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Aug 21, 2023

Les cliniciens peuvent désormais être en mesure de dire COVID

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In COVID-19, Département de génie mécanique et aérospatial, En vedette, Nouvelles, Recherche et innovation17 décembre 2021

Z. Hugh Fan, Ph.D., professeur au département de génie mécanique et aérospatial du Herbert Wertheim College of Engineering

Pour ceux qui se sont rendus chez un médecin ou une clinique pendant la saison de la grippe qui approche, la préoccupation la plus lancinante est de savoir si leurs symptômes indiquent le virus de la variété du jardin qui fait le tour du lieu de travail ou une éventuelle infection au COVID-19. Alors que les chercheurs se démènent pour traiter ce virus – et ses variantes et mutations inévitables – l'un des plus grands défis a été de diagnostiquer rapidement et avec précision la source de la maladie afin que les protocoles de traitement appropriés soient administrés et à temps pour réduire les risques de complications potentiellement dangereuses.

Dirigé par Z. Hugh Fan, Ph.D., professeur au département de génie mécanique et aérospatial du Herbert Wertheim College of Engineering, et le Dr John Lednicky, professeur de recherche au département de santé environnementale et mondiale du Collège de la santé publique et des professions de la santé, une équipe interdisciplinaire de l'Université de Floride a développé un test de diagnostic révolutionnaire pour le SRAS-CoV-2 qui est rapide, fiable, peu coûteux et capable de différencier le COVID-19 de la grippe.

(Haut) Rendu du mécanisme de soupape à bille qui ressemble à un stylo à bille, dans lequel l'encre est distribuée sur du papier lorsque la bille métallique à la pointe est pressée pendant l'écriture. La vanne est fermée lorsque la boule fonctionne comme un bouchon pour le puits au sommet. La vanne est ouverte par la goupille dans l'unité en bas qui soulève la bille lorsque la goupille est alignée avec la bille après avoir glissé, libérant le réactif. (Milieu) Un échantillon est introduit dans le puits inférieur, suivi d'un glissement du puits inférieur pour avoir une livraison séquentielle de 4 réactifs pour la lyse virale et l'isolement/purification de l'ARN. (En bas) Détection colorimétrique aidée par une lampe de poche UV et le temps global entre l'échantillon et la réponse en 50 min.

Le Dr Fan et son équipe ont démontré la capacité de détecter deux virus en 50 minutes sans utiliser d'équipement de laboratoire ni d'alimentation électrique encombrants ou sophistiqués, et avec une sensibilité de détection comparable à celle du test de référence RT-PCR (réaction en chaîne par polymérase de transcription inverse), qui est le test recommandé par l'Organisation mondiale de la santé et les Centers for Disease Control and Prevention. L'effort est soutenu par les National Institutes of Health.

"En termes de soins aux patients, cette plate-forme innovante d'échantillon à réponse est une mise à niveau importante de la norme RT-PCR existante à plusieurs niveaux", a déclaré le Dr Fan. "En ce qui concerne le diagnostic, le délai d'exécution est inférieur à une heure sur le lieu de test, contre un à deux jours à partir d'un laboratoire de test hors site."

Vue éclatée de l'appareil composé de 3 composants, dont une unité tampon en haut, une unité de mélange au milieu et l'unité de détection en bas. L'unité de tampon contient 4 puits de chaque côté pour le stockage d'un tampon de lyse, d'un tampon de liaison et de 2 tampons de lavage pour la préparation des échantillons. Dans chaque puits de l'unité tampon, une bille en acier inoxydable est placée au fond et sert de vanne. L'unité de mélange a un puits de chaque côté et glisse sous l'unité tampon à travers les glissières des deux côtés et au milieu. L'unité de détection contient un bloc de papier qui est laminé entre deux films thermoplastiques et fixé à la couche de puits à l'aide d'un ruban adhésif double face.

Le dispositif conçu par UF a récemment été publié pour examen par les pairs dans ACS Sensors, la revue phare de l'American Chemical Society, axée sur la science des capteurs.

RT-LAMP (amplification isotherme médiée par boucle) est un test utilisé pour la détection de l'ARN viral. La méthodologie de RT-LAMP était basée sur le mécanisme derrière la synthèse d'ADN par déplacement de brin à cycle automatique. Une polymérase effectue la réaction et la polymérase a une activité de déplacement de brin élevée. Deux paires d'amorces sont également utilisées, une paire d'amorces internes et une autre d'amorces externes. Ces amorces sont spécialement conçues pour la réaction. RT-LAMP atteint une spécificité élevée en raison des séquences cibles. Contrairement à d'autres technologies, RT-LAMP reconnaît la séquence cible en utilisant six séquences indépendantes au départ, ce qui lui confère une grande spécificité. La reconnaissance des amorces du génome cible conduit à une forte réaction colorimétrique, ce qui permet une détection sans instrumentation hautement spécialisée ou coûteuse.

"La technologie RT-LAMP présente de nombreux avantages par rapport à la RT-PCR standard", a déclaré le Dr Lednicky. « Le coût des réactifs est faible par rapport à une réaction RT-PCR équivalente, les résultats sont obtenus plus rapidement et les besoins en équipement pour la RT-LAMP sont faibles, ce qui constitue un avantage majeur pour les utilisateurs des pays à court de ressources ou pour une utilisation dans les cabinets médicaux et les cliniques. De plus, les réactions RT-LAMP emballées dans un format de kit occupent peu d'espace de stockage et peuvent être lyophilisées, ce qui réduit le besoin de stockage au congélateur.

Photographie d'un appareil assemblé, dans lequel l'unité de mélange glisse vers le deuxième puits à partir de la gauche, soulevant ces boules là-bas. (encart) Vue de dessus d'une unité de détection, montrant un puits pour l'isolement de l'ARN et la RT-LAMP.

L'échantillon - écouvillon, urine, salive, sang, selon le test - est prélevé, en transférant une quantité déterminée dans la première chambre du dispositif de traitement des échantillons. Séquentiellement, l'échantillon est soumis à des fluides spécifiques qui extraient l'ADN ou l'ARN de l'agent pathogène, purifient le matériel extrait et le collectent sur une unité de filtre amovible. Les produits chimiques RT-LAMP sont ajoutés dans l'unité amovible, la chambre avec les fluides RT-LAMP est scellée avec du ruban adhésif et l'unité finale est détachée et placée dans une "tasse à café" contrôlée par micropuce, qui est préchauffée à une température spécifique. Après une période d'incubation sélectionnée, les résultats sont déterminés, mis en évidence par un changement de couleur qui est détecté visuellement ou qui peut également être détecté/mesuré par son niveau de fluorescence.

Utilisant des unités à usage unique au format jetable, l'appareil peut être utilisé par des infirmières, des médecins et d'autres personnes sans avoir besoin d'une formation avancée. Les résultats, positifs ou négatifs, peuvent être déterminés visuellement ou à l'aide d'une technologie simple comme une lampe de poche. Les résultats peuvent être enregistrés à l'aide d'un iPhone ou d'un appareil mobile équipé d'une caméra similaire pour capturer l'image, où elle est envoyée à un site distant pour confirmation des données.

"En bout de ligne, l'appareil permet une analyse plus rapide du matériel génétique que la RT-PCR traditionnelle et a été utilisé avec succès dans la détection du virus SARS-CoV-2", a déclaré le Dr Lednicky. "C'est simple, bon marché et ne nécessite pas de compétences techniques avancées ni d'équipement coûteux. Plus important encore, il est très sensible, produisant des sensibilités de détection, dans certains cas, 10 fois plus sensibles que les tests RT-PCR standard."

Le test simultané du SRAS-CoV-2 et des virus de la grippe n'est actuellement pas disponible au point de service (POC), mais ses variantes sont disponibles dans les laboratoires de test et seraient probablement considérées comme un dispositif " exempt de CLIA ", qui comprend des tests à domicile approuvés par la FDA. "Le dispositif pourrait également être utilisé pour des études environnementales (SARS-CoV-2 dans l'air, les eaux usées ou d'autres matrices), et peut être fixé/accouplé avec d'autres dispositifs de détection tels que des échantillonneurs d'air", a déclaré le Dr Fan.

Photographies de tasses à café à piles disponibles dans le commerce utilisées comme bain-marie pour l'amplification isotherme. (à gauche) Une tasse de café est ouverte, contenant des unités de détection dans un bain-marie. Une image de l'unité de détection est affichée dans l'encart au-dessus de la tasse. (à droite) La tasse à café est fermée pendant l'amplification RT-LAMP à 62,5 oC.

Le développement de cet appareil basé sur LAMP fait suite aux avancées progressives des chercheurs de l'UF dans la détection et l'identification précoces d'agents pathogènes dangereux. Il y a trois ans, grâce au financement de l'État de Floride, le Dr Fan et le Dr Lednicky ont dirigé une équipe de recherche qui a développé un dispositif miniaturisé rapide et rentable pour la détection du virus Zika transmis par les moustiques, qui ne présente aucun symptôme chez jusqu'à 80 % des personnes infectées. La plate-forme de test au point de service peut être utilisée pour dépister les patients asymptomatiques sur le terrain, atténuer les erreurs de diagnostic et aider à prévenir une nouvelle transmission.

L'année dernière, des ingénieurs du Département des sciences de l'ingénierie de l'environnement de l'École d'ingénierie des infrastructures et de l'environnement durables (ESSIE) dirigée par le Dr Chang-Yu Wu, ont développé un nouvel échantillonneur d'aérosols de virus qui collecte efficacement les virus en suspension dans l'air (y compris le COVID-19) - des informations à partir desquelles les prestataires de soins de santé peuvent identifier les zones à risque et identifier les mesures d'amélioration. L'intégration du nouvel échantillonneur avec le dispositif RT-LAMP pourrait potentiellement s'étendre au-delà des zones de test dans les zones publiques générales (par exemple, les aéroports, les métros, les bâtiments gouvernementaux, les centres commerciaux) fournissant une alerte précoce pour les virus pathogènes en suspension dans l'air, aidant à endiguer leur propagation.