse I (HEPES-KOH 50 mM, pH 7,5, NaCl 140 mM, EDTA 1 mM, 10 % glycérol, 0,5 % NP-40, 0,25 % Triton X-100, inhibiteurs de protéase). Après rotation pendant 10 min à 4 ° C, les cellules ont été collectées et remises en suspension dans du tampon de lyse II (Tris-HCl 10 mM, pH 8, 0, NaCl 200 mM, EDTA 1 mM, EGTA 0, 5 mM, inhibiteurs de protéase). Après rotation pendant 10 min à 4 ° C, les cellules ont été collectées et remises en suspension dans un tampon de sonication (20 mM Tris-HCl pH 8, 0, 150 mM NaCl, 2 mM EDTA pH 8, 0, 0, 1% SDS et 1% Triton X-100, inhibiteurs de protéase) pour la sonication. Les lysats soniqués ont été clarifiés une fois par centrifugation à 16 000 × g pendant 10 min à 4 ° C. Le matériel d'entrée était réservé. Le reste a été incubé avec des billes magnétiques liées à l'anticorps CAPG (ab181092, abcam) pour enrichir les fragments d'ADN pendant une nuit à 4 ° C. Les billes ont été lavées avec un tampon de lavage (HEPES-KOH 50 mM pH 7,5, LiCl 500 mM, EDTA 1 mM pH 8,0, désoxycholate de Na 0,7 %, NP-40 1 %) et un tampon TE (Tris-HCl 10 mM pH 8,0, EDTA 1 mM, NaCl 50 mM) dans l'ordre. Les billes ont été retirées par incubation à 65 ° C pendant 30 min dans un tampon d'élution (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 10 mM EDTA, 1% SDS). Les réticulations ont été inversées pendant une nuit à 65°C. Pour purifier l'ADN élué, 200 mL de TE ont été ajoutés, puis l'ARN a été dégradé par incubation dans 8 μl de 10 mg/mL de RNase A à 37 °C pendant 2 h. La protéine a été dégradée par addition de 4 μl de protéinase K à 20 mg/mL et incubation à 55 °C pendant 2 h. Phénol : chloroforme : une extraction à l'alcool isoamylique a été réalisée suivie d'une précipitation à l'éthanol. L'ADN a ensuite été remis en suspension dans 50 ml de TE. La préparation de la bibliothèque a été réalisée avec un kit de préparation de bibliothèque d'ADN (Vazyme, # TD501), les bibliothèques ont été amplifiées pendant sept cycles et ont été sélectionnées en fonction de la taille avec des billes Beckman AMPure XP.

Pour l'alignement de la lecture et la quantification de l'expression, nous avons d'abord supprimé les lectures de faible qualité et coupé la séquence de l'adaptateur avec Trim Galore. Ensuite, nous avons mappé les lectures de fin de paire restantes sur le génome de référence à l'aide de STAR avec les bundles d'options ENCODE. À l'aide de HTSeq-count, nous avons compté les lectures mappées de manière unique, et normalisé le nombre de lectures par la moyenne tronquée des valeurs M (TMM), et l'avons transformé en lectures par kilobases par million de lectures (RPKM) par edgeR. Avec un seuil d'expression de RPKM R 1 dans au moins un groupe d'échantillons, nous avons supprimé les gènes peu abondants et détecté les gènes exprimés de manière différentielle à l'aide de edgeR. Les gènes ont été considérés comme exprimés de manière différentielle lorsque le taux global de fausses découvertes (FDR) < 0,01 et le changement de facteur est supérieur à 2,0.

Les fichiers Fastq ont été ajustés par TrimGalore (version 0.6.4, https://github.com/FelixKrueger/TrimGalore) et alignés sur le génome de référence mm9 à l'aide de Bowtie2 (version 2.2.5, http://bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2/) avec les paramètres par défaut. Les lectures avec un score de carte <30 et les duplications PCR ont été filtrées à l'aide de Samtools76 (version 1.9, http://samtools.sourceforge.net). Les lectures alignées sur les régions de la liste noire ENCODE (http://mitra.stanford.edu/kundaje/akundaje/release/ blacklists/) ont été supprimées via bedtools77 (version 2.29.1, https://bedtools.readthedocs.io/en/latest/). Les pics ont été appelés avec macs278 (version 2.1.2, paramètres : '-g mm -q 0.05 -m 5 50') en utilisant l'entrée comme contrôle. DiffBind (version 2.10.0) a été utilisé pour analyser les sites de liaison différentiels.

Prenez 20 à 30 μL de sang périphérique dans la veine caudale de la souris et ajoutez-le au tube d'anticoagulation. Prenez les cellules de moelle osseuse du fémur et du tibia des souris sacrifiées. Les globules rouges ont été lysés et les cellules de la moelle osseuse ont été filtrées à l'aide d'un tamis cellulaire de 100 mm. Anticorps monoclonaux contre Mac-1 (M1/70, Biolegend), Gr-1 (RB6-8C5, Biolegend), c-Kit (2B8, Biolegend), Lin mix (Gr1, CD4, CD3, CD8a, Ter119, B220, IgM) (Biolegend), CD34 (MEC14.7, Biolegend), Sca1 (D7, Biolegend), FcgRII/III (93, Biolegend) légende), IL-7Ra (A7R34, Biolegend) (tous utilisés 50 ng par million de cellules) ont été utilisés là où indiqué. Après incubation avec des anticorps, les échantillons ont été analysés à l'aide du cytomètre en flux Attune NxT (Thermo) et les résultats ont été analysés à l'aide du logiciel FlowJo. Ici, la 7-aminoactinomycine D (7-AAD) (A1310, Life Technologies) a été utilisée pour exclure les cellules mortes.

Des termes d'ontologie enrichis pour les protéines d'interactome CAPG ont été identifiés à l'aide de STRING. Le processus biologique GO, la fonction moléculaire GO et le composant cellulaire GO ont été référencés pour identifier les termes d'ontologie avec la valeur p ajustée <0,05.

Les données sont exprimées en moyennes ± SEM. Pour toutes les expériences, à l'exception de la détermination de la survie, les données ont été analysées par les tests t de Student, et les différences ont été considérées comme statistiquement significatives si p < 0,05. La survie des deux groupes a été analysée à l'aide d'un test du log-rank, et les différences ont été considérées comme statistiquement significatives si p < 0,05. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données présentés dans cette étude peuvent être trouvés dans des référentiels en ligne. Les noms du référentiel/des référentiels et le numéro d'accession se trouvent ci-dessous : NCBI BioProject PRJNA876046. Les informations sur les anticorps et les oligos peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 1 et 2. Les données sources pour l'IP-MS sont fournies dans les données supplémentaires 3. Les données CAPG KD RNA-seq peuvent être trouvées dans les données supplémentaires 4. Des analyses non recadrées des transferts ont été présentées dans la Fig. 7 supplémentaire. Des données supplémentaires étayant les résultats de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande.

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Nous tenons à remercier le Peking University Medicine Fund of Fostering Young Scholars' Scientific & Technological Innovation (BMU2022PYB014) soutenu par "les fonds de recherche fondamentale pour les universités centrales" ; Fonds d'amorçage pour la recherche scientifique du premier hôpital de l'Université de Pékin (2022SF09) ; Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC 81870127) (NSFC 82072369) (NSFC 82200178).

Département de laboratoire clinique, Premier hôpital de l'Université de Pékin, Pékin, Chine

Qian Ma et Haixia Li

Département d'hématologie, Septième hôpital affilié, Université Sun Yat-sen, Shenzhen, Chine

Minyi Zhao

Département d'hématologie, troisième hôpital affilié, Université Sun Yat-sen, Guangzhou, Chine

Bing long

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QM a conçu et réalisé la plupart des expériences et analysé les données. MZ et BL ont analysé les données. HL a supervisé le projet. Tous les auteurs ont contribué à l'article et ont approuvé la version soumise.

Correspondance à Haixia Li.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

La collecte d'échantillons a été approuvée par le comité d'examen institutionnel et le comité d'éthique du Premier hôpital de l'Université de Pékin.

Communications Biology remercie Rhys Morgan, Mohammad Azam et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs principaux de la manipulation : Georgios Giamas et Manuel Breuer. Un dossier d'examen par les pairs est disponible.

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Réimpressions et autorisations

Ma, Q., Zhao, M., Long, B. et al. Le gène CAPG associé au super-amplificateur favorise la progression de la LAM. Commun Biol 6, 622 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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Reçu : 28 août 2022

Accepté : 23 mai 2023

Publié: 09 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04973-1

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