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Oct 27, 2023

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Nature Génie biomédical

Nature Biomedical Engineering (2023)Citer cet article

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Pendant la chirurgie, un diagnostic histopathologique rapide et précis est essentiel pour la prise de décision clinique. Pourtant, la méthode courante de pathologie de consultation peropératoire est intensive en temps, en main-d'œuvre et en coûts, et nécessite l'expertise de pathologistes formés. Ici, nous montrons que les échantillons de biopsie peuvent être analysés dans les 30 minutes en évaluant séquentiellement les phénotypes physiques des cellules en suspension singularisées dissociées des tissus. La méthode de diagnostic combine la dissociation mécanique sans enzyme des tissus, la cytométrie de déformabilité en temps réel à des taux de 100 à 1 000 cellules s-1 et l'analyse des données par réduction de dimensionnalité non supervisée et régression logistique. Les paramètres de phénotype physique extraits d'images en fond clair de cellules individuelles distinguaient des sous-populations cellulaires dans divers tissus, améliorant ou même remplaçant les mesures de marqueurs moléculaires. Nous avons utilisé la méthode pour quantifier le degré d'inflammation du côlon et pour distinguer avec précision les tissus sains et tumoraux dans des échantillons de biopsie de souris et de côlons humains. Cette approche rapide et sans étiquette peut faciliter la détection peropératoire des changements pathologiques dans les biopsies solides.

Les modifications des propriétés physiques des cellules, telles que la taille, la forme ou la déformabilité des cellules, sont essentielles à la pathologie de certaines maladies et présentent un grand potentiel en tant que marqueur diagnostique ou pronostique1,2. Au cours des dernières décennies, divers outils ont été développés pour examiner les propriétés mécaniques des cellules, notamment l'aspiration par micropipette, la microscopie à force atomique, la rhéométrie des microbilles et les pièges optiques3,4. Le domaine a connu une augmentation exponentielle des publications suggérant une forte corrélation entre le phénotype mécanique cellulaire et l'état pathologique, notamment la septicémie5,6, le paludisme7, le diabète8, la drépanocytose9 et le cancer10,11,12. Malheureusement, ces techniques conventionnelles souffrent d'un faible débit cellulaire et de l'exigence de connaissances spécialisées approfondies pour le fonctionnement, ce qui limite leur utilisation en tant qu'outil de diagnostic. La cytométrie de fluorescence et de déformabilité en temps réel (RT-FDC)13,14 est l'une des nombreuses nouvelles techniques microfluidiques10,15,16,17,18,19,20,21,22 qui ont surmonté ces inconvénients, permettant l'évaluation des propriétés physiques de cellules individuelles sans étiquette et à haut débit, ouvrant une nouvelle voie au diagnostic clinique. La RT-FDC est non seulement rapide (jusqu'à 1 000 cellules analysées par seconde), mais en plus de la déformabilité cellulaire, elle fournit également des informations multidimensionnelles obtenues directement à partir d'images cellulaires. Le potentiel diagnostique de la RT-FDC a été démontré dans de nombreuses maladies humaines allant de la leucémie aux infections bactériennes et virales, y compris la maladie à coronavirus 2019 (réfs.23,24,25,26,27). Cependant, jusqu'à présent, l'applicabilité de la technique était limitée à l'analyse de cellules cultivées ou de biopsies liquides de sang ou de moelle osseuse.

La biopsie des tissus solides est la méthode la plus courante pour caractériser la malignité et est fondamentale pour guider les chirurgiens lors de la prise en charge peropératoire et périopératoire des patients atteints de cancer. L'évaluation diagnostique des biopsies de tissus solides est généralement réalisée par le biais d'une consultation pathologique peropératoire, qui repose sur l'analyse histopathologique de coupes de biopsie congelées28. Le flux de travail conventionnel du diagnostic peropératoire implique de nombreuses étapes de traitement, des réactifs de coloration et l'inspection microscopique des tranches de tissu par des pathologistes expérimentés pour une analyse experte. De plus, la préparation des échantillons demande beaucoup de temps, de ressources et de main-d'œuvre. Des flux de travail alternatifs ont été proposés28, y compris la spectroscopie Raman stimulée29,30, la tomographie par cohérence optique31 et la microscopie à fluorescence32,33, mais n'ont pas encore été mis en œuvre. Le besoin d'une approche qui réduit la préparation des échantillons et le temps de diagnostic est donc imminent.

Dans cet article, nous présentons une méthode de diagnostic rapide et sans étiquette pour les biopsies de tissus solides. L'approche combine la dissociation mécanique sans enzyme des tissus à l'aide d'un broyeur de tissus (TG) pour l'isolement simple et rapide de cellules individuelles viables avec l'évaluation séquentielle des phénotypes physiques cellulaires de milliers de cellules individuelles à l'aide de RT-FDC. Tout d'abord, nous criblons un panel de différents tissus de souris et évaluons le rendement cellulaire, la viabilité et la faisabilité de la mesure RT – FDC lors de la dissociation mécanique du tissu. Nous illustrons la capacité de distinguer les sous-populations de cellules tissulaires uniquement sur la base des paramètres physiques dérivés de l'image sans connaissances préalables ni marquage moléculaire supplémentaire, ce qui peut améliorer la cytométrie en flux conventionnelle, qui s'appuie sur des panneaux multicolores de marqueurs pour identifier les cellules. Nous montrons également que notre approche peut déterminer les changements inflammatoires dans le tissu du côlon, sur la base de la mesure de la déformabilité cellulaire dans le système microfluidique. De plus, nous examinons des échantillons de biopsie congelés et frais de souris et de côlon humain et montrons que la RT-FDC peut distinguer les tissus sains des tissus cancéreux, en utilisant l'analyse en composantes principales (ACP) et l'apprentissage automatique sur les données multidimensionnelles. Les résultats démontrent que l'évaluation du phénotype physique des cellules individuelles dérivées de tissus à l'aide de la RT-FDC est une stratégie alternative pour détecter un état inflammatoire ou malin. Notre procédure, qui peut fournir des résultats en 30 minutes, a un potentiel en tant que pipeline de diagnostic peropératoire pour détecter avec sensibilité les changements pathologiques dans les biopsies et, plus généralement, pour identifier et caractériser les populations cellulaires dans les tissus de manière impartiale et sans marqueur.

Avant d'évaluer le phénotype physique des cellules, le premier défi à relever était l'extraction rapide de cellules individuelles à partir de tissus solides sur une échelle de temps de quelques minutes, tout en visant une représentation la plus précise possible de l'hétérogénéité des sous-populations cellulaires. Pour cela, nous avons utilisé un TG, un dispositif de dissociation mécanique basé sur des rangées de dents de broyage contrarotatives (Fig. 1) assemblées dans un tube Falcon35. L'appareil exécute automatiquement une séquence prédéfinie d'étapes alternées de coupe et de broyage pour isoler des cellules individuelles d'un tissu solide. Au total, dix tissus murins différents ont été traités à l'aide de protocoles TG ou enzymatiques conventionnels à des fins de comparaison (tableaux supplémentaires 1 et 2). La viabilité était de 70 à 90 % dans la plupart des tissus ; le rendement cellulaire était similaire à la dissociation enzymatique et dépendant des tissus (Extended Data Fig. 1). Le principal avantage de la dissociation mécanique était que le temps de traitement prenait moins de 5 minutes par échantillon, contre des dizaines de minutes voire plusieurs heures pour les protocoles enzymatiques. La rapidité de l'extraction contribue vraisemblablement à préserver les phénotypes biochimiques et biophysiques dans des conditions proches de celles in situ.

L'échantillon de tissu est disséqué en petits morceaux et placé dans le rotor interne de l'unité TG contenant le milieu de culture35. La dissociation mécanique est effectuée par une séquence préprogrammée et exécutée automatiquement de rotations dans le sens des aiguilles d'une montre et dans le sens inverse des aiguilles d'une montre. Les cellules dissociées sont centrifugées et remises en suspension dans un tampon de mesure. L'échantillon est chargé sur une puce microfluidique et analysé par RT-FDC. Une image en fond clair de chacune des 10 000 cellules en général est capturée. Diverses caractéristiques sont extraites des images, qui sont utilisées pour l'analyse multidimensionnelle. Au total, la procédure du tissu au résultat prend moins de 30 min.

Ensuite, les cellules individuelles extraites ont été analysées à l'aide de RT – FDC. Dans une mesure RT-FDC, des centaines de cellules par seconde, en suspension dans un tampon de méthylcellulose à haute viscosité, sont poussées à travers une constriction de canal microfluidique, où elles sont déformées par la contrainte de cisaillement et les gradients de pression et une image de chaque cellule est obtenue. Plusieurs paramètres physiques ont été calculés à partir des images en temps réel, à savoir la déformation, la taille des cellules, la luminosité, l'écart type de luminosité, le rapport d'aspect et le rapport de surface (pour plus de détails, voir le tableau supplémentaire 3). De plus, le module de fluorescence14 a été utilisé pour détecter l'expression de marqueurs de surface cellulaire.

Des exemples illustratifs de la distribution des paramètres physiques des cellules extraites du foie, du côlon et du rein sont présentés à la Fig. 2. Chacun de ces groupes était composé de cellules ayant un phénotype physique similaire (géré selon le tracé de densité) et une expression de marqueur de surface (Extended Data Fig. 2). Par exemple, un groupe de cellules ayant des propriétés physiques similaires (dans ce cas défini par la luminosité moyenne et la taille des cellules) était principalement composé de cellules positives pour la molécule d'adhésion des cellules épithéliales (EpCAM) (Fig. 2a), démontrant qu'une population propre de cellules épithéliales peut être distinguée sans étiquette, uniquement en utilisant des paramètres physiques dérivés de l'image.

a, Diagramme de dispersion illustratif de la luminosité moyenne en fonction de la taille des cellules pour les cellules isolées du foie montrant de nombreux amas de cellules. La population marquée de cellules (formant un amas de taille cellulaire de 25 à 50 μm2 et de luminosité moyenne de 100 à 115) est enrichie en cellules EpCAM-positives (épithéliales) mais dépourvue de cellules CD31-positives (endothéliales) ou de cellules CD45-positives (leucocytes). FITC, isothiocyanate de fluorescéine; PE, phycoérythrine ; APC, allophycocyanine. b, diagrammes de dispersion illustratifs de cellules du côlon colorées pour les marqueurs de surface cellulaire EpCAM et CD45. Au sein de la population EpCAM-positive, sept sous-populations de cellules peuvent être identifiées sur la base de tracés de densité de paramètres physiques, tels que la luminosité et la taille des cellules. c, diagrammes de dispersion illustratifs de cellules rénales colorées pour EpCAM et CD45. Au sein de la population CD45, quatre sous-populations sont identifiées sur la base de similitudes dans la taille et la déformation des cellules. La carte de couleurs dans les nuages ​​de points représente la densité d'événements.

La figure 2b,c illustre l'avantage d'utiliser le phénotypage physique basé sur l'image en plus d'utiliser la cytométrie en flux conventionnelle basée sur la fluorescence seule. Dans la cytométrie en flux conventionnelle, il n'est guère possible de distinguer des sous-populations individuelles de cellules épithéliales (EpCAM +) à moins que des panneaux supplémentaires d'anticorps fluorescents contre des types de cellules connus et prédéfinis ne soient utilisés. La distinction de diverses sous-populations a été possible avec la RT-FDC en raison de la profondeur d'information supplémentaire fournie par les paramètres de phénotype physique. Dans les cellules épithéliales du côlon, nous avons identifié sept groupes de cellules uniquement en fonction de leur luminosité et de leur taille (Fig. 2b). De même, au sein de la population de leucocytes (CD45 +) du rein, nous avons trouvé quatre groupes différents en fonction de la taille des cellules et des paramètres de déformation (Fig. 2c). Nous notons qu'en utilisant la modalité de tri récemment développée pour RT – FDC36, n'importe laquelle de ces populations cellulaires peut être isolée en fonction des paramètres dérivés de l'image et analysée pour son identité moléculaire, par exemple, par séquençage ultérieur de l'ARN.

La RT-FDC peut également être utilisée pour capturer les interactions cellulaires. En utilisant les paramètres de rapport d'aspect et de taille de cellule, nous avons identifié des doublets cellulaires dans des échantillons de thymus, de rate et de rein. De nombreux doublets étaient composés de deux types de cellules différents, selon les marqueurs de surface cellulaire (Extended Data Fig. 3). La position de la cellule dans le canal en combinaison avec la position du pic de fluorescence nous a permis d'identifier, par exemple, qu'un doublet était composé d'un leucocyte (CD45 +) et d'une cellule endothéliale (CD31 +) (Extended Data Fig. 3b, d, f). À l'aide du module de tri RT – FDC36, les doublets cellulaires peuvent être isolés sans étiquette pour une analyse moléculaire plus approfondie et des applications en aval, y compris des études sur les cellules immunitaires en interaction physique dans les tissus37.

Une question importante à considérer lors de l'utilisation de la dissociation mécanique des tissus et de l'analyse sans étiquette par phénotype physique est de savoir si cette approche représente fidèlement la distribution des types de cellules présentes dans le tissu. Bien que cela soit impossible à évaluer pour tous les tissus et applications en général, il est instructif d'examiner de plus près le foie en tant que tissu spécifique (données étendues Fig. 4a–c). La dissociation mécanique semble moins perturbatrice pour les cellules sensibles telles que les hépatocytes, qui sont sujettes à la mort cellulaire et souvent perdues lors des procédures d'isolement standard38. Lors de la dissociation du tissu hépatique murin, les cellules au-dessus de 150 μm2 dans la section transversale des cellules (rayon d'environ 7 μm) ont été déterminées comme des hépatocytes en fonction de leur morphologie et de leur taille39. En tant que principal type de cellules parenchymateuses du foie, les hépatocytes représentent 70 % de la population de cellules hépatiques et occupent près de 80 % du volume du foie40. Dans la suspension cellulaire obtenue à l'aide de TG, la proportion d'hépatocytes par rapport aux cellules totales était en moyenne de 52,5 %, beaucoup plus proche de la représentation réelle dans les tissus par rapport aux 7,7 % pour la digestion enzymatique. De plus, des sous-populations distinctes d'hépatocytes ont pu être identifiées en fonction de la taille des cellules. Nous émettons l'hypothèse que ces populations correspondent à des hépatocytes de ploïdie différente, car le contenu en ADN est fortement corrélé au volume cellulaire41. Si elle est confirmée, par exemple, par corrélation avec une analyse quantitative de fluorescence de la quantité d'ADN dans chaque cellule, notre méthode pourrait servir d'outil pour la surveillance sans étiquette du vieillissement et des processus physiopathologiques dans le foie, qui sont liés à la proportion d'hépatocytes polyploïdes42. Dans d'autres tissus, tels que les poumons, les différences entre la dissociation mécanique et enzymatique n'étaient pas aussi importantes et aucune des deux techniques n'a biaisé une population cellulaire spécifique (Extended Data Fig. 4d). Cependant, pour l'applicabilité générale de notre approche aux diverses possibilités qu'elle ouvre pour l'analyse des tissus, bien sûr, d'autres travaux expérimentaux sont nécessaires.

Il existe des applications spécifiques, en particulier diagnostiques, de notre approche où la détermination fidèle du nombre de cellules initialement présentes dans le tissu in situ est moins importante. Après tout, les phénotypes physiques détectés reflètent également diverses réponses cellulaires au traitement de l'échantillon, l'adhésion des cellules les unes aux autres et à la matrice extracellulaire, ainsi que la connectivité et la résistance mécanique au sein du tissu. Tous ces aspects peuvent être altérés dans des conditions pathologiques et seraient repris par notre approche. Nous démontrons l'utilité diagnostique dans deux cas d'utilisation cliniquement pertinents spécifiques liés au côlon.

Les maladies inflammatoires de l'intestin (MICI), telles que la maladie de Crohn et la colite ulcéreuse, sont des troubles inflammatoires chroniques de l'intestin associés à une barrière épithéliale/muqueuse compromise et à l'activation/au recrutement des cellules immunitaires43. Bien que l'étiologie de l'IBD ne soit pas encore entièrement comprise, une grande partie de notre compréhension de l'IBD provient de modèles animaux expérimentaux d'inflammation intestinale. Un de ces modèles est le transfert adoptif de lymphocytes T naïfs dans des souris déficientes en Rag1 pour induire une colite expérimentale (modèle de transfert de lymphocytes T de colite chronique, désormais appelé colite de transfert). La gravité est ensuite couramment quantifiée via un score histopathologique généré à partir de lames colorées à l'hématoxyline et à l'éosine (H&E) du tissu du côlon.

Notre objectif était d'étudier les changements dans le phénotype physique des cellules du côlon au cours de la colite de transfert. Les diagrammes de dispersion de la déformation en fonction de la taille des cellules suggèrent une différence entre la maladie et les tissus sains (Fig. 3a), où les cellules des tissus malades semblent moins déformées que les cellules des tissus sains. Lors de l'examen des cellules CD45 + (Fig. 3b, c), il est devenu évident que les échantillons de colite de transfert étaient caractérisés par une forte abondance de leucocytes à faible déformation, probablement des lymphocytes. Dans l'ensemble, nous avons constaté une diminution significative de la déformation médiane avec une taille d'effet forte dans les échantillons de colite de transfert, accompagnée d'une augmentation significative du pourcentage de leucocytes, conformément à l'infiltration de lymphocytes transférés de manière adoptive (N = 14 ; Fig. 3d). La déformation médiane des cellules était fortement corrélée négativement au pourcentage de leucocytes, avec un coefficient de corrélation de Pearson de r (12) = -0, 69 ( P = 0, 0065; Fig. 3e). De plus, les valeurs médianes de la taille et de la déformation des cellules étaient liées à la notation experte H&E (Fig. 1 supplémentaire); bien que la corrélation par ajustement linéaire n'ait pas été possible. Les échantillons de colite de transfert avec un score H&E élevé présentaient une taille de cellule plus grande et une déformation plus faible par rapport aux tissus sains. Une observation remarquable était que le tissu sain était plus difficile à briser mécaniquement en cellules individuelles que le tissu malade, ce qui produisait plus d'événements à analyser.

a, diagrammes de dispersion de la taille des cellules par rapport à la déformation des cellules isolées à partir d'échantillons de tissu de colite de transfert (TC) par rapport au tissu sain du côlon murin (contrôle); avec les histogrammes correspondants de taille et de déformation des cellules. b, Les deux mêmes échantillons de côlon contrôlés pour les cellules CD45-positives, montrant l'enrichissement des leucocytes dans les échantillons de colite de transfert, accompagné de changements des paramètres de phénotype physique. La carte de couleurs dans les nuages ​​de points représente la densité d'événements. c, parcelles d'estimation de la densité du noyau des échantillons indiqués en a et b, avec des contours marquant les niveaux 0,5 (teinte claire, contour extérieur) et 0,95 (teinte foncée, contour intérieur). d, Quantification de la déformation médiane et du pourcentage de cellules CD45 positives (n = 14 animaux biologiquement indépendants sur trois expériences indépendantes). Les cases s'étendent du 25e au 75e centile avec une ligne à la médiane ; les moustaches couvrent 1,5 × l'intervalle interquartile. Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide du test U bilatéral de Mann-Whitney ; déformation médiane *P = 0,0227 et r = 0,55, % CD45+ **P = 0,0041 et r = 0,7 (r, taille d'effet). e, corrélation de Pearson bilatérale de la déformation médiane de toutes les cellules et de la proportion de leucocytes (cellules CD45+) ; P = 0,0065 et r = −0,69.

Nos observations selon lesquelles le phénotype physique des cellules change lors de l'inflammation, ainsi que les preuves croissantes que l'inflammation chronique est associée à la malignité44,45, nous ont amenés à supposer que notre approche pourrait détecter des changements dans les échantillons de biopsie des tumeurs. Nous confirmons cette possibilité pour les échantillons de souris et humains.

Des études antérieures ont trouvé des différences entre les propriétés mécaniques des cellules cancéreuses et leurs homologues sains11,12,46,47,48,49. Un inconvénient majeur de ces études est la préparation laborieuse des échantillons et le faible débit de mesure qui limite la conversion de ces études en approches de diagnostic réelles. Compte tenu de la rapidité de notre approche pour obtenir et analyser le phénotype mécanique de cellules individuelles à partir de tissus solides, nous avons exploré son potentiel pour détecter le cancer colorectal. Nous avons utilisé des souris déficientes en une protéine spécifique des cellules épithéliales intestinales avec un rôle clé dans l'intégrité épithéliale. Ces animaux développent spontanément des tumeurs du côlon. Nous avons examiné un total de 16 souris et comparé des cellules isolées de tumeurs avec des cellules d'une partie saine du côlon du même animal. Nous avons analysé les cellules supérieures à 60 µm2 (déterminées par la surface de section), car en dessous de ce seuil, l'échantillon était principalement composé de cellules immunitaires et de petits débris (Fig. 2 supplémentaire).

Nos résultats ont montré que le phénotype physique des cellules du tissu tumoral différait significativement des échantillons témoins. Des parcelles représentatives d'une seule souris sur les figures 4a à c démontrent que les cellules de la tumeur avaient une taille de cellule plus grande et une déformation plus élevée que leurs homologues sains. L'analyse des 32 échantillons a révélé que les cellules des tumeurs avaient une taille moyenne de cellule significativement plus élevée (Fig. 4d), une déformation (Fig. 4e) et un rapport de surface (Fig. 4g), avec des tailles d'effet modérées à fortes. Les échantillons de tumeurs présentaient également une plus grande hétérogénéité, démontrée par la distribution plus large de la Fig. 4c et des écarts-types significativement plus élevés de la taille des cellules et du rapport de surface (Fig. 4d, g).

a, b, diagrammes de dispersion de la taille des cellules en fonction de la déformation d'un échantillon témoin (a) de tissu du côlon murin par rapport au tissu tumoral (b). La carte de couleurs dans les nuages ​​de points représente la densité d'événements. c, parcelles d'estimation de la densité du noyau des échantillons indiqués en a et b, avec des contours marquant les niveaux 0,5 (teinte claire, contour extérieur) et 0,95 (teinte foncée, contour intérieur). Les histogrammes de taille et de déformation des cellules démontrent une plus grande hétérogénéité de la taille et de la déformation des cellules dans la tumeur (vert) par rapport au tissu témoin (violet). d–g, Moyennes et écarts-types des paramètres physiques du phénotype de 16 échantillons témoins (violet) et 16 échantillons tumoraux (vert) (n = 16 animaux biologiquement indépendants sur six expériences indépendantes). Les cases s'étendent du 25e au 75e centile avec une ligne à la médiane ; les moustaches couvrent 1,5 × l'intervalle interquartile. Les comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide du test de rang signé Wilcoxon bilatéral ; r, taille d'effet : taille de cellule (**P = 0,0019, r = 0,55), écart type de la taille de cellule (***P = 0,0005, r = 0,61) (d) ; déformation (*P = 0,026, r = 0,39), écart type de déformation (NS, non significatif) (e) ; rapport d'aspect (NS), écart type du rapport d'aspect (NS) (f); rapport de surface (**P = 0,0023, r = 0,54), écart type du rapport de surface (*P = 0,013, r = 0,44) (g). h, PCA d'échantillons de tissus du côlon de souris, où les points verts représentent les échantillons de tumeurs et les points violets représentent les échantillons de contrôle. Une analyse de régression linéaire a été effectuée sur PC1 et PC2 avec les deux catégories résultantes représentées par des couleurs de fond violet (contrôle) et vert (tumeur).

Nous avons ensuite étudié si les différences de phénotype physique pouvaient être exploitées pour la distinction fiable entre les tissus tumoraux et sains. Pour cela, nous avons divisé les cellules en trois catégories selon la taille des cellules (60–90, 80–120 et 120–400 μm2). Pour chaque catégorie de taille, 12 paramètres ont été dérivés : écart moyen, médian et standard de la taille de cellule, déformation, rapport d'aspect et rapport de surface ; additionnant jusqu'à un total de 36 paramètres pour chaque échantillon (Fig. 3 supplémentaire). Ces paramètres ont été utilisés pour l'ACP, Fig. 4h. Les deux composantes principales, PC1 (39,8 %) et PC2 (18,7 %), expliquent 58,5 % de la variance. L'importance relative des caractéristiques physiques dans la détermination des composants principaux est illustrée à la Fig. 3 supplémentaire. La caractéristique la plus dominante pour PC1 était la déformation des cellules entre 60 et 120 µm2, tandis que dans le cas de PC2, les paramètres de taille de cellule prévalaient. La régression logistique effectuée sur l'ACP (illustrée par la division linéaire de la Fig. 4h) a démontré que les informations condensées sur le phénotype physique représentées par les composants principaux suffisent à faire la distinction entre les tissus sains et tumoraux ; 29 échantillons sur 32 se trouvaient dans la bonne région. Enfin, nous avons analysé la corrélation entre la déformation et la taille des cellules et l'avons trouvée faible ou inexistante (Fig. 4 supplémentaire). Cela nous a amenés à conclure que la déformation et la taille des cellules étaient des prédicteurs indépendants de tumeurs dans des échantillons de côlon murin, démontrant davantage la valeur ajoutée de la déformation mesurée via RT – FDC en tant que marqueur de diagnostic.

Nous avons ensuite cherché à remettre en question notre méthode de détection de tumeurs à partir d'échantillons de biopsie humaine. Dans un premier temps, nous avons effectué une analyse RT-FDC sur des cellules isolées à partir de 13 échantillons de biopsie cryoconservés de cancer colorectal et de 13 échantillons de tissus environnants sains provenant des mêmes patients. L'ACP a été réalisée sur 45 paramètres (Fig. 5a et Supplémentaire Fig. 5) avec 41,7 % de la variance expliquée par les deux composantes principales (25,3 % et 16,4 % pour PC1 et PC2, respectivement) ; la sélection des paramètres RT–FDC a été optimisée pour obtenir une bonne séparation entre le tissu sain et tumoral. L'ACP a montré que les échantillons tumoraux et sains se séparaient bien le long de PC2, principalement par la déformation et l'écart type de luminosité des cellules supérieures à 100 µm2 (Fig. 5a). Les paramètres de taille cellulaire des cellules inférieures à 100 µm2 ont également contribué à la séparation des échantillons. L'exclusion du paramètre le plus important (déformation des cellules de plus de 100 µm2) a entraîné une moins bonne séparation entre les échantillons sains et tumoraux (Fig. 6 supplémentaire). Une régression logistique a été effectuée sur l'ACP (indiquée par la division linéaire dans le tracé de l'ACP) et utilisée pour prédire la classification de six échantillons en aveugle (représentés par des croix sur la Fig. 5a) ; les six échantillons ont été correctement classés comme tissu sain ou tissu tumoral, respectivement. Nous avons examiné le nombre minimal de cellules nécessaires pour une classification correcte de ces échantillons en aveugle (Fig. 7 supplémentaire). Environ 1 500 cellules d'un échantillon ont dû être analysées pour une classification correcte, correspondant à un temps de mesure RT-FDC d'environ 5 min.

Dans les tracés PCA à gauche, chaque point vert représente un échantillon de tumeur d'un patient ; les points violets représentent les tissus environnants sains correspondants du même patient. Une régression logistique a été effectuée sur chacune des PCA, les deux catégories résultantes étant représentées par des couleurs de fond violet (sain) et vert (tumeur). Les croix représentent des expériences en aveugle utilisées pour la validation du modèle formé. L'analyse de l'importance des caractéristiques à droite du tracé PCA montre l'importance codée par couleur de chaque caractéristique pour déterminer PC1 et PC2 pour ce tissu particulier ; l'axe des x répertorie les catégories de taille de cellule ; l'axe y répertorie les paramètres RT – FDC et leurs caractéristiques statistiques dérivées des cellules dans la catégorie de taille correspondante (entre parenthèses). sd, écart-type. a, PCA des paramètres RT – FDC de 32 échantillons de côlon congelés (16 biopsies tumorales et 16 échantillons de tissu sain environnant ; n = 16 échantillons biologiquement indépendants sur 16 expériences indépendantes). b, PCA des paramètres RT-FDC de 28 échantillons frais de biopsie du côlon (14 tumeurs, 14 sains ; n = 14 échantillons biologiquement indépendants sur 14 expériences indépendantes). c, PCA des paramètres RT-FDC de 18 échantillons de biopsie pulmonaire frais (9 tumeurs, 9 sains ; n = 9 échantillons biologiquement indépendants sur 9 expériences indépendantes).

Le court temps combiné de traitement et d'analyse (<30 min) et les résultats positifs obtenus sur des coupes de biopsie tissulaire congelées suggèrent l'utilisation de la méthode pour la pathologie peropératoire - l'examen d'un échantillon de biopsie d'un patient pendant la chirurgie. Pour explorer si même l'étape de congélation pouvait être omise, nous avons analysé des biopsies fraîchement excisées de patients atteints de cancer colorectal (N = 14). L'algorithme formé sur du tissu de côlon congelé n'a pas bien fonctionné pour le tissu frais, peut-être en raison de différences de phénotype physique entre le tissu congelé et frais (Extended Data Fig. 5). Par conséquent, une nouvelle PCA a été réalisée sur les données de biopsies fraîches du côlon dans deux catégories de taille (20–50 et 50–600 µm2) (Fig. 5b), où 68,5 % de la variance étaient expliquées par les deux composantes principales (36,5 % et 32 ​​% pour PC1 et PC2, respectivement). Ici, la déformation des cellules contribuait fortement à l'ACP et la taille des cellules était moins importante que les autres paramètres physiques du phénotype. Lors de la régression logistique, seuls 3 échantillons sur 22 utilisés pour l'ACP et 1 échantillon en aveugle sur 6 n'ont pas été correctement classés, ce qui pourrait être attribué à une hétérogénéité intertumorale ou intratumorale. Néanmoins, en utilisant notre approche sur des échantillons en aveugle, nous avons atteint une précision de 100 % dans la classification des échantillons sains et tumoraux à partir de biopsies congelées, et une précision de 83 % pour les échantillons de biopsie frais.

Pour valider notre méthode sur des tissus d'un organe différent, nous l'avons appliquée à des échantillons de biopsie pulmonaire fraîchement excisés de neuf patients atteints de cancer. L'ACP combinée à la régression logistique a facilement séparé sept échantillons sains de sept échantillons tumoraux et quatre autres échantillons aveugles ont été correctement classés (Fig. 5c). Dans l'ACP, 46,9 % de la variance étaient expliqués par PC1 et PC2 (31,2 % et 15,7 %, respectivement). Les paramètres de déformation ont fortement contribué à PC1, ce qui démontre à nouveau que l'information unique apportée par la mesure de la déformabilité cellulaire est utile pour faire la distinction entre la tumeur et le tissu sain.

Nous avons également testé la sensibilité de notre approche à la situation où seules quelques cellules cancéreuses sont présentes (tumeurs à faible cellularité tumorale et contenu de stroma tumoral desmoplasique étendu) ou restent (tumeurs après chimio ou radiochimiothérapie avec rémission presque complète) dans les échantillons de tissus disponibles. Cet aspect est particulièrement important pour les situations cliniques où l'analyse peropératoire est utilisée pour déterminer si la marge opératoire est exempte de cancer (appelées sections congelées), ce qui peut être particulièrement difficile lorsque très peu de cellules tumorales sont présentes. Nous avons réalisé une expérience dans laquelle nous avons analysé un mélange d'échantillons de tumeurs fraîches et de tissus pulmonaires sains à différents rapports (Fig. 8 supplémentaire). Un échantillon constitué de 50 % de tissu sain et de 50 % de tissu tumoral a été classé comme échantillon tumoral. Bien sûr, tout le tissu tumoral n'est pas constitué de cellules cancéreuses, de sorte que la sensibilité réelle pour détecter les cellules cancéreuses est ici plus élevée qu'apparente. En fait, certains des échantillons de tumeurs du côlon avaient un contenu stromal relativement élevé. Dans les cas extrêmes (tableau supplémentaire 5, échantillons de tissus du côlon congelés 7 et 11), le contenu stromal était de 98 % et 80 %, ce qui signifie que les patients n'avaient pratiquement aucune tumeur résiduelle après la radiochimiothérapie néoadjuvante. Pourtant, ces échantillons ont été correctement classés comme tumeur. Ce résultat est remarquable car il indique une solution possible au problème d'échantillonnage présent dans l'analyse histopathologique conventionnelle, en particulier dans les scénarios de coupe congelée. Le résultat de ce dernier dépend beaucoup de la question de savoir si le pathologiste inspecte et sélectionne l'emplacement correct des tissus où les cellules cancéreuses sont encore présentes. En raison des contraintes de temps et des limitations techniques de la préparation des diapositives dans les scénarios de coupe congelée, seule une petite fraction du spécimen de tissu réséqué total peut être visualisée. Si la dissociation du tissu en cellules individuelles et l'analyse d'un sous-ensemble aléatoire de celles-ci peuvent détecter avec sensibilité la présence d'aussi peu que 20 %, voire 2 %, de cellules cancéreuses présentes dans un échantillon de tissu donné, ce serait une nette avancée par rapport à l'état de l'art. Des recherches plus spécifiques sont nécessaires pour l'établir fermement. Enfin, notre méthode peut également détecter un cancer de bas grade, où toute différence dans les paramètres physiques devrait être plus difficile à détecter que dans le cancer de haut grade. La grande majorité des échantillons analysés étaient G2 (modérément différenciés) ou G3 (peu différenciés/indifférenciés, souvent également appelés « haut grade » ; Tableaux supplémentaires 5 à 10). Dans l'ensemble de données sur les tissus pulmonaires, l'un des échantillons a été classé comme le G1 de grade le plus bas (bien différencié; tableau supplémentaire 10). Par conséquent, la méthode n'est pas limitée au cancer de haut grade.

Nous avons montré une méthode simple et rapide pour le traitement et l'analyse des cellules de tissus solides, adaptée aux diagnostics basés sur la biopsie. La dissociation mécanique des tissus est suivie d'une analyse à haut débit des cellules en flux de déformation. En quelques minutes, des milliers de cellules sont imagées et diverses caractéristiques physiques du phénotype sont extraites de chaque image cellulaire. La méthode est sans étiquette et repose simplement sur des images en fond clair, contrairement aux outils de diagnostic moléculaire ou à la cytométrie en flux conventionnelle, où des réactifs coûteux ou des marqueurs fluorescents sont nécessaires. Surtout, les informations sont disponibles dans les 30 minutes suivant l'excision de la biopsie, ce qui peut être un avantage lorsqu'il est nécessaire de détecter rapidement la pathologie. C'est le cas lors d'une consultation peropératoire donnant des informations diagnostiques lors d'une chirurgie oncologique et définissant souvent la suite de l'intervention. Le flux de travail standard nécessite le transport de l'échantillon de biopsie au service de pathologie, où il est intégré dans un milieu de montage (composé à température de coupe optimale), congelé et coupé en fines tranches à l'aide d'un cryostat. Les lames sont ensuite préparées avec une coloration H&E, et les pathologistes évaluent de nombreuses caractéristiques, y compris la nature de la lésion (c'est-à-dire sa malignité) à l'aide d'un microscope30,50. Notre flux de travail contourne les étapes de congélation et de coloration, peut être effectué directement sur site et permet de détecter une malignité sur la base de l'évaluation automatisée des paramètres physiques de cellules individuelles.

Au-delà du diagnostic peropératoire, nous montrons que la méthode est utile pour l'examen rapide des échantillons de MICI. Le diagnostic clinique des MII nécessite dans la plupart des cas la combinaison de différents tests, y compris un test sanguin, un examen des selles, une endoscopie et une analyse histologique des biopsies muqueuses51,52. Le score histologique a une importance croissante dans les MII, car le niveau histologique d'inflammation est corrélé à la récurrence de la maladie, à la probabilité d'une intervention chirurgicale et au risque de cancer. Nous montrons que le degré d'inflammation tissulaire dans un échantillon de biopsie du côlon peut être obtenu en surveillant le phénotype physique des cellules via RT-FDC, en contournant le besoin de coloration ou d'évaluation par des experts. Nous envisageons que la méthode pourrait être utilisée pour surveiller les changements inflammatoires temporels afin d'évaluer la progression de la maladie et la réponse au traitement, et pour fournir un système de notation diagnostique objectif pour la pratique clinique quotidienne, qui fait actuellement défaut pour les MII.

Des études antérieures sur les cellules cancéreuses ont montré une forte corrélation entre la malignité et les propriétés mécaniques des cellules10,11,12,46,49,53. Ici, nous exploitons cette corrélation pour détecter la malignité dans les biopsies de tissus humains. La RT-FDC sonde la déformabilité cellulaire, à un débit élevé, en exposant les cellules à un flux de cisaillement dans un canal microfluidique ; et il permet le phénotypage mécanique de cellules individuelles, en utilisant un modèle analytique et des simulations numériques54,55. En supposant une cellule sphérique initiale dans des conditions normales (sans contrainte), la RT – FDC peut fournir un module d'élasticité comme mesure quantitative de la rigidité de la cellule. Cependant, dans des échantillons de tissus hétérogènes, tels que ceux utilisés dans cette étude, les cellules ne sont souvent pas sphériques avant d'entrer dans le canal microfluidique et un module d'élasticité ne peut pas être obtenu. Néanmoins, le degré de déformation dans ce test de déformation standard peut être interprété comme une mesure qualitative de la déformabilité et les informations de déformation inhérentes aux images se révèlent être un marqueur de diagnostic précieux. L'ACP d'échantillons de côlon murin et de biopsies colorectales humaines a révélé que la déformation cellulaire dans des conditions d'écoulement de canal normalisées est essentielle pour faire la distinction entre les tissus sains et tumoraux dans les types de biopsie examinés. Cela met en évidence le caractère unique de l'information apportée par cette méthode, actuellement absente des pratiques diagnostiques de routine qui, jusqu'à présent, reposent principalement sur l'évaluation histologique. Suite à cette étude de preuve de concept, il sera nécessaire d'étudier si la méthode peut être adaptée à différents types de cancers ou de tissus. Nous nous attendons à ce que les changements de déformabilité cellulaire se manifestent davantage dans certains types de cancer que dans d'autres. Il peut y avoir certains domaines d'application où la méthode a le potentiel d'améliorer la pratique du diagnostic.

Pour une utilisation clinique pratique, il sera avantageux d'intégrer le traitement des tissus et l'analyse du phénotype unicellulaire dans un seul pipeline automatisé. Bien que la dissociation mécanique à l'aide d'un TG soit un moyen efficace d'obtenir des cellules individuelles à partir de tissus pour des applications de diagnostic, il sera important de réduire les étapes de manipulation manuelle, telles que le filtrage et la concentration des cellules. Cependant, même dans son état actuel, il est plus rapide et plus rentable que le traitement enzymatique des tissus. Un avantage clé de la dissociation mécanique était que le temps de traitement prenait moins de 5 minutes par échantillon, par opposition à des dizaines de minutes voire plusieurs heures pour les protocoles de dissociation enzymatique. De plus, les protocoles enzymatiques nécessitent généralement des réactifs dépendants de l'échantillon qui sont souvent coûteux et nécessitent des conditions de stockage particulières, alors que la dissociation mécanique peut être effectuée dans un milieu de culture standard. Bien que différents protocoles enzymatiques enrichissent souvent pour des types de cellules spécifiques56, nous pensons que la suspension unicellulaire de la dissociation mécanique pourrait être plus représentative des populations réelles dans les tissus, et qu'elle convient donc à un examen impartial du paysage cellulaire. La dissociation rapide a également le potentiel de préserver les propriétés biochimiques et biophysiques des cellules dans un état proche de in situ ; ces propriétés sont susceptibles de se détériorer avec des temps de traitement plus longs dans d'autres approches. En raison de la vitesse de dissociation mécanique, les cellules pourraient subir moins de changements protéomiques ou transcriptionnels, qui sont connus pour se produire pendant le traitement enzymatique34,57,58,59,60. D'autres études comparatives et moléculaires sont nécessaires pour évaluer ces hypothèses.

À l'avenir, des enquêtes sur des cohortes de patients plus importantes permettront d'exploiter l'apprentissage automatique pour la prise de décision diagnostique ou pronostique. L'intelligence artificielle aide déjà les pathologistes à inspecter des images histologiques de lames entières, à diagnostiquer un cancer ou à classer des tumeurs61,62,63. Les grands ensembles de données obtenus par analyse RT-FDC, composés de milliers d'images cellulaires et d'informations multidimensionnelles, se prêtent à de telles approches d'intelligence artificielle. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur les paramètres calculés à partir d'images en temps réel, mais des paramètres de phénotype physique supplémentaires peuvent être calculés après l'acquisition et utilisés comme entrées supplémentaires pour l'apprentissage automatique, telles que les caractéristiques de forme ou de texture. Les travaux futurs se concentreront également sur la corrélation entre les données de phénotype physique et le score de malignité tumorale, le potentiel métastatique et le taux de survie.

Enfin, un aspect important de la méthode est que le phénotype physique des cellules peut être utilisé pour identifier les populations cellulaires dans les tissus, soit de manière entièrement sans étiquette, soit en synergie avec des marqueurs moléculaires, améliorant les mesures de fluorescence. De plus, grâce à la modalité de tri récemment ajoutée à la RT-FDC36, une population spécifique de cellules peut être isolée selon des paramètres calculés à partir d'images en temps réel ou à l'aide de réseaux de neurones entraînés64,65. Cela pourrait être utilisé pour l'enrichissement de populations cellulaires non caractérisées dans les tissus pour l'analyse omiques en aval ou même à des fins de médecine régénérative, comme pour l'isolement sans étiquette de cellules souches dérivées de tissus.

Dans l'ensemble, nos résultats montrent que le phénotypage physique des cellules via RT – FDC après dissociation mécanique des tissus sans enzyme est une méthode simple et rapide qui peut être utilisée pour diagnostiquer les états pathologiques dans les biopsies tissulaires. En particulier, il peut fournir une prédiction rapide et impartiale de l'état de la maladie dans des conditions inflammatoires et en cas de malignité.

Toutes les expérimentations animales ont été menées en collaboration avec le Département de médecine interne 1, Hôpital universitaire d'Erlangen, conformément à toutes les directives institutionnelles et éthiques, et couvertes par les licences animales appropriées (Tierversuchsantrag no. 55.2.2- 2532-2-1032/55.2.2- 2532-2-473). Les études animales ont été menées en fonction du sexe et de l'âge en utilisant des compagnons de portée pour chaque expérience. Des animaux mâles et femelles ont été utilisés. Toutes les souris ont été maintenues dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes. Les souris ont été systématiquement testées pour les agents pathogènes conformément aux directives de la Fédération européenne des associations scientifiques des animaux de laboratoire. Les souris ont été hébergées dans un cycle lumière-obscurité de 12 h, à 20-23 °C et 40-60 % d'humidité. Les expériences ont été réalisées conformément aux directives du Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux du gouvernement de l'État de Moyenne-Franconie. Les animaux ont été tués par dislocation cervicale et les organes ont été prélevés chirurgicalement. Pour la comparaison du traitement enzymatique et TG, des souris femelles et mâles C57BL/6J ont été utilisées, âgées de 8 à 19 semaines. La perfusion des tissus pulmonaires et hépatiques a précédé le processus de dissociation enzymatique. Pour la dissociation mécanique à l'aide d'un TG, les organes ont été soigneusement lavés avec une solution tampon phosphate (PBS) avant d'être placés dans le milieu d'Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) additionné de 2 % de sérum bovin fœtal (FBS) et placés sur de la glace jusqu'à un traitement ultérieur. Les protocoles enzymatiques ont été obtenus à partir de la littérature et sont résumés dans le tableau supplémentaire 1. Pour les protocoles enzymatiques et le TG, le poids du tissu utilisé a été enregistré. A la fin de la procédure de dissociation, le rendement cellulaire total a été compté à l'aide d'un compteur de cellules LUNA.

Des souris Rag1−/− immunodéficientes ont reçu 1 million de lymphocytes T CD4+ CD25− par injection intrapéritonéale. Des cellules mononucléaires ont été isolées de la rate de souris donneuses C57/BL6 et purifiées à l'aide de la technologie de tri cellulaire activé magnétiquement, avant d'être injectées à des souris immunodéficientes comme décrit précédemment66,67. Les animaux ont été tués 3 semaines après le transfert cellulaire et le tissu du côlon a été traité comme décrit dans la section « Dissociation des tissus et préparation d'une seule cellule ».

Pour générer une délétion spécifique d'une protéine spécifique aux cellules épithéliales intestinales jouant un rôle clé dans l'intégrité épithéliale, des souris porteuses de LoxP-Cre flanquées pour la protéine spécifique ont été croisées avec des souris VillinCre. Une tumorigenèse spontanée a été observée dans le côlon avec une pénétrance de 100 %.

Des échantillons de biopsie humaine réséqués chirurgicalement (obtenus auprès de l'Institut de pathologie d'Erlangen) provenant de tumeurs ou de tissus sains ont été immédiatement placés dans un milieu DMEM avancé additionné de 10 % de FBS, 1 % de GlutMAX, 1 % d'HEPES et 1 % de pénicilline/streptomycine et conservés à 4 °C, traités immédiatement ou congelés dans de l'azote liquide pour une utilisation ultérieure. Des paires appariées d'échantillons ont été analysées, avec deux échantillons provenant de chaque patient : un échantillon de tumeur et un échantillon de contrôle provenant de tissus sains entourant la tumeur.

Les échantillons de biopsie n'ont pas été prélevés spécifiquement pour cette étude de recherche, mais faisaient partie des pratiques standard de soins aux patients. Le consentement éclairé a été obtenu des patients fournissant des échantillons et toutes les expériences ont été réalisées conformément à la déclaration d'Helsinki. Le protocole d'obtention d'échantillons de biopsie humaine pour cette étude a été approuvé par des votes éthiques de l'hôpital universitaire de l'université Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg (24 janvier 2005, 18 janvier 2012 ; comité d'examen institutionnel de l'hôpital universitaire de l'université Friedrich-Alexander Erlangen-Nürnberg numéro d'approbation : Re.-No. 4607).

Les tableaux supplémentaires 5 à 10 présentent les caractéristiques de la population et les informations pathologiques pour tous les échantillons humains analysés. Les lymphocytes infiltrant la tumeur stromale et le contenu du stroma des tumeurs ont été notés par les pathologistes comme décrit précédemment68.

La dissociation des tissus à l'aide d'un TG (Fast Forward Discoveries GmbH) a été réalisée, comme décrit dans les réf. 34,35. En bref, l'échantillon de tissu a été coupé en petits morceaux d'environ 1 à 2 mm et placé dans l'unité de rotor du TG avec 800 μl de DMEM additionné de 2 % de FBS. L'unité de rotor a été positionnée dans le couvercle d'un tube Falcon de 50 ml ; l'insert de stator avec un tamis cellulaire de 100 μm a été placé au-dessus de l'unité de rotor. Un tube Falcon de 50 ml a été placé sur le couvercle, vissé et positionné sur le dispositif TG (Fig. 1). Les paramètres du processus de broyage pour chaque type de tissu sont résumés dans le tableau supplémentaire 2. Les protocoles TG ont été fournis par le fabricant avec quelques modifications mineures34,35. Après la procédure de broyage, le tube Falcon a été renversé sur un portoir, ouvert et le tamis cellulaire a été lavé avec 5 ml de DMEM, 2 % de FBS. Le flux a été transféré dans un tube Falcon de 15 ml et centrifugé pendant 8 min à 300 g. Par la suite, le surnageant a été aspiré et le culot cellulaire lavé avec 2 ml de PBS, 2% de FBS, passé à travers un tube à fond rond de cytométrie en flux avec un bouchon de filtre cellulaire et une centrifugeuse à 300 g pendant 5 min. Le culot cellulaire a été remis en suspension dans le tampon de mesure à haute viscosité préparé à l'aide de 0,6 % (p/p) de méthylcellulose (4 000 cPs ; Alfa Aesar) dilué dans du PBS sans calcium ni magnésium, ajusté à une osmolalité de 270 à 290 mOsm kg-1 et pH 7,4. La viscosité du tampon a été ajustée à (25 ± 0,5) mPa s-1 à 24 °C à l'aide d'un viscosimètre (HAAKE Falling Ball Viscometer Type C, Thermo Fisher Scientific).

Les mesures RT – FDC ont été effectuées comme décrit précédemment13,14, à l'aide d'un instrument AcCellerator (Zellmechanik Dresden GmbH). La suspension cellulaire a été aspirée dans une seringue Luer-Lok de 1 ml (BD Biosciences) attachée à une pompe à seringue et reliée par un tube PEEK (IDEX Health & Science LLC) à une puce microfluidique en polydiméthylsiloxane collée sur un verre de couverture. Une deuxième seringue remplie de tampon de mesure pur a été attachée à la puce et utilisée pour focaliser de manière hydrodynamique les cellules à l'intérieur du canal de constriction. La puce microfluidique se composait d'une entrée d'échantillon, d'une entrée de gaine et d'une sortie reliées par un rétrécissement de canal central d'une section carrée de 20 × 20, 30 × 30 ou 40 × 40 μm et d'une longueur de 300 μm. Les débits totaux correspondants utilisés étaient : 0,06 µl s pour les canaux de 20 μm-1, 0,12 µl s-1 pour les canaux de 30 μm et 0,2 µl s-1 pour les canaux de 40 μm. Le rapport d'écoulement de la gaine à l'échantillon était de 3:1. La puce a été montée sur la platine d'un microscope inversé à grande vitesse équipé d'une caméra semi-conductrice métal-oxyde complémentaire à grande vitesse. La puissance laser pour chaque fluorophore a été ajustée en conséquence, sur la base de contrôles de coloration unique et d'un échantillon non coloré. Une image de chaque cellule a été capturée dans une région d'intérêt de 250 × 80 pixels à une fréquence d'images de 2 000 ips. Les paramètres morphologiques, mécaniques et de fluorescence ont été acquis en temps réel. Le seuil de fluorescence pour chaque anticorps a été ajusté en fonction d'un échantillon non coloré de cellules obtenues à partir du même tissu. Le tableau supplémentaire 3 répertorie les fonctionnalités acquises en temps réel et lors de l'analyse de post-traitement ; décrites en détail dans des publications antérieures69,70. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel ShapeIn (ShapeIn2; Zellmechanik Dresden GmbH).

Si nécessaire, des suspensions unicellulaires ont été incubées pendant 20 min à température ambiante avec 200 μl d'anticorps correspondants (pour la dilution des anticorps, voir le tableau supplémentaire 4) dilués dans du PBS additionné de 0, 5% d'albumine de sérum bovin (Sigma-Aldrich) et de récepteur Fc. réactif de blocage des espèces correspondantes (Miltenyi Biotec, humain: 130-059-901; souris: 130-092-575). Les anticorps ont été lavés en ajoutant 1 ml de PBS et 2% de FBS, et centrifugés pendant 500 g pendant 5 min. La préparation cellulaire finale a ensuite été remise en suspension dans le tampon de mesure avant d'être chargée sur la puce microfluidique pour l'analyse RT-FDC. Pour les échantillons de biopsie congelés, le tissu a été placé dans du DMEM préchauffé, additionné de 10 % de FBS pendant 10 min et laissé décongeler avant traitement comme décrit ci-dessus.

Les données RT-FDC ont été analysées à l'aide de packages publics dans Python 3.7. La bibliothèque Dclab 0.32.3 a été utilisée pour le chargement initial, le prétraitement et le filtrage des données71. Pour supprimer les images de débris, de cellules endommagées et de globules rouges, nous avons appliqué des portes pour une surface de section minimale (20 µm2), un rapport de surface (1:1,1) et un rapport d'aspect (1:2). Les petites cellules <60 μm2 ont été identifiées par déclenchement supplémentaire pour un rapport de surface 1: 1, 05 et un rapport d'aspect 1: 2. Tous les événements en dehors de ces portes et tous les événements <25 µm2 ont été considérés comme des débris. Dans les diagrammes de dispersion des paramètres RT – FDC, le codage couleur est conforme aux estimations de densité du noyau normalisées entre 0 et 1.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide du package SciPy 1.3.0. Le test de rang signé de Wilcoxon a été utilisé pour évaluer des échantillons appariés (échantillons murins sains par rapport à des échantillons tumoraux et échantillons de tissu frais du côlon humain par rapport à des échantillons congelés). Un test Mann-Whitney U a été appliqué sur les données de colite de transfert. Dans les graphiques, les valeurs P sont représentées par * P < 0,05, ** P < 0,01 et *** P < 0,001. Les tailles d'effet ont été calculées comme r = |z|/√N, où z est la statistique z du test et N est le nombre d'échantillons. Les tailles d'effet ont été jugées selon les critères de Cohen comme suit : 0,1 à 0,3 petit effet, 0,3 à 0,5 effet modéré et > 0,5 effet important. La corrélation de Pearson a été réalisée pour juger de la corrélation entre la déformation cellulaire et le nombre de cellules CD45 + et la corrélation entre la taille des cellules et la surface des échantillons murins sains et tumoraux.

Le progiciel Scikit learn 0.23.2 a été utilisé pour le traitement et l'analyse des données72. Les paramètres obtenus à partir de RT – FDC ont été transformés en mettant à l'échelle chaque caractéristique dans la plage comprise entre 0 et 1. L'ACP a été utilisée pour la réduction de la dimensionnalité linéaire, en utilisant la décomposition en valeur singulière des données pour projeter sur un espace bidimensionnel (PC1 contre PC2). La régression logistique a été utilisée pour la classification des échantillons sains par rapport aux échantillons tumoraux.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les ensembles de données RT – FDC générés et analysés pour les Figs. 2–5 et données étendues Figs. 3 à 5 sont disponibles sur le référentiel ouvert de cytométrie de déformabilité (https://dcor.mpl.mpg.de/organization/soteriou-kubankova)73. Des identifiants individuels pour chaque ensemble de données sont fournis dans le tableau supplémentaire 11. Les données sources pour les données étendues de la figure 1 sont également fournies avec cet article. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code Python pour le traitement et la visualisation des données RT-FDC est disponible sur https://github.com/marketakub/physical_phenotyping_tissues.

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Nous remercions R. Grützmann et K. Bende (Universitätsklinikum Erlangen) de nous avoir aimablement aidés avec des échantillons de biopsie. Nous remercions également J. Kayser et M. Urbanska pour une relecture critique de l'article. Nous reconnaissons le soutien financier de la DFG (SFB/TRR241 'IBDome' à R.LP., MW, RA et MN ; FOR2438 à MN ; DI 1537/20-1, DI 1537/22-1, SFB CRC1181 et SFB TR221 à JD), l'IZKF Erlangen (subvention de recherche A79 à JD et le programme de clinicien-chercheur étape 2 à ME), et Financement de base de la Max Planck Society (à JG).

Financement en libre accès fourni par Max Planck Society.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Despina Soteriou, Markéta Kubánková.

Institut Max Planck pour la science de la lumière et Centre Max Planck pour la physique et la médecine, Erlangen, Allemagne

Despina Soteriou, Markéta Kubánková, Christine Schweitzer & Jochen Guck

Département de médecine 1—Gastroentérologie, pneumologie et endocrinologie, Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nürnberg (FAU) et hôpital universitaire d'Erlangen, Erlangen, Allemagne

Dew Lopez-Inns, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Raja Atreya et Markus F. Neurath

Centre allemand d'immunothérapie (DZI), Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nuremberg (FAU) et Hôpital universitaire d'Erlangen, Erlangen, Allemagne

Dew Lopez-Posadas, Rashmita Pradhan, Oana-Maria Thoma, Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei, Maximilian Waldner, George HW Distler, Raja Atreya et Markus F. Neurath

Comprehensive Cancer Center Erlangen-EMN (CCC ER-EMN), Erlangen, Allemagne

Oana-Maria Thoma, Maximilian Waldner, Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock, Raja Atreya, Markus F. Neurath & Arndt Hartmann

Département de médecine interne 3—Rhumatologie et immunologie, Université Friedrich-Alexander d'Erlangen-Nürnberg (FAU) et Hôpital universitaire d'Erlangen, Erlangen, Allemagne

Andrea-Hermina Györfi, Alexandru-Emil Matei & Jörg HW Distler

Technologies de la santé clinique, Fraunhofer IPA, Mannheim, Allemagne

Stefan Scheuermann & Jens Langejürgen

Institut de pathologie, Hôpital universitaire, Université Friedrich-Alexander Erlangen-Nuremberg (FAU), Erlangen, Allemagne

Markus Eckstein, Regine Schneider-Stock & Arndt Hartmann

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MK, DS et JG ont conçu l'étude et géré l'avancement du projet. DS et MK ont coordonné les expériences et l'analyse. DS a développé des protocoles expérimentaux et réalisé des expériences avec CS L'analyse et la visualisation des données ont été réalisées par MK D'autres auteurs ont participé aux expériences et ont participé à des discussions critiques. MK et DS ont rédigé l'article, tous les auteurs fournissant des commentaires.

Correspondance à Jochen Guck.

SS, JL et JG sont co-fondateurs de la société Fast Forward Discoveries GmbH, qui commercialise la technologie TG. DS, MK et JG sont nommés inventeurs d'une demande de brevet pour la combinaison de TG et RT – DC pour le diagnostic par biopsie solide. MK et JG sont co-fondateurs de la société Rivercyte GmbH, qui commercialise des applications diagnostiques de cytométrie de déformabilité. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Biomedical Engineering remercie Dino Di Carlo, Per Uhlen et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a,b, Pourcentage de cellules viables pour différents organes dissociées à l'aide d'un broyeur de tissus (TG; marqué en rouge) ou d'une dissociation standard (marquée en bleu). La viabilité cellulaire a été évaluée en utilisant (a) l'iodure de propidium et la RT-FDC et (b) le test d'exclusion du bleu trypan. c, nombre de cellules (obtenu à l'aide d'un compteur de cellules) par mg de tissu traité. Les poumons, le foie, les reins, le pancréas et l'estomac traités par dissociation enzymatique n'ont pas été pesés avant les expériences. La ligne représente la moyenne et la boîte s'étend des valeurs minimales aux valeurs maximales. Données TG rein et rate : n = 5, tous les autres organes n = 5 ; pour la dissociation enzymatique rein, pancréas, estomac : n = 3 ; tous les autres organes n = 4 ; répétitions biologiquement indépendantes effectuées en tant qu'expériences indépendantes).

Données source

a, diagrammes de dispersion représentatifs des intensités de fluorescence dans trois canaux de détection différents de RT-FDC, montrant la possibilité d'utiliser des marqueurs de surface cellulaire fluorescents pour caractériser les cellules. Les tracés montrent l'expression d'un marqueur endothélial (CD31-PE) par rapport à un marqueur leucocytaire (CD45-FITC) ; et un marqueur épithélial (EpCAM-APC) vs CD45-FITC. b, images représentatives des cellules et leurs traces de fluorescence correspondantes ; la forme temporelle du pic de fluorescence correspond à la localisation subcellulaire du fluorophore. En haut de gauche à droite : cellule négative pour tous les marqueurs, une cellule positive pour CD45 ; en bas de gauche à droite : cellule positive pour EpCAM uniquement et cellule positive pour CD31 uniquement.

Diagrammes de dispersion représentatifs du rapport d'aspect par rapport à la taille des cellules des cellules isolées de murin a, thymus, c, rate et e, rein montrant la stratégie de déclenchement pour identifier les doublets cellulaires. Doublets cellulaires identifiés en b, thymus et d, rate et f, rein avec des traces de fluorescence correspondantes (b,d), montrant un leucocyte (CD45) attaché à une cellule endothéliale (CD31), ou (f) l'interaction de deux leucocytes.

a, Diagrammes de dispersion de la déformation en fonction de la taille des cellules pour les cellules isolées du tissu hépatique de souris à l'aide d'un broyeur de tissu (TG) ou d'une dissociation enzymatique, montrant l'enrichissement des hépatocytes après dissociation mécanique pour 3 répétitions biologiques indépendantes. b, Nuage de points de déformation en fonction de la taille des cellules montrant 3 amas de cellules correspondant à des hépatocytes de tailles différentes ; avec le tracé correspondant de l'estimation de la densité du noyau (KDE) et des images représentatives (r = rayon des cellules). c, pourcentage d'hépatocytes par rapport au nombre total de cellules hépatiques, tel que détecté par RT-DC pour cinq répétitions biologiques indépendantes. d, diagrammes de dispersion de la déformation par rapport à la taille des cellules pour les cellules isolées du tissu pulmonaire de souris à l'aide d'un broyeur de tissu ou d'une dissociation enzymatique pour 3 répétitions biologiques indépendantes.

Taille des cellules vs déformation diagrammes de dispersion de cellules individuelles extraites d'échantillons de biopsie du côlon frais (violet) ou congelés (vert) ; a, échantillon sain ; b, échantillon de tumeur ; dont 3 images cellulaires représentatives pour chaque parcelle avec une barre d'échelle = 10 μm2. Les tracés de l'estimation de la densité du noyau (KDE) à droite correspondent aux diagrammes de dispersion à gauche ; les histogrammes montrent les distributions de la taille et de la déformation des cellules. c, médianes et écarts-types de la taille des cellules, de la déformation, du rapport de surface et du rapport d'aspect des échantillons frais (N = 6) et congelés correspondants (N = 6). Les cases s'étendent du 25e au 75e centile avec une ligne à la médiane ; les moustaches couvrent 1,5 fois l'intervalle interquartile. Des comparaisons statistiques ont été effectuées à l'aide d'un test de rang signé Wilcoxon bilatéral, de la taille de cellule d'écart type (*p = 0,0277, r = 0,64), du rapport de surface médiane (*p = 0,0277, r = 0,64) et du rapport de surface d'écart type (*p = 0,0277, r = 0,64) ; r : taille d'effet ; NS : non significatif.

Figures, tableaux et références.

Données source.

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Réimpressions et autorisations

Soteriou, D., Kubánková, M., Schweitzer, C. et al. Phénotypage physique unicellulaire rapide de biopsies de tissus dissociés mécaniquement. Nat. Biomédical. Eng (2023). https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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Reçu : 01 décembre 2021

Accepté : 22 février 2023

Publié: 06 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41551-023-01015-3

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