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Oct 20, 2023

TRPV3

Volume Biologie des communications

Communications Biology volume 6, Article number: 88 (2023) Citer cet article

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Le vanilloïde potentiel de récepteur transitoire 3 (TRPV3) appartient à la super famille des canaux ioniques TRP et fonctionne comme un canal cationique non sélectif hautement perméable au calcium. Ce canal est fortement exprimé dans les kératinocytes cutanés et est impliqué dans la sensation de chaleur, les démangeaisons, la cicatrisation et la sécrétion de plusieurs cytokines. Des études antérieures ont montré que l'anoctamine1 (ANO1), un canal chlorure activé par le calcium, était activé par l'afflux de calcium via TRPV1, TRPV4 ou TRPA1 et que ces interactions de canal étaient importantes pour les fonctions physiologiques médiées par le canal TRP. Nous avons constaté que ANO1 était exprimé par les kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK). Nous avons observé que ANO1 médiait les courants lors de l'activation par TRPV3 des NHEK et des kératinocytes de la peau de souris. À l'aide d'un test de cicatrisation in vitro, nous avons observé qu'un bloqueur TRPV3, un bloqueur ANO1 ou un milieu à faible teneur en chlorure inhibait la migration et la prolifération cellulaire par phosphorylation de p38, entraînant l'arrêt du cycle cellulaire. Ces résultats ont indiqué que l'influx de chlorure par l'activité d'ANO1 améliorait la cicatrisation des plaies par les kératinocytes.

Les canaux de potentiel de récepteur transitoire (TRP) sont composés de six familles de protéines apparentées chez les mammifères. Ces familles comprennent TRPA (ankyrine), TRPC (canonique), TRPM (mélastatine), TRPML (mucolipine), TRPP (polycystine) et TRPV (vanilloïde). La plupart sont des canaux cationiques non sélectifs et hautement perméables au calcium1. Dans les cellules épithéliales du plexus choroïde, l'influx de calcium via TRPV4 active un canal de chlorure activé par le calcium (CaCC) appelé anoctamine1 (ANO1 ou TMEM16A), dont on pense qu'il conduit à la sécrétion de liquide céphalo-rachidien2. D'autres cellules épithéliales auraient également des canaux TRPV4 et ANO1. Par exemple, ces canaux ioniques sont co-exprimés par les cellules acineuses des glandes salivaires et lacrymales, et les sécrétions de salive et de larmes pourraient être accélérées par une interaction fonctionnelle entre TRPV4 et ANO13. Ainsi, les complexes canal TRP/ANO1 ont des fonctions distinctes même si chaque canal TRP fonctionne indépendamment. En conséquence, on ne peut pas étudier les fonctions des canaux sans étudier leurs interactions lorsqu'un canal TRP et ANO1 sont co-exprimés par les mêmes cellules.

TRPV3 est un canal TRP sensible à la chaleur et la perméabilité au calcium est environ dix fois supérieure à celle du sodium4. Bien que TRPV3 soit exprimé dans tout le corps, sa signification physiologique n'est pas bien comprise. Des études antérieures ont montré que TRPV3 contribuait aux démangeaisons, à la sensation de chaleur et à la cicatrisation des plaies dans les kératinocytes5,6,7,8,9. De plus, l'activation de TRPV3 renforcée par la signalisation cellulaire en aval du récepteur du facteur de croissance épidermique accélère la cicatrisation dépendante de la chaleur dans les cellules épidermiques orales5. Dans les kératinocytes cutanés, une étude précédente a montré que TRPV3 contribue à la prolifération cellulaire via des voies de signalisation dépendantes de l'EGFR5,6,7,8,9.

La cicatrisation de la peau dépend de la migration cellulaire et de la prolifération cellulaire. Bien que certains facteurs de croissance et interleukines soient impliqués dans la cicatrisation des plaies9,10, les canaux ioniques sur les membranes plasmiques des kératinocytes pourraient également jouer un rôle important. Par exemple, Ano1 serait un gène lié au carcinome11,12, et une étude récente a révélé que ANO1 était impliqué dans la prolifération des cellules épithéliales de la prostate dans l'hyperplasie bénigne de la prostate13 ainsi que dans les cellules HaCaT, une lignée cellulaire spéciale de kératinocytes14. De plus, l'inhibition de l'ANO1 a réduit la migration cellulaire dans certaines cellules cancéreuses12,15,16. Cependant, la fonction physiologique d'ANO1 dans les kératinocytes cutanés normaux n'est pas claire même si de nombreuses cellules épithéliales l'expriment17. Ici, nous montrons que ANO1 est exprimé dans les kératinocytes humains normaux et que ces canaux sont impliqués dans la cicatrisation des plaies. Cette étude montre l'importance d'ANO1 dans la migration et la prolifération cellulaire dans les kératinocytes normaux.

Les niveaux d'expression génique endogène des canaux TRP et des ANO dans les NHEK ne sont pas clairs. Pour clarifier les modèles d'expression, nous avons effectué une analyse RT-PCR de NHEK en culture (Fig. 1a et Suppl. Fig. 11). Des rapports antérieurs suggéraient que les protéines TRPV1, TRPV3, TRPV4, TRPV6 étaient exprimées dans les kératinocytes18. Ici, nous avons observé les ARNm de TRPV1, TRPV2, TRPV3, TRPV4, TRPV6, ANO1, ANO4, ANO9 et ANO10 (Fig. 1a et Suppl. Fig. 11). Bien que ANO2 fonctionne également comme un CaCC, une bande discrète avec le poids moléculaire prévu n'a pas été détectée dans les NHEK. En revanche, l'expression de la protéine ANO1 a été observée par Western blot (Fig. 1b). De plus, en utilisant une concentration élevée de calcium intracellulaire (500 nM de calcium libre) avec des cellules NHEK, les courants affichaient une cinétique d'activation lente lors des impulsions graduelles et une cinétique de désactivation lente lors du retour au potentiel de maintien et de la rectification vers l'extérieur, propriétés caractéristiques de ANO119 (Suppl. Fig. 1). Ces résultats suggèrent une expression significative de ANO1 dans les NHEK. De plus, nous avons effectué des expériences d'imagerie calcique à l'aide de Fura-2 pour étudier l'expression fonctionnelle des canaux TRP. Alors que le camphre (10 mM, un agoniste de TRPV3) et GSK1016790A (300 nM, un agoniste de TRPV4) induisaient manifestement des augmentations de calcium intracellulaire dans toutes les cellules, la capsaïcine (300 nM à 3 µM, un agoniste de TRPV1), le menthol (100 µM, un agoniste de TRPM8), l'allyl isothiocyanate (AITC, 100 µM ou 1 mM, un agoniste de TRPA1), le probénécide (100 µM, un agoniste de TRPV2) ou le 1-oléoyl-acétyl-sn-glycérol (OAG, 90 µM, un agoniste de TRPC6) n'ont pas produit de réponses claires (Fig. 1c et Suppl. Fig. 2).

une RT-PCR des TRP et des ANO dans les NHEK. Les images de gel non recadrées sont présentées dans Suppl. Fig. 11. b Western blot de ANO1 dans les NHEK. La taille de bande prédite d'ANO1 est de 114 kDa. c, d Imagerie calcique dans les NHEK. Cam Camphor, un agoniste TRPV3 ; GSK GSK1016790A, un agoniste TRPV4 ; Ca2+ (−) Solution de bain sans calcium. e Comparaison des relations courant-tension. La ligne rouge indique la relation courant-tension du courant de base dans les NHEK utilisant une solution standard de bain et de pipette. La ligne bleue indique la relation courant-tension dans les cellules HEK293T exprimant TRPV6 en utilisant une solution de bain standard et une solution de pipette NMDG-Cl. Le potentiel de maintien était de -60 mV et des impulsions de rampe ont été appliquées de -100 à +100 mV pendant 300 ms toutes les 5 s.

Nous avons également effectué des expériences d'imagerie calcique en utilisant un milieu extracellulaire sans calcium, car les concentrations de calcium intracellulaire sont censées être réduites lors de l'élimination du calcium extracellulaire dans les cellules exprimant TRPV6, qui peut être constitutivement actif. Cependant, les concentrations de calcium intracellulaire n'étaient pas différentes en présence ou en l'absence de calcium extracellulaire (Fig. 1d). De plus, un courant médié par TRPV6 typique avec rectification vers l'intérieur n'a pas été observé dans les NHEK (Fig.1e). Sur la base de ces résultats, nous avons conclu que TPRV6 n'est pas exprimé de manière fonctionnelle dans les NHEK. Ces résultats ont indiqué que dans les NHEK, les canaux TRP les plus actifs étaient TRPV3 et TRPV4. Cependant, l'expression d'autres canaux TRP a été suggérée dans des expériences de RT-PCR. Ainsi, ANO1 pourrait être activé par un afflux de calcium via TRPV3 ou TRPV4 dans des cellules co-exprimant ces canaux ioniques. Par conséquent, nous avons décidé de nous concentrer sur l'interaction entre TRPV3 et ANO1 dans cette étude car leur interaction n'avait pas reçu d'attention dans la littérature.

Nous avons effectué des expériences de patch-clamp sur cellules entières en utilisant des cellules HEK293T exprimant de manière hétérologue TRPV3 et ANO1 pour étudier leur interaction fonctionnelle. Des solutions de bain et de pipette NMDG-Cl ont été utilisées pour identifier les courants de chlorure à travers ANO1, car le NMDG est connu pour ne pas pénétrer les pores des canaux cationiques. Nous avons utilisé le camphre comme agoniste du TRPV3 car un rapport précédent a montré que d'autres agonistes du TRPV3, le 2-APB et le carvacrol, inhibaient les courants ANO120. Dans ces conditions, des courants de chlorure ont été clairement observés dans les cellules exprimant à la fois le TRPV3 humain (hTRPV3) et l'ANO1 humain (hANO1), mais pas dans les cellules exprimant hTRPV3 ou hANO1 seul (Fig. 2a, b). Les courants ont été interprétés comme étant des courants de chlorure traversant hANO1 qui avaient été activés par le calcium entrant dans les cellules via hTRPV3. Les courants ont été observés même avec l'acide intracellulaire 1, 2-bis (o-aminophénoxy) éthane-N,N,N',N'-tétraacétique (BAPTA) (5 mM), qui est un chélateur de calcium relativement rapide. Étant donné que le calcium est rapidement chélaté en présence de fortes concentrations de BAPTA, les augmentations des concentrations de calcium ne se produisent qu'à proximité des canaux calciques21. Ainsi, l'interaction TRPV3-ANO1 pourrait se produire dans un nanodomaine local de calcium. Étant donné que des études antérieures suggéraient que TRPV1 et TRPV4 interagissaient physiquement avec ANO12,3,22, nous avons effectué des expériences d'immunoprécipitation et de Western blot en utilisant des anticorps anti-ANO1 et anti-TRPV3 avec des extraits de cellules HEK293T (Fig. 2c et Suppl. Fig. 11). Les protéines TRPV3 et ANO1 ont été co-immunoprécipitées dans des cellules exprimant les deux protéines alors qu'il n'y avait pas de bandes TRPV3 dans les extraits de cellules transfectées avec l'ADNc de hANO1, l'ADNc de hTRPV3 ou le plasmide pcDNA3.1 seul, indiquant l'interaction physique de hTRPV3 avec hANO1. Ces résultats suggèrent une interaction fonctionnelle et physique entre hTRPV3 et hANO1 dans le système d'expression hétérologue.

a Une trace représentative des courants induits par le camphre dans les cellules HEK293T exprimant à la fois hTRPV3 et hANO1, hANO1 seul ou hTRPV3 seul. Toutes les données ont été recueillies à l'aide d'un bain NMDG-Cl et de solutions de pipette. Le calcium libre dans la solution de pipette était de 100 nM. Le potentiel de maintien était de -60 mV et des impulsions de rampe ont été appliquées de -100 à +100 mV pendant 300 ms toutes les 5 s. b Comparaison des courants de crête de (A) à −60 mV (moyenne ± SEM, N = 6). La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney. c Immunoprécipitation de ANO1 ou TRPV3 et Western blot de TRPV3 dans des cellules HEK293T transfectées avec les ADNc TRPV3 et ANO1, Ano1 seul, TRPV4 seul ou pcDNA3.1. Les images de gel non recadrées sont présentées dans Suppl. Fig. 11.

Des augmentations de calcium intracellulaire ont été observées dans toutes les NHEK lors de l'application de camphre (Fig. 1c). Par conséquent, nous avons effectué des expériences de patch-clamp sur cellules entières dans des NHEK. Des courants de chlorure induits par le camphre ont été observés dans une solution de bain contenant 148 mM de chlorure (Fig. 3a). Le potentiel d'inversion des courants de chlorure a été déplacé vers des potentiels positifs lorsque la concentration de chlorure extracellulaire a été modifiée à 4 mM (Fig.3b, c). Ce résultat indiquait que le chlorure était un transporteur d'ions majeur des courants induits par le camphre. De plus, nous avons effectué une imagerie calcique dans la solution de bain sans calcium pour évaluer la contribution de la réserve de calcium intracellulaire aux augmentations de calcium intracellulaire induites par le camphre (Fig.3d). La libération de calcium du réticulum endoplasmique n'était pas un contributeur majeur à l'augmentation des concentrations de calcium intracellulaire dans les NHEK car les augmentations des concentrations de calcium intracellulaire étaient faibles dans la solution de bain sans calcium. Cette interprétation a été confirmée dans les expériences de patch-clamp dans lesquelles les courants induits par le camphre étaient très faibles dans la solution extracellulaire sans calcium (Fig. 3e). Par conséquent, les courants de chlorure induits par l'agoniste de TRPV3 via ANO1 dans les NHEK dépendent principalement de l'afflux de calcium via TRPV3 à partir de régions extracellulaires. De plus, lorsque nous avons examiné si TPRV4 contribuait aux courants induits par le camphre, nous avons constaté que le camphre 10 mM n'activait pas hTRPV4 et que HC067047, un inhibiteur sélectif de TRPV4, ne supprimait pas le courant induit par le camphre 10 mM dans NHEK (Suppl. Fig. 3). Cela a exclu la possibilité que le camphre active de manière non spécifique TPRV4 et clarifie davantage l'implication de TRPV3. Les courants de chlorure induits par le camphre ont été inhibés à la fois par Ani9, un puissant inhibiteur d'ANO1 (Fig. 3f), et par la dyclonine, un inhibiteur de TRPV323,24 (Suppl. Fig. 4). De plus, les courants induits par le camphre affichaient une cinétique d'activation lente à des potentiels positifs avec des propriétés de redressement vers l'extérieur et une récupération lente après des impulsions progressives, des données compatibles avec les canaux ANO118 (Suppl. Fig. 5). Ces résultats confirment davantage l'interaction TRPV3-ANO1 dans les NHEK.

a, b Traces représentatives de courants induits par le camphre dans les NHEK utilisant une solution de bain NMDG-Cl contenant 148 mM de chlorure (a) ou une solution de bain NMDG-aspartate contenant 4 mM de chlorure (b). La solution de pipette contenait 140 mM de NMDG-Cl et 100 nM de calcium libre. Le potentiel de maintien était de -60 mV et des impulsions de rampe ont été appliquées de -100 à +100 mV pendant 300 ms toutes les 5 s. c Comparaison des relations courant-tension des courants aux pointes de flèche dans (a, b). d Imagerie calcique des NHEK lors de l'application de camphre avec et sans (Ca2+ (-)) calcium extracellulaire. e Comparaison des courants de crête induits par le camphre à -60 mV dans une solution de bain NMDG-Cl avec 2 mM (Ca2+ (+)) ou sans (Ca2+ (-)) calcium extracellulaire (moyenne ± SEM, N = 5). La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney. f Courant induit par le camphre avec un inhibiteur ANO1, Ani9, en utilisant une solution de bain NMDG-Cl contenant 148 mM de chlorure.

Pour confirmer davantage l'interaction TRPV3-ANO1, nous avons effectué des expériences de patch-clamp en utilisant des kératinocytes de peau de queue de souris WT et TRPV3−/−. Nous avons observé de grands courants de chlorure induits par le camphre dans les kératinocytes WT, alors que de tels courants n'ont jamais été observés dans les kératinocytes déficients en TRPV3 dans la pipette NMDG / chlorure et les solutions de bain (Fig. 4a – c). De plus, les courants induits par le camphre ont été inhibés par Ani9 (Fig. 4d). Ces données confirment clairement l'interaction TRPV3-ANO1.

a, b Traces représentatives de courants induits par le camphre 10 mM dans des kératinocytes primaires isolés de souris WT ( a ) et TRPV3 - / - ( b ). Tous les enregistrements ont été effectués avec des solutions standard de bain et de pipette NMDG-Cl (avec 100 nM de calcium libre dans la pipette). Le potentiel de maintien était de -60 mV et des impulsions de rampe ont été appliquées de -100 à +100 mV pendant 300 ms toutes les 3 s. c Comparaison des relations courant-tension. N vaut 5 pour les kératinocytes WT (noir) et 4 pour les TRPV3-/- (gris). Les barres d'erreur indiquent SEM. d Comparaison des densités des courants induits par le camphre dans les kératinocytes WT (noir) et TRPV3−/− (gris) à +60 et -60 mV (moyenne ± SEM). La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney. e Une trace représentative de courants induits par le camphre 10 mM avec inhibition d'Ani9 dans un kératinocyte WT. Une trace représentative de courants induits par le camphre 10 mM avec inhibition de Ani9 dans un kératinocyte WT. Le potentiel de maintien était de -60 mV et des impulsions de rampe ont été appliquées de -100 à +100 mV pendant 300 ms toutes les 3 s.

Des études antérieures ont montré que TRPV3 contribue aux démangeaisons et aux sensations de chaleur et à la cicatrisation des plaies par les kératinocytes5,6,7,8. Il a été fortement suggéré que l'activation de TRPV3 accélère la cicatrisation des plaies dans la cavité buccale5. De plus, les propriétés histologiques de base de la cavité buccale sont similaires à celles de la peau par rapport aux autres muqueuses du corps25. De plus, ANO1 pourrait être impliqué dans le développement des tissus après la naissance26, et il est bien connu pour être un régulateur positif de la migration et de la prolifération dans les cellules cancéreuses11,12,15,16. Par conséquent, nous avons émis l'hypothèse que l'interaction TRPV3-ANO1 pourrait affecter la migration et/ou la prolifération des NHEK et le processus de cicatrisation.

Pour étudier l'implication d'ANO1 dans la cicatrisation des plaies, nous avons analysé les effets d'un autre bloqueur d'ANO1, T16Ainh-A01 (T16A). L'évaluation a incorporé un insert de culture pour quantifier l'activité cellulaire (Fig. 5). Dans ces expériences, les NHEK ont été cultivées dans un insert de culture jusqu'à une confluence de près de 100 % dans laquelle les cellules ont migré vers les espaces entre les amas de cellules (Fig. 5a). Les NHEK ont généralement migré vers les espaces ouverts, une zone séparée par l'insert, pendant environ 12 h après le retrait de l'insert. Ainsi, la migration et la prolifération ont rempli la zone à plus de 80 % en 24 h. La migration et/ou la prolifération cellulaire ont été significativement inhibées par la dyclonine, un inhibiteur sélectif de TRPV3 (Suppl. Fig. 6), mais pas par HC067047, un inhibiteur sélectif de TRPV4 (Suppl. Fig. 7). De plus, la migration et/ou la prolifération cellulaire dans le milieu contenant du T16A (5 µM) était évidemment inhibée sans affecter les niveaux de protéine ANO1 (Fig. 5b, c et Suppl. Figs. 8, 11). Fait important, l'inhibition a été perdue après le lessivage de T16A. Ces observations ont suggéré que l'effet T16A n'était pas dû à la mort cellulaire ou à des dommages cellulaires irréversibles. De plus, Ani9 a également inhibé la migration et/ou la prolifération cellulaire (Suppl. Fig. 9). Le fait que la migration et/ou la prolifération cellulaire aient été réduites à la fois par les inhibiteurs de TRPV3 et d'ANO1 indique fortement que l'interaction TRPV3-ANO1 est impliquée dans la migration et/ou la prolifération des NHEK. Nous avons analysé la vitesse de migration cellulaire à l'aide d'une imagerie accélérée avec un microscope confocal et la prolifération cellulaire à l'aide d'un test MTT (Fig. 5d – f). La vitesse de migration a été réduite après l'application de T16A et la réduction a duré tout au long de l'inhibition d'ANO1 (Fig. 5d). De plus, la vitesse de migration a retrouvé son niveau initial après le lavage de T16A (Fig. 5d, e). La prolifération cellulaire a également été réduite par l'application de T16A (Fig. 5f). Ces résultats suggèrent l'importance des ions chlorure pour la migration et la prolifération cellulaire. Par conséquent, nous avons effectué un test avec un insert de culture dans un milieu à faible teneur en chlorure (Fig. 6). Les concentrations de chlorure intracellulaire doivent être réduites lors de l'épuisement du chlorure extracellulaire28. Après le retrait des inserts de culture, les zones remplies ont été considérablement réduites dans le milieu à faible teneur en chlorure, un effet qui a été perdu après le retour au milieu de contrôle (Fig. 6). Ces résultats indiquent que le flux de chlorure à travers ANO1 joue un rôle critique dans la migration et/ou la prolifération cellulaire.

a Image schématique du dosage de l'insert de culture. b Test d'insert de culture dans un milieu avec ou sans T16A 5 μM. Fond clair à 0 h et coloration à la calcéine à 24 h. Les lignes pointillées blanches à 0 h indiquent les bordures des cellules. Le lavage indique le changement de milieu du milieu contenant du T16A au milieu de contrôle à 12 h. Les barres d'échelle indiquent 500 μm. c Mesures d'aires augmentées (aire Δ) à 12 ou 24 h dans le milieu avec ou sans 5 μM T16A. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 5). La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney. d Vitesse de migration des NHEK avec ou sans T16A 5 μM dans un test d'insert de culture. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 50). e Vitesse de migration moyenne à partir de (d). Chaque colonne indique la vitesse moyenne pendant la période de temps indiquée. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 50). La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney. f Dosage MTT des NHEK cultivées dans le milieu indiqué. L'ABS indique l'absorbance. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 6). La signification statistique a été déterminée avec l'ANOVA unidirectionnelle suivie de la correction de Dunnett.

a Essai d'insert de culture dans un milieu à faible teneur en chlorure ou un milieu témoin. Champs clairs à 0 h et coloration à la calcéine à 24 h. Les lignes pointillées blanches à 0 h indiquent les bordures des cellules. Le témoin 12 h indique un changement de milieu du milieu à faible teneur en chlorure au milieu témoin à 12 h. Les barres d'échelle indiquent 500 μm. b Mesures d'aires augmentées (aire Δ) à 12 ou 24 h en milieu pauvre en chlorure ou en milieu témoin. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 6). La signification statistique a été déterminée avec le test de Mann-Whitney ou une ANOVA à une voie suivie d'une correction de Tukey.

Bien que les résultats précédents aient suggéré l'importance des ions chlorure pour la migration et/ou la prolifération cellulaire, les rôles réels des ions chlorure dans les kératinocytes sont largement inconnus. Pour répondre à cette question, nous avons tenté de déterminer la direction du mouvement du chlorure. La perméation du chlorure à travers les canaux chlorure dépend des concentrations intracellulaires de chlorure et des potentiels membranaires. Bien que la fonction des canaux chlorure puisse affecter les concentrations intracellulaires de chlorure, elles devraient être maintenues par la fonction de plusieurs transporteurs de chlorure29. Par conséquent, nous avons examiné les profils d'expression des transporteurs de chlorure, y compris les cotransporteurs Na-K-Cl (NKCC) et les cotransporteurs K-Cl (KCC), en utilisant la RT-PCR. L'expression de l'ARNm des gènes codant pour NKCC1, KCC1, KCC2, KCC3 et KCC4 a été suggérée (Fig. 7a et Suppl. Fig. 11). KCC2 est un KCC spécifique aux neurones, et les concentrations de chlorure intracellulaire sont maintenues à un niveau bas grâce à l'efflux de chlorure par KCC2 dans les cellules du système nerveux central, et l'ouverture des canaux perméables au chlorure provoque un afflux de chlorure. Par conséquent, nous avons effectué des expériences d'imagerie de chlorure en utilisant l'indicateur de chlorure, MQAE30,31,32. Les concentrations calculées de chlorure intracellulaire des NHEK étaient relativement faibles (6, 8 ± 1, 3 mM) (Fig. 7b, c), ce qui est cohérent avec l'expression de KCC2 au moins au niveau de l'ARNm dans les NHEK. Le potentiel d'équilibre calculé pour les ions chlorure (-75,7 mV) suggère que l'influx de chlorure à travers ANO1 se produirait aux potentiels de membrane au repos rapportés dans les NHEK (-24 à -40 mV)33,34,35.

une évaluation RT-PCR des gènes de cotransporteur cation-chlorure dans les NHEK. RT indique une transcription inverse. Les images de gel non recadrées sont présentées dans Suppl. Fig. 11. b Une image représentative de l'indicateur fluorescent trempé aux ions chlorure, MQAE, dans les NHEK. La barre d'échelle indique 10 μm. c Une courbe d'étalonnage et des concentrations de chlorure intracellulaire calculées dans les NHEK. La courbe d'étalonnage a été réalisée avec un diagramme de Stern-Volmer, F0/F = 1 + Kq[Cl]. F0 : intensité de fluorescence à 0 mM de chlorure, F intensité de fluorescence à chaque concentration de chlorure, coefficient d'extinction Kq.

Des études antérieures ont suggéré que de faibles concentrations de chlorure intracellulaire induisent la phosphorylation de la protéine kinase activée par un mitogène (MAPK), bien que ses mécanismes précis ne soient pas bien connus. Les cascades MAPK sont impliquées dans la vie et la mort de nombreuses cellules36,37 (Fig. 8a). Par exemple, la kinase liée au signal extracellulaire (ERK), qui est phosphorylée par la kinase MAPK (MKK) 1/2, est impliquée dans la prolifération et la différenciation cellulaire. D'autre part, p38 et c-Jun N-terminal kinase (JNK), qui sont respectivement phosphorylées par MKK3/4/6 et MKK4/7, induisent l'arrêt du cycle cellulaire et l'apoptose. Par conséquent, nous avons étudié la phosphorylation de MAPK en utilisant une méthode Western blot (Fig. 8b, c et Suppl. Fig. 11). Un inhibiteur d'ANO1, T16A, a augmenté la phosphorylation de p38, mais pas celle de ERK ou JNK. Ces résultats suggèrent que ANO1 est impliqué dans l'arrêt du cycle cellulaire et/ou l'apoptose. Cependant, l'inhibition d'ANO1 n'a pas induit la mort cellulaire dans le test d'insertion de culture sur la base du fait que l'apparence cellulaire visualisée avec une coloration à la calcéine-AM n'a pas été affectée par l'inhibition d'ANO1 (Fig. 5). De plus, il n'y avait aucun effet du traitement T16A sur l'expression des gènes liés à la différenciation, y compris KRT1, IVL et TGM1, dans des conditions différenciées et indifférenciées (Suppl. Figs. 10, 11). Ce résultat est cohérent avec l'absence d'effets du traitement T16A sur la phosphorylation de ERK (Fig. 8b), qui est connue pour être liée à la différenciation (Fig. 8a). Par conséquent, nous avons décidé de nous concentrer sur l'arrêt du cycle cellulaire.

a Représentation schématique de la signalisation de la MAP kinase. b Images représentatives du Western blot pour les MAP kinases totales et les MAP kinases phosphorylées. Les images de gel non recadrées sont présentées dans Suppl. Fig. 11. c Analyse quantitative du Western blot pour les MAP kinases phosphorylées/totales. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 7 pour pERK et pp38, N = 4 pour pJNK. La signification statistique a été déterminée avec un test de Mann-Whitney.

Étant donné que les analyses MAPK suggéraient un arrêt du cycle cellulaire par inhibition de ANO1, nous avons effectué un test du cycle cellulaire en utilisant un colorant redox (Fig. 9). Les conditions redox sont étroitement liées au cycle cellulaire38. Par exemple, les conditions redox intracellulaires dans les cellules des phases G0/G1 sont relativement réductrices, alors que les conditions redox sont progressivement déplacées vers des conditions plus oxydatives lors de la progression vers les phases G2/M. Dans ce système de test, les cellules en phase G0/G1, en phase S et en phases G2/M peuvent être visualisées respectivement en jaune-vert, vert et bleu foncé (Fig. 9a). Pour clarifier la variation de couleur, chaque cellule a été visualisée en rouge en fonction des niveaux de signal (Fig. 9b). Le traitement par T16A a augmenté les populations cellulaires dans les phases G0/G1 et réduit les populations cellulaires dans la phase S pendant le test d'insert de culture (Fig. 9b, c). Ce résultat indique que la progression du cycle cellulaire de G0/G1 à la phase S a été supprimée par l'inhibition de ANO1.

a Une image représentative de la coloration du colorant redox pour l'analyse du cycle cellulaire. La barre d'échelle indique 100 μm. b Images représentatives de cellules en présence ou en l'absence de 5 μM de T16A dans l'insert de culture cellulaire. Les cellules marquées en rouge sont dans la phase indiquée. La barre d'échelle indique 500 μm. c Comparaison des pourcentages de chaque phase. Les données représentent les moyennes ± SEM (N = 7). La signification statistique a été déterminée avec une ANOVA unidirectionnelle suivie d'une correction de Dunnett.

Contrairement aux études précédentes, nos résultats ont montré que l'expression fonctionnelle des canaux TRP était limitée à TRPV3 et TRPV4, bien que l'expression d'ARNm d'un certain nombre d'autres canaux TRP ait été observée dans les NHEK (Fig. 1 et Suppl. Fig. 2). L'expression des protéines changerait selon les conditions de différenciation dans les kératinocytes39. Ainsi, les canaux TRP dont l'expression fonctionnelle n'a pas été confirmée dans nos expériences pourraient être fonctionnels dans d'autres conditions de différenciation spécifiques. En particulier, il a été rapporté que TRPV6 et TRPC6 étaient impliqués dans la différenciation des kératinocytes et que l'expression de TRPC6 était augmentée par des stimuli de différenciation40,41. Nous avons observé l'interaction TRPV3-ANO1 dans cette étude, et notre laboratoire a rapporté des résultats similaires pour TRPV4-ANO1 dans les cellules épithéliales2,3. Cependant, l'interaction entre ANO1 et d'autres canaux TRP dont l'expression fonctionnelle n'a pas été confirmée dans cette étude pourrait se produire dans des cellules différenciées.

TRPV4 est bien connu pour interagir avec ANO1, et TRPV3 s'est avéré être un nouveau partenaire candidat d'ANO1 dans les NHEK. Des expériences de patch-clamp ont montré une interaction TRPV3-ANO1 dans les cellules HEK293T et les NHEK (Fig. 2, 3 et Suppl. Fig. 11). De plus, TRPV3 a été co-immunoprécipité à l'aide d'un anticorps anti-ANO1 dans des cellules HEK293T exprimant à la fois TRPV3 et ANO1. Ces résultats suggèrent que TRPV3 et ANO1 forment un complexe avec un nanodomaine de calcium et que ANO1 est effectivement activé par le calcium entrant dans les cellules via TRPV3, comme c'est le cas avec TRPV4. Il est connu que les augmentations des concentrations intracellulaires de calcium en aval de l'activation du récepteur sensible au calcium (CaSR) induisent une différenciation dans les kératinocytes42. Ainsi, il pourrait y avoir deux types différents d'augmentation des concentrations de calcium intracellulaire : une locale via l'activation de TRPV3 qui active ANO1 et une globale qui peut être causée par plusieurs mécanismes tels que la signalisation CaSR.

Nous avons évalué la fonction physiologique de l'interaction TRPV3-ANO1. Une étude précédente a montré que TRPV3 était impliqué dans la cicatrisation des plaies dans les kératinocytes5. En effet, TRPV3 est sensibilisé par le récepteur du facteur de croissance épidermique (EGFR) suite à une stimulation par l'EGF libéré lors de la cicatrisation. De plus, le facteur de croissance transformant alpha (TGFα), un ligand de l'EGFR, est libéré des kératinocytes par l'activation de TRPV3. On pense que ce système autocrine représente l'un des mécanismes moléculaires de la cicatrisation des plaies via l'activité TRPV3. Nos essais avec des inserts de culture indiquent que l'inhibition de TRPV3 ou ANO1 réduit la migration et/ou la prolifération cellulaire (Fig. 5 et Suppl. Figs. 6, 9). Ainsi, l'interaction TRPV3-ANO1 pourrait être un mécanisme moléculaire important pour la cicatrisation de la peau, ce qui suggère qu'il existe deux processus de cicatrisation impliquant l'activité de TRPV3. Un rapport précédent suggérait que la localisation membranaire d'ANO1 est importante pour la migration des cellules cancéreuses indépendamment de l'activité du canal chlorure43. Dans cette expérience, seul CaCCinh-A01 a diminué la prolifération cellulaire et induit la dégradation de la protéine ANO1 parmi plusieurs inhibiteurs d'ANO1 (y compris T16A) qu'ils ont utilisés. Cependant, dans nos expériences, le traitement T16A a diminué la prolifération de NHEK sans effets sur les niveaux de protéine ANO1 (Fig. 5 et Suppl. Figs. 8, 11). De plus, notre découverte selon laquelle les conditions de faible teneur en chlorure inhibaient également la migration et/ou la prolifération cellulaire dans les tests d'inserts de culture (Fig. 6) confirme l'importance du mouvement du chlorure à travers ANO1 pour la cicatrisation des plaies.

Un autre rapport a révélé que ANO1 induit une hyperprolifération des cellules HaCaT, une lignée cellulaire spéciale de kératinocytes14, un résultat qui est cohérent avec nos résultats. Cependant, les auteurs ont montré que l'inhibition d'ANO1 réduisait la phosphorylation de ERK, l'une des MAPK, et ils n'ont pas discuté de l'implication de p38. Dans nos expériences, l'inhibition de ANO1 n'a pas affecté la phosphorylation de ERK, tandis que la phosphorylation de p38 a été induite. Cette différence pourrait être due au fait que HaCaT est une lignée cellulaire avec un besoin particulier en calcium qui diffère des kératinocytes normaux.

La direction du mouvement du chlorure est strictement régulée par l'équilibre des concentrations intracellulaires de chlorure et des potentiels membranaires. Par exemple, les concentrations intracellulaires de chlorure sont maintenues à un niveau bas par l'activité de KCC2 dans les neurones matures du système nerveux central29, entraînant une hyperpolarisation lors de l'influx de chlorure. Nous avons montré que les concentrations basales de chlorure intracellulaire dans les kératinocytes étaient faibles, ce qui est cohérent avec l'expression de KCC2 (Fig. 7 et Suppl. Fig. 11). Étant donné que les potentiels de membrane au repos des kératinocytes cutanés se situent entre -24 et -40 mV33,34,35, l'ouverture d'ANO1 devrait induire un afflux de chlorure et son inhibition diminue probablement les ions chlorure intracellulaires dans les kératinocytes. Bien que KCC2 soit généralement considéré comme spécifique aux neurones44, un rapport récent a montré que les cellules β pancréatiques exprimaient également KCC245, suggérant que KCC2 pourrait être plus largement exprimé que prévu. Étant donné que les kératinocytes et les neurones sont des cellules ectodermiques à l'origine46,47, il serait raisonnable que le KCC2 spécifique aux neurones puisse contrôler les concentrations intracellulaires de chlorure dans les neurones et les kératinocytes.

Dans les cellules cancéreuses, les diminutions des concentrations intracellulaires de chlorure induisent la phosphorylation de p38 et de JNK. Ce changement, à son tour, augmente l'expression de p21, conduisant à l'inhibition de la fonction du complexe CDK2/Cycline E, suivie de l'arrêt du cycle cellulaire dans la phase G148,49. Conformément aux rapports précédents dans les cellules cancéreuses, la phosphorylation de p38 a été induite par l'inhibition de ANO1 dans les NHEK (Fig. 8 et Suppl. Fig. 11). p38 est connu pour réguler négativement le cycle cellulaire36. Cette découverte, associée à la réduction de la prolifération cellulaire obtenue par l'inhibition de ANO1 (Fig. 5f), suggère que l'inhibition de ANO1 provoque un arrêt du cycle cellulaire. Comme prévu, le traitement T16A a augmenté la proportion de cellules dans les phases G0 / G1 et réduit les cellules dans la phase S dans le test d'insert de culture (Fig. 9b, c). Les résultats indiquent que l'arrêt du cycle cellulaire se produit entre les phases G0/G1 et la phase S. Cette découverte est cohérente avec les études précédentes qui ont montré que les cellules étaient arrêtées au point de contrôle G1/S lorsque les concentrations intracellulaires de chlorure étaient réduites dans les cellules cancéreuses48,49. Ainsi, ces observations suggèrent que le cycle cellulaire des kératinocytes est également contrôlé par des modifications des concentrations intracellulaires de chlorure en aval de la signalisation TRPV3-ANO1.

Notre étude suggère que TRPV3 induit un afflux de chlorure via ANO1. Cet afflux de chlorure pourrait maintenir correctement le cycle cellulaire grâce à l'inhibition de la phosphorylation de p38. Ainsi, les diminutions de la prolifération cellulaire causées par T16A (Fig. 5f) pourraient s'expliquer en partie par l'arrêt du cycle cellulaire par l'inhibition de ANO1. Nos données ont également montré que l'inhibition d'ANO1 ralentissait la migration cellulaire (Fig. 5d, e). Bien que les mécanismes de contrôle de la vitesse de migration par ANO1 soient inconnus, un rapport précédent a montré que des molécules inhibant le cycle cellulaire, telles que p21, réorganisaient le cytosquelette via une voie médiée par les ROS, régulant ainsi la migration cellulaire50. Ainsi, le chlorure pourrait également contrôler la migration cellulaire à travers les mêmes molécules qui inhibent le cycle cellulaire. Bien que le mécanisme exact par lequel le chlorure régule la phosphorylation de MAPK soit inconnu, les concentrations intracellulaires de chlorure pourraient réguler directement les niveaux de phosphorylation, comme indiqué pour la régulation de l'activité de la phosphatase51. Des études complémentaires sont certainement nécessaires pour clarifier les rôles du chlorure dans les voies de signalisation cellulaire des kératinocytes. Néanmoins, l'interaction de TRPV3 et ANO1 trouvée dans cette étude suggère qu'ils pourraient réguler positivement la prolifération et la migration des kératinocytes pendant la cicatrisation.

Cette étude démontre que l'ion chlorure est un régulateur du cycle cellulaire dans les kératinocytes. Ces données suggèrent de nouvelles approches pour favoriser la cicatrisation des plaies. L'hyperprolifération des kératinocytes est la cause de l'acné au niveau du site folliculaire. La normalisation de cette hyperprolifération est une stratégie thérapeutique importante pour l'acné52. Cependant, l'importance des ions chlorure dans un tel contexte thérapeutique n'a pas été soulignée. Notre analyse de l'interaction TRPV3-ANO1 représente un point de départ prometteur pour de futures investigations sur les mécanismes détaillés sous-jacents aux concentrations intracellulaires de chlorure. Ainsi, notre étude pourrait mettre en lumière l'importance des ions chlorure dans l'homéostasie cutanée.

Des souris homozygotes déficientes en TRPV3 (TRPV3-/-) ont été fournies par le Dr Patapoutian. Des souris de type sauvage (WT) et TRPV3−/− de fond C57BL/6 ont été maintenues dans des conditions SPF dans un environnement contrôlé (cycle lumière/obscurité de 12 h avec libre accès à la nourriture et à l'eau, 25 °C et 50 à 60 % d'humidité). Des souris mâles âgées de sept semaines ont été utilisées. Toutes les procédures ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de l'Institut national des sciences naturelles et effectuées conformément aux directives des Instituts nationaux de la santé et de l'Institut national des sciences physiologiques.

T16Ainh-A01 (T16A, Calbiochem) et Ani9 (Sigma-Aldrich) ont été utilisés comme inhibiteur Ano1. La dyclonine (MedChemExpress) a été utilisée comme inhibiteur de TRPV3. Les anticorps suivants ont été utilisés : anticorps de lapin anti-ANO1 (Abcam, ab53213, 1:5 pour Western blot), (Abcam, ab53212, 1:100 pour immunoprécipitation), anticorps de lapin anti-phospho-ERK (extracellular signal-related kinase) (Cell Signaling Technology, #4370, 1:1000), anticorps de lapin anti-phospho-p38 (Cell Signaling Technology, #4511, 1:10 00), anticorps de lapin anti-phospho-JNK (c-Jun N-terminal Kinase) (Cell Signaling Technology, #4668, 1:1000), anticorps de lapin anti-ERK (Cell Signaling Technology, #4695, 1:1000), anticorps de lapin anti-p38 (Cell Signaling Technology, #8690, 1:1000), anticorps de lapin anti-JNK (Cell Signaling Technology, #9252, 1:10 00), anticorps de souris anti-β-actine (Abcam, ab6276, 1:2500), anticorps de lapin anti-TRPV3 (Cell Signaling Technology, #3484, 1:1000 pour Western blot; 1:50 pour immunoprécipitation), anticorps anti-lapin-HRP (Cell Signaling Technology, #7074, 1:2000) et anti-souris-HRP (Cell Signaling Technology, #707 6, 1:2000).

Les cellules HEK293T (ATCC CRT-3216) ont été maintenues à 37 °C dans 5 % de CO2 dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (Wako) contenant 10 % de sérum bovin fœtal (BioWest), 50 unités/mL de pénicilline, 50 μg/mL de streptomycine (Life Technologies) et 2 mM/L de glutamine (GlutaMAX, Life Technologies). Des kératinocytes épidermiques humains normaux (NHEK, adulte, KURABO) ont été maintenus à 37 ° C dans 5% de CO2 dans Humedia-KG2 (KURABO). Le milieu MCDB153 personnalisé dépourvu de NaCl (Research Institute for Functional Peptides) a été utilisé pour les expériences à faible teneur en chlorure. Le milieu MCDB153 personnalisé a été utilisé en ajoutant du NaCl 130 mM ou de l'aspartate de sodium 130 mM et de l'O-phosphoryléthanolamine 0,1 mM (Sigma), de l'éthanolamine 0,1 mM (Sigma), de l'hydrocortisone 0,5 μg/mL (Sigma), du facteur de croissance épidermique 5 ng/mL (EGF, Miltenyi Biotec) et de l'insuline 5 μg/mL (Sigma).

Les kératinocytes cutanés ont été isolés sur la base de la description précédente avec des modifications mineures53. Brièvement, des queues de souris ont été utilisées pour préparer les kératinocytes. Les queues dissociées ont été incubées pendant une nuit à 4 °C dans 4 mg/mL DISPASE II (Wako, 383-02281) dans un milieu MCDB153 personnalisé (CSR) contenant 5 ug/mL d'insuline (Sigma, I1882), 0,4 ug/mL d'hydrocortisone (Sigma, H0888), 10 ug/mL de transferrine (Sigma, T8158), 14. 1 ug/mL de phosphoryléthanolamine (Sigma, P0503), 10 ng/mL de facteur de croissance épidermique (Sigma, E4127), 25 ug/mL de gentamicine (Gibco, 15710064), 50 unités/mL de pénicilline, 50 ug/mL de streptomycine et 40 ug/mL d'extraits hypophysaires bovins (Kyokuto, 20200). Après 16 h d'incubation, l'épiderme a été détaché et incubé avec 0,25 % de trypsine (Gibco, 15050065) pendant 20 min à température ambiante avec la couche basale vers le bas. Les kératinocytes ont ensuite été dissociés mécaniquement avec une pince à dissection et filtrés à travers un tamis cellulaire de 100 um. Les cellules ont ensuite été ensemencées sur des lamelles pour des expériences de patch-clamp. Tous les enregistrements ont été effectués les jours 3 et 4 après l'isolement.

L'ARN total a été purifié à partir de NHEK à l'aide de Sepasol-RNA I Super G (Nacalai Tesque) ou RNeasy Micro (QIAGEN). La transcription inverse a été réalisée à l'aide de la transcriptase inverse Super Script III (Invitrogen) pendant 50 min à 50 ° C. Pour l'étude de l'expression de l'ARNm des potentiels de récepteurs transitoires (TRP), des anoctamines (ANO) et des Cation-Chloride-Cotransporters (CCC) dans les NHEK, des fragments d'ADN ont été amplifiés à l'aide d'EmeraldAmp PCR Master Mix (TAKARA) avec des amorces PCR présentées dans le tableau 1. Les produits PCR ont été confirmés par électrophorèse sur un gel d'agarose à 2 % contenant du bromure d'éthidium.

Les protéines ont été extraites des NHEK traitées avec du T16A 10 μM ou du milieu témoin pendant 13 h. Les cellules ont été lavées avec du PBS froid et lysées par traitement avec un tampon de lyse (1% de Triton X-100 contenait 150 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 1 mM d'EDTA, 1 mM de Na3VO4 et un cocktail d'inhibiteurs de protéase, cOmplete (Roche), pH 7,5). Après centrifugation à 10 000 x g pendant 30 s, les surnageants ont été dénaturés par traitement avec un tampon SDS contenant 0,5 M Tris-HCl, 10 % de dodécylsulfate de sodium, 6 % de β-mercaptoéthanol, 10 % de glycérol, 0,01 % de bleu de bromophénol, 100 mM de dithiothréitol, à 90 °C pendant 5 min. Les échantillons de protéines ont été utilisés en SDS-PAGE.

La transfection transitoire de cellules HEK293 a été réalisée avec le réactif de transfection lipofectamine (Life Technologies), le réactif PLUS (Life Technologies) et le milieu sérique réduit Opti-MEM I (Life Technologies). Les ADN plasmidiques (hTRPV6/pcDNA3.1, hTRPV3/pcDNA3, hANO1/pcDNA3.1 ou pcDNA3.1) ont été transfectés avec pGreen Lantern 1 dans des cellules HEK293T, et les cellules transfectées ont été utilisées pour l'enregistrement patch-clamp et l'immunoprécipitation 16 à 30 h après la transfection.

Les NHEK sur des lamelles ont été incubées à 37 ° C pendant 30 min dans Humedia-KG2 contenant 5 μM de Fura-2-acétoxyméthyl ester (Molecular Probes). Les lamelles ont été lavées avec une solution de bain standard contenant 140 mM de NaCl, 5 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 10 mM d'HEPES et 10 mM de d-glucose à pH 7,4, ajusté avec du NaOH. Une solution de bain sans calcium a été préparée en omettant CaCl2 2 mM de la solution de bain standard et en ajoutant 5 mM d'EGTA. Fura-2 a été excité avec des lumières de longueur d'onde de 340 et 380 nm et l'émission a été surveillée à 510 nm avec une caméra CCD, Cool Snap ES (Roper Scientific/Photometrics) à température ambiante. Les données ont été acquises à l'aide du logiciel de laboratoire IP (Scanalytics) et analysées avec le logiciel ImageJ (National Institutes of Health). L'ionomycine (5 μM, Sigma-Aldrich) a été appliquée pour confirmer la réponse maximale de chaque cellule. La solution de bain à teneur élevée en K+ contenait 65 mM de NaCl, 80 mM de KCl, 2 mM de CaCl2, 2 mM de MgCl2, 10 mM d'HEPES et 10 mM de d-glucose à pH 7,4, ajusté avec du NaOH.

Des cellules HEK293T transfectées, des NHEK ou des kératinocytes de souris isolés ont été utilisés pour les enregistrements de cellules entières. Les pipettes patch ont été fabriquées à partir de verre borosilicaté (type 8250, King Precision Glass) avec un protocole en cinq étapes utilisant un P-2000 (Sutter Instrument). La résistance de la pipette était de 3 à 8 MΩ. Les courants ont été enregistrés à 10 kHz à l'aide d'un amplificateur Axopatch 200B (Molecular Devices) et filtrés à 5 kHz avec un filtre passe-bas. Les courants ont été numérisés avec un Digidata 1440 A ou 1550 (Axon Instruments). L'acquisition des données a été réalisée avec le logiciel pCLAMP 10 (Axon Instruments). Quatre solutions extracellulaires pour l'enregistrement de cellules entières étaient les suivantes : (1) une solution de bain standard (NaCl 140 mM, KCl 5 mM, CaCl2 2 mM, MgCl2 2 mM, HEPES 10 mM et d-glucose 10 mM à pH 7,4, ajusté avec NaOH) ; (2) une solution de bain NMDG-Cl (140 mM NMDG, 140 mM HCl, 2 mM CaCl2, 2 mM MgCl2, 10 mM HEPES et 10 mM d-glucose à pH 7,4, ajusté avec HCl); (3) une solution de bain NMDG-Cl sans calcium qui a été préparée en omettant 2 mM de CaCl2 de la solution de bain NMDG-Cl et en ajoutant 5 mM d'EGTA, et (4) une solution de bain NMDG-aspartate qui a été préparée en utilisant de l'acide l-aspartique au lieu de HCl. Les solutions de pipette étaient les suivantes : (1) une solution de pipette standard (KCl 140 mM, EGTA 5 mM, MgCl2 2 mM et HEPES 10 mM à pH 7,3, ajusté avec KOH) ou (2) une solution de pipette NMDG-Cl (NMDG 140 mM, HCl 140 mM, BAPTA 5 mM, MgCl2 2 mM et HEPES 10 mM à pH 7.3, ajusté avec HCl). Du CaCl2 a été ajouté à la solution de la pipette de sorte que la concentration en calcium libre soit de 100 ou 500 nM. Les concentrations de calcium libre ont été calculées avec le programme MAXC de l'Université de Stanford.

Les protéines ont été extraites des cellules HEK293T après transfection. Les cellules ont été lysées comme décrit dans le Western blot. Après centrifugation à 16 100 xg pendant 30 min, les surnageants ont été incubés dans un rotateur pendant 2 h avec de la protéine G Mag Sepharose (GE Healthcare). Après le retrait des billes magnétiques, les surnageants ont été incubés dans un rotateur pendant une nuit avec un anticorps anti-TRPV3 ou un anticorps anti-ANO1. Après incubation, la protéine G Mag Sepharose a été ajoutée et les solutions ont été incubées dans un rotateur pendant 2 h. Après incubation, les billes magnétiques ont été rincées avec du tampon de lavage (Tris-HCl 50 mM, NaCl 150 mM, pH 7,5). Les protéines ont été dénaturées par un tampon SDS à 95°C pendant 5 min. Les échantillons de protéines ont été évalués par SDS-PAGE. Le transfert a été effectué avec des anticorps anti-TRPV3 et anti-HRP de lapin.

Les NHEK ont été ensemencées de manière confluente dans des inserts de culture à deux puits (ibidi) sur des plats à fond de verre (Matsunami). Les inserts de culture ont été retirés après une nuit d'incubation, puis lavés avec du PBS. Les cellules ont ensuite été cultivées dans du milieu Humedia-KG2, MCDB153 ou un milieu MCDB153 à faible teneur en chlorure. Après 12 ou 24 h de culture, de la calcéine-AM (Dojindo) a été ajoutée au milieu de culture pour visualiser les cellules. Le logiciel ImageJ a été utilisé pour l'analyse des données. Pour l'analyse accélérée, les cellules ont été cultivées dans un incubateur Stage Top (TOKAI HIT) sur un microscope confocal à balayage laser (IX83 Olympus) et les images ont été capturées toutes les 10 minutes.

Les NHEK ont été ensemencées sur des plaques 96 puits (Falcon). Les cellules ont été cultivées dans un milieu témoin, 10, 5 ou 2,5 μM contenant du T16A pendant 24 ou 48 h. Après la culture, les tests MTT ont été effectués à l'aide d'un kit de test de prolifération cellulaire MTT (Cayman). L'absorbance du formazan a été mesurée avec un lecteur de microplaques (Multiskan Spectrum, Thermo Fisher) à 570 nm.

Les NHEK ont été ensemencés sur des plats à fond de verre (Matsunami). Les cellules ont été incubées avec 10 mM MQAE (indicateur fluorescent à ions chlorure, Dojindo) pendant 60 min à 37 ° C dans un incubateur Stage Top (TOKAI HIT) sur un microscope confocal à balayage laser (LSM 510META, Carl Zeiss). MQAE a été excité à 780 nm à l'aide d'un système laser d'excitation à deux photons (Mai Tai, Spectra-Physics) et l'émission était à 458–479 nm.

La solution d'étalonnage de chlorure 0 mM contenait 10 mM NaNO3, 140 mM KNO3, 0,5 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM Mg(NO3)2, 10 mM HEPES et 5 mM d-glucose à pH 7,4, ajusté avec CsOH. La solution d'étalonnage de chlorure 100 mM contenait 10 mM NaNO3, 100 mM KCl, 40 mM KNO3, 0,5 mM Ca(NO3)2, 0,5 mM Mg(NO3)2, 10 mM HEPES et 5 mM d-glucose à pH 7,4, ajusté avec CsOH. La solution d'étalonnage de chlorure 50 mM a été préparée en mélangeant une solution d'étalonnage de chlorure 0 et 100 mM 1:1. Chaque solution d'étalonnage a été utilisée en ajoutant de la nigéricine (ionophore cationique monovalent), de la valinomycine (ionophore potassique) et du tributylétain (ionophore chlorure) de sorte que les concentrations finales soient respectivement de 5, 10 et 10 μM. Toutes les expériences ont été faites à 37 °C.

Les NHEK ont été ensemencés de la même manière que le test de cicatrisation. Après avoir retiré l'insert de culture à 12 h, les cellules ont été colorées avec un kit d'analyse du cycle cellulaire Cell-Clock (Biocolor). Le logiciel ImageJ a été utilisé pour l'analyse des données. La distribution des phases du cycle cellulaire a été définie comme la couleur seuil. Les cellules en phase G2/M (bleu foncé) ont été définies comme Hlu 0–255, Saturation 40–255, Luminosité 0–90. Les cellules en phase S (vertes) ont été définies comme Hlu 70–255, Saturation 40–255, Luminosité 90–255. Les cellules en phase G0/G1 (jaune-vert) ont été définies comme Hlu 0–70, Saturation 40–255, Luminosité 90–255.

Les données ont été exprimées en moyennes ± SEM. L'analyse statistique a été réalisée à l'aide du test bilatéral de Mann-Whitney ou de l'ANOVA unidirectionnelle pour calculer la signification des différences entre les deux groupes. La correction de Bonferroni ou le test de Dunnett a été utilisé pour calculer la signification des différences entre les comparaisons multiples. p < 0,05 était considéré comme significatif.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Toutes les données et tous les matériaux utilisés dans l'analyse sont disponibles dans le texte principal avec des figures et des informations supplémentaires. Toutes les images de gel non recadrées sont disponibles dans Suppl. Figues. 11. Les données d'analyse statistique étaient disponibles dans les données supplémentaires 1. D'autres données ou informations étayant les conclusions de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant MT ([email protected]), sur demande.

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Ce travail a été soutenu par des subventions à MT d'une subvention d'aide à la recherche scientifique du ministère de l'Éducation, de la Culture, des Sports, de la Science et de la Technologie au Japon (#21H02667 et #20H05768 ; Recherche scientifique sur les domaines innovants "Biologie thermique").

Groupe de biologie thermique, Centre de recherche exploratoire sur la vie et les systèmes vivants (ExCELLS), 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8787, Japon

Yu Yamanoi, Jing Lei et Makoto Tominaga

Division de la signalisation cellulaire, Institut national des sciences physiologiques, 5-1 Higashiyama, Myodaiji, Okazaki, Aichi, 444-8787, Japon

Yu Yamanoi, Jing Lei et Makoto Tominaga

Laboratoire de recherche, Ikedamohando Co., Ltd., 16 Jinden, Kamiichi, Nakaniikawa, Toyama, 930-0394, Japon

Yu Yamanoi

Département de physiologie, École de médecine de l'Université Showa, Tokyo, 142-8555, Japon

Yasunori Takayama

Département de physiologie clinique et translationnelle, Université pharmaceutique de Kyoto, 5 Nakauchi-cho, Misasagi, Yamashina-ku, Kyoto, 607-8414, Japon

Shigekuni Hosogi

Organisation de recherche en science et technologie, Université Ritsumeikan, Kusatsu, 525-8577, Japon

Yoshinori Marunaka

Institut de recherche médicale, Kyoto Industrial Health Association, Kyoto, 604-8472, Japon

Yoshinori Marunaka

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YY, YT, JL et MT ont conçu des expériences et interprété des données. YY et JL ont réalisé des expériences et analysé les données. SH et YM ont contribué à l'expérience d'imagerie du chlorure. Le manuscrit a été préparé par YY, YT et MT. Tous les auteurs ont discuté des résultats et commenté le manuscrit.

Correspondance à Makoto Tominaga.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Communications Biology remercie Viktorie Vlachova, KeWei Wang et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédacteurs en chef de la manipulation principale : Janesh Kumar et Zhijuan Qiu. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles

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Réimpressions et autorisations

Yamanoi, Y., Lei, J., Takayama, Y. et al. L'interaction TRPV3-ANO1 régule positivement la cicatrisation des plaies dans les kératinocytes. Commun Biol 6, 88 (2023). https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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Reçu : 03 avril 2022

Accepté : 13 janvier 2023

Publié: 23 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42003-023-04482-1

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