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Oct 21, 2023

Le cycle des triglycérides permet la modification des acides gras stockés

Nature Métabolisme volume 5,

Nature Metabolism volume 5, pages 699–709 (2023)Citer cet article

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Le cycle des triglycérides est le processus de dégradation continue et de re-synthèse des triglycérides dans les réserves cellulaires. Nous montrons dans les adipocytes 3T3-L1 que les triglycérides sont sujets à un renouvellement rapide et à un réarrangement des acides gras avec une demi-vie estimée de 2 à 4 h. Nous développons une technologie de traçage qui peut suivre simultanément et quantitativement le métabolisme de plusieurs acides gras pour étudier le cycle du substrat futile des triglycérides directement et avec une résolution des espèces moléculaires. Notre approche est basée sur les traceurs d'acides gras alcynes et la spectrométrie de masse. Le cycle des triglycérides est lié à la modification des acides gras libérés par élongation et désaturation. Par le cycle et la modification, les acides gras saturés sont lentement convertis en acides gras monoinsaturés et l'acide linoléique en acide arachidonique. Nous concluons que le cycle des triglycérides rend les acides gras stockés accessibles pour une altération métabolique. Le processus global facilite les ajustements cellulaires au pool d'acides gras stockés pour répondre aux besoins changeants de la cellule.

Le cycle triglycéride/acide gras (TG/FA) est le processus de dégradation partielle ou complète des graisses stockées pour libérer les FA libres qui sont ensuite utilisés pour resynthétiser une nouvelle molécule de TG. D'une part, cela peut avoir lieu au niveau de tout le corps, où les AG libres libérés du tissu adipeux peuvent être réestérifiés en TG dans le foie, conduisant à la redistribution de l'énergie stockée par l'organisme1. D'autre part, il se déroule également au niveau intracellulaire, comme un cycle de substrat « futile » typique qui consomme de l'énergie sans synthèse nette de matériel biologique2. Le cycle du substrat intracellulaire en général est un défi scientifique à la fois conceptuel et expérimental. D'un point de vue conceptuel, la question est de savoir si les effets bénéfiques des cycles de substrat pourraient compenser les coûts énergétiques ou si le cycle de substrat est une imperfection inévitable des réseaux complexes. Les premières recherches sur le cycle TG/FA mettaient l'accent sur son rôle régulateur, notamment dans l'adaptation aux changements rapides de la consommation d'énergie3,4, alors que les coûts énergétiques du cycle étaient considérés comme faibles5. Ces dernières années, cependant, un intérêt croissant pour le cycle est né de l'idée qu'il pourrait contribuer de manière substantielle à la thermogenèse dans le tissu adipeux6,7. Une meilleure compréhension des voies thermogéniques pourrait conduire à de nouvelles stratégies pour influencer la dépense énergétique, éventuellement utiles dans la lutte contre la pandémie mondiale d'obésité8,9.

Les limites de la technologie expérimentale sont un obstacle majeur à une meilleure compréhension du cycle TG/FA. Lors de l'utilisation d'un marquage isotopique conventionnel, la détermination précise et directe du taux et des voies de recyclage est un défi pour le traçage métabolique, car les éduits et les produits peuvent devenir indiscernables déjà après un cycle de cycle (Fig. 1a). Par conséquent, les méthodes existantes pour étudier le cycle TG/FA sont plutôt indirectes. Les déterminations ratiométriques de l'incorporation de [3H]FA et de [14C]glucose avec détermination parallèle de la libération de glycérol10 ou des stratégies similaires avec des isotopes stables3 ont donné des informations sur le degré d'estérification et de réestérification des FA à partir desquelles le cycle pouvait être déduit au moins en termes relatifs. D'autres méthodes utilisent l'étiquetage [2H]H2O ou [18O]H2O. L'enrichissement de ces isotopes en TG a fourni des informations sur la synthèse totale et le renouvellement de TG11. Pourtant, une expérience de traçage direct pour montrer qu'un pool 1 de TG cellulaire défini donnerait naissance à un nouveau pool 2 en réutilisant les FA du pool 1, comme illustré sur la figure 1b, est manquant. Cela nécessiterait une expérience de marquage avec un traçage multiparallèle complet de toutes les molécules de TG marquées possibles, ce qui représente un énorme défi technique. Nous avons récemment développé une technologie de traçage basée sur des FA marqués par des alcynes avec des reporters à chimie de clic et une spectrométrie de masse (MS)12,13. Il combine toutes les caractéristiques nécessaires à l'étude du cycle TG/FA : haute sensibilité, spécificité sans équivoque et, en particulier, discrimination aisée des espèces lipidiques mono- et multi-marquées12.

Le cycle des TG consiste en une dégradation permanente des molécules de TG et une resynthèse concomitante. a, Représentation schématique de la dégradation et de la resynthèse. Les lignes bleues symbolisent les AG et la ligne horizontale noire le squelette du glycérol. Le cycle TG doit au moins comprendre une dégradation en DG mais peut inclure une dégradation supplémentaire en MG ou en glycérol libre. Tous les AG libérés sont censés alimenter un pool commun qui devient activé en acyl-CoA et peut être utilisé pour la ré-acylation. Le glycérol n'est pas sujet à la ré-acylation dans les adipocytes et est libéré dans le milieu. b, Lors du cycle, les TG avec plus d'un FA étiqueté (lignes rouges) équilibreront leur étiquette avec le pool non étiqueté (bleu), déplaçant l'étiquette des espèces multi-étiquetées aux espèces mono-étiquetées. Avec la technologie dédiée développée dans la présente étude, ce processus peut être suivi avec une résolution moléculaire dans le temps.

Dans ce qui suit, nous appliquerons cette technologie pour fournir des preuves directes du cycle TG/FA, donner une estimation de la demi-vie des TG dans le processus de cycle et démontrer que le cycle TG est nécessaire à l'homéostasie du pool FA stocké.

Dans une expérience de traçage conventionnelle, une substance à marquage unique est ajoutée à un système et ses métabolites sont suivis dans le temps, avec une affectation logique claire des métabolites marqués au marqueur d'origine. Cependant, les adipocytes sont exposés au mélange diversifié d'AG provenant de l'alimentation, avec une large gamme de longueurs et de nombres de doubles liaisons qui forment des espèces mixtes dans les TG stockés. Pour tracer la synthèse et le renouvellement des TG, un ensemble tout aussi diversifié d'AF différents devrait être utilisé comme traceurs, ce qui nécessiterait par la suite une identification sans équivoque de l'étiquette dans chaque métabolite possible. Par conséquent, la complexité maximale du mélange de marquage est limitée par la discrimination analytique possible. Pour couvrir une large gamme de longueurs et de degrés d'insaturation avec seulement trois composés, nous combinons un alcyne-FA saturé à chaîne moyenne, un alcyne-FA saturé à longue chaîne et un alcyne-FA polyinsaturé à longue chaîne (alcyne-PUFA). Pour distinguer sans équivoque les trois FA lors d'un traçage simultané, nous utilisons un alcyne-FA impair et un pair en combinaison avec un troisième alcyne-FA qui porte en outre un marqueur isotopique stable. Les deux premiers, lorsqu'ils sont combinés métaboliquement avec des AG endogènes pairs, conduiraient à des métabolites impairs et pairs distincts, respectivement. Les métabolites du troisième traceur pourraient facilement être discriminés par le marqueur isotopique. En conséquence, nous avons combiné le milieu à chaîne impaire FA 11: 0; Y (Fig. 2a; pour la nomenclature des lipides alcynes, voir Méthodes) avec l'alcyne-PUFA à chaîne paire 18: 2; Y et le FA 13C9-16: 0; Y à longue chaîne saturée marquée par un isotope. Nous combinons en outre ce triple multi-étiquetage avec la stratégie de multiplexage d'échantillon quadruple précédemment établie12. Cela permet d'économiser du temps et de l'argent tout en améliorant la comparabilité des données, ce qui se traduit par une caractérisation qualitative et quantitative complète des espèces lipidiques marquées (Extended Data Fig. 1).

a, Structures des FA;Y utilisées pour l'étiquetage. b, Incorporation de FA;Y par classe de lipides pour trois apports différents de FA;Y. Les nombres sont des pmol par classe de lipides par puits. c, Total incorporé FA; Y dans les principales classes de lipides lors du marquage avec la combinaison 11/16/18 comme décrit à la Fig. 1b. Les nombres sont des pmol de FA;Y respectifs par puits. Toutes les valeurs sont des moyennes ± sd, n = 4.

Pour établir la séparation des signaux MS provenant des différents FA;Y et pour étudier l'influence mutuelle des trois FA;Y, nous avons marqué les adipocytes 3T3-L1 différenciés avec les trois FA;Y individuellement et dans toutes les combinaisons possibles (Extended Data Fig. 2), comme dans ce qui suit, appelé «l'expérience de calibrage». Ensuite, nous avons analysé le schéma de distribution de chaque espèce identifiée sur les huit combinaisons de marquage et attribué l'espèce à l'alcyne-FA respectif. La procédure est illustrée et expliquée plus en détail dans Extended Data Fig. 3. Les affectations de l'expérience d'étalonnage ont été traduites dans des fichiers de recherche en langage de requête de fragment moléculaire LipidXplorer (mfql) qui ont été optimisés pour atteindre une couverture maximale des affectations avec exclusion parallèle des espèces ambiguës. Cette stratégie a été élargie pour analyser et attribuer d'autres classes de lipides, y compris les espèces multi-marquées qui contiennent plus d'un FA marqué. Il est important de noter que, également pour les TG doublement marqués; Y2, une séparation nette des signaux a été obtenue (Extended Data Fig. 4). L'analyse complète finale a couvert huit classes de lipides, représentant les produits quantitativement pertinents de l'assimilation des AG, à savoir l'ester de stérol (CE), le céramide (Cer), le diglycéride (DG), l'acide phosphatidique (PA), la phosphatidylcholine (PC), la phosphatidyl éthanolamine (PE), le phosphatidyl inositol (PI) et le TG. Cette analyse incluait à la fois les espèces mono-étiquetées et multi-étiquetées. Ce dernier était particulièrement important pour le TG;Yn marqué. Un mélange de 16 étalons internes marqués a permis la quantification des quantités de pmol. Après optimisation des 131 fichiers de recherche mfql requis, la durée d'exécution d'une analyse multi-étiquetage n'était que de 5 à 10 minutes, en fonction du nombre d'échantillons et des performances du matériel. Pour l'expérience d'étalonnage, l'analyse a livré 406 espèces lipidiques marquées. Les TG marqués étaient dominants, avec 127 espèces à marquage unique, 128 à double marquage et 10 à marquage triple, suivis des PC marqués (46 espèces) et des DG (40 espèces). Les trois marqueurs alcyne-FA étaient bien représentés, avec 121 espèces pour FA 11:0;Y, 181 pour FA 16:0;Y et 179 pour FA 18:2;Y. Étant donné que chaque échantillon a été quadruple multiplexé, un seul échantillon analysé sur l'instrument MS a livré jusqu'à 1 600 espèces marquées, chacune identifiée et quantifiée sans équivoque.

Les trois AG alcynes (Fig. 2a) ont été incorporés en quantités similaires dans les cellules (Fig. 2b), indépendamment du fait qu'ils aient été appliqués individuellement ou en combinaisons. Cela indiquait que la machinerie d'absorption et d'estérification des AG n'était pas saturée dans notre expérience. La séparation nette des produits des trois FA; Y, comme en témoigne le schéma quantitatif des identifications de la Fig. 2b, est une condition préalable à l'analyse ultérieure de la distribution des marqueurs dans les cellules triplement marquées (Fig. 2c). Le FA 11:0;Y à chaîne moyenne avait une nette préférence pour TG et DG, tandis que les deux FA;Y à longue chaîne se trouvaient à la fois dans les phospholipides et dans les lipides neutres. Parmi les phospholipides, le FA 18:2;Y polyinsaturé était plus abondant que le FA 16:0;Y saturé. Au sein des TG, FA 11: 0; Y a préféré les TG à marquage unique, tandis que les autres FA; Y ont été également trouvés dans les espèces de TG à marquage simple et double.

Avec la nouvelle méthode, nous avons effectué une analyse résolue dans le temps du renouvellement des lipides dans les adipocytes 3T3-L1. Les cellules ont été marquées pendant 1 h avec les trois entrées FA;Y, chacune à 50 µM, suivies de temps de chasse de 0, 6, 24 et 48 h. Après la chasse, les lipides cellulaires ont été extraits et analysés pour les espèces marquées. L'ensemble quantifié complet des lipides identifiés ainsi que certaines annotations se trouvent dans les données supplémentaires 1 au format Excel. Les quantités totales de marqueur dans les principales classes de lipides ont été déterminées (Fig. 3). Le FA;Y total incorporé était à peu près constant dans le temps pour le FA 16:0;Y, a montré une augmentation modérée pour le FA 18:2;Y, mais a montré une forte diminution pour le FA à chaîne moyenne 11:0;Y (Fig. 3b).

a, conception de base d'une expérience de poursuite d'impulsions. Les cercles symbolisent les puits de la plaque 24 puits, contenant des adipocytes 3T3-L1 différenciés. Les numéros 16/11/18 font référence au comptage C de l'entrée FA;Y (Fig. 2) utilisée à 50 µM pendant 1 h. Après incubation, les milieux ont été retirés et remplacés par des milieux de chasse pendant les durées indiquées. Ensuite, les cellules ont été lavées et les lipides extraits en présence d'étalons internes. Les lipides extraits ont été soumis à une réaction de clic avec les molécules rapporteuses C175-7x indiquées à droite, et les échantillons ont été regroupés puis analysés par MS1/MS2 multiplexé. Les espèces étiquetées identifiées ont été quantifiées, additionnées et tracées sur le temps de chasse pour le total (b) et séparément pour TG (c), DG (d), PA (e), PC (f), PE (g) et PI (h). Dans les panneaux b à e, les sommes des espèces mono- et multi-étiquetées sont présentées. Pour la PE (g), aucune espèce doublement marquée n'a été détectée ; pour PI (h), il y avait des signaux très faibles d'espèces à double marquage qui n'ont pas pu être quantifiés en raison de l'absence d'un standard interne PI; Y2. Toutes les valeurs sont moyennes ± sd, n = 11–12. Les barres d'erreur inférieures à la taille du symbole sont omises pour plus de clarté.

Notez que ces nombres et les suivants comprennent le FA;Y d'origine ainsi que les métabolites possibles des réactions d'élongation, de désaturation ou de dégradation partielle. Comme prévu pour un modèle d'adipocyte, la plupart des AG marqués ont été incorporés dans TG (Fig. 3c). Conformément à sa perte dans le total, FA 11:0;Y dans TG;Y a également montré une forte diminution, tandis que la quantité de FA;Y à longue chaîne dans TG;Y est restée constante (FA 16:0;Y) ou a augmenté (FA 18:2;Y) pendant la chasse. Environ la moitié de cette augmentation pourrait s'expliquer par l'augmentation du total (Fig. 3b), et la majeure partie du reste par un flux de FA; Y de DG marqué (Fig. 3d) et PC (Fig. 3f) vers TG marqué.

Ensuite, nous avons analysé la distribution de FA;Y dans les trois pools TG;Yn par traçage parallèle de plus de 200 espèces. Au cours de la période de chasse, nous avons constaté une augmentation massive des espèces TG; Y1 à marquage unique, en particulier celles contenant des FA; Y à longue chaîne (Fig. 4a), avec une forte diminution concomitante des trois FA; Y chez les espèces TG; Yn à double et triple marquage (Fig. 4b, c). Ce comportement peut également être directement observé dans les spectres originaux qui visualisent les lipides neutres marqués par un alcyne par leur perte neutre (NL) de 73, 1 m / z (Extended Data Fig. 5). La cinétique de ces diminutions était différente pour les espèces TG;Yn doublement et triplement marquées. Après 6 h, 46, 7 ± 4, 1% du TG; Y2 initial étaient toujours présents (Fig. 4b), contrairement à 36, 5 ± 3, 5% du TG; Y3 initial (Fig. 4c). En ce qui concerne la diminution de TG;Y3, il y avait très peu de différence relative entre les trois entrées FA;Y; en ce qui concerne TG;Y2, le FA;Y à chaîne moyenne a diminué légèrement plus rapidement (quantité résiduelle après 6 h : FA 11 : 0 ; Y, 44,0 % ; FA 16 : 0 ; Y, 47,6 % ; FA 18 : 2 ; Y, 49,0 %) que les deux traceurs à longue chaîne. Pour les trois FA;Y ensemble, les données ont été tracées sous forme de fraction de FA;Y total qui se trouve dans TG;Y1, TG;Y2 et TG;Y3 (Fig. 4d). Ils démontrent la redistribution de FA;Y des espèces triplement et doublement marquées vers les TG;Y1 monomarqués. Le cycle TG est la seule explication cohérente de cette observation. Le cycle le plus simple consisterait en une hydrolyse de TG produisant DG + FA et une ré-acylation ultérieure en TG (Fig. 4e). La rangée du haut montre la situation après la période d'étiquetage d'une heure. Au cours de l'étiquetage des impulsions, l'entrée FA;Ys (rouge) est une fraction majeure du total FA qui est utilisé pour la synthèse de TG, résultant en une grande fraction d'espèces de TG multi-marquées. En chiffres, le pool marqué TG; Yn contenait 94 pmol de TG; Y3, 1 017 pmol de TG; Y2 et 3 030 pmol de TG; Y1 à la fin de l'impulsion, fournis sous forme de chiffres noirs au-dessus des symboles supérieurs (Fig. 4e). En outre, il existe le pool non marqué de TG endogène de 138 000 ± 7 000 pmol, tel qu'obtenu à partir de la lipidomique de TG non marqué dans les mêmes échantillons. Suite à un équilibrage binominal théorique, la dilution de l'étiquette peut être calculée (numéros bleus) pour un cycle complet TG → DG → TG, prédisant une diminution de 55 % de TG;Y2 et une augmentation de 45 % de TG;Y1, ce qui est proche de la situation au temps de chasse de 6 h. La figure 4f montre une autre manière de représenter les données. Les lignes représentent la distribution binominale théorique des FA;Y totaux sur les trois classes de TG;Yn, en fonction de la fraction des FA;Y dans les FA totaux du pool TG. Pour chacun des quatre points temporels expérimentaux, nous avons maintenant déterminé la position des données le long de l'axe des x qui correspondrait le mieux à une distribution binominale. Pour l'impulsion seule, cela se traduit par une fraction totale de FA;Y dans le total de TG;Yn synthétisé de 26 %. Ce nombre indique que pendant la période d'étiquetage, les FA;Y marqués ont contribué à 26 % de tous les FA qui ont été acylés en TG. En l'absence de cycle TG, les quantités relatives des trois espèces TG;Yn marquées resteraient constantes dans le temps. Cependant, les données expérimentales indiquent qu'avec l'augmentation du temps de chasse, le FA;Y marqué se propage du petit pool d'origine à des tailles de pool croissantes correspondant à une teneur en marqueur de 12 %, 5 % et 3,5 %. Ce processus de cyclage-dilution explique également pourquoi TG;Y3 a disparu plus rapidement que TG;Y2. À moins que les enzymes dégradant les TG ne puissent détecter le nombre de triples liaisons dans une espèce de TG, pour laquelle il n'y a jusqu'à présent aucune indication, TG;Y2 et TG;Y3 seraient dégradés au même rythme. Les différences apparentes dans la cinétique de dégradation sont dues aux différentes statistiques de la ré-acylation de DG;Y1 et DG;Y2 en TG;Y2 et TG;Y3, respectivement. Quantitativement, ces données indiquent que le temps de chasse de 6 h correspond à environ 1,5 t1/2, suggérant un t1/2 d'environ 4 h. Nous avons ensuite demandé si le cycle observé dépendait d'une combinaison spécifique de marqueurs FA et si le marqueur alcyne en tant que tel pouvait être la cause du phénomène de cycle (Fig. 4g – j). Par conséquent, nous avons effectué une expérience de poursuite d'impulsions comme décrit ci-dessus, mais avec différentes combinaisons de FA, c'est-à-dire FA 11: 0; Y/16: 0; Y/18: 2; Y (Fig. 4g) ou FA 16: 0; Y/ 18: 2; Y/19: 1; Y (Fig. 4i). Le FA 19:1;Y a déjà été utilisé dans les hépatocytes12,13 et est un bon analogue de l'acide oléique. Cette dernière combinaison de FA est un imitateur proche de la composition naturelle des FA des cellules à l'étude en ce qui concerne la longueur de la chaîne et le nombre de doubles liaisons (voir le tableau supplémentaire 1 pour une analyse détaillée des nombres moyens d'atomes de C et de doubles liaisons pour les expériences de marquage illustrées à la Fig. 4g – j). La comparaison des données des deux combinaisons de FA (Fig. 4g, i) montre que le cycle est indépendant de la présence d'un FA à chaîne moyenne et se déroule avec une cinétique très similaire. Veuillez noter que ces expériences ont une résolution temporelle cinétique plus élevée et confirment la cinétique de l'expérience précédente. Nous avons également effectué des expériences analogues de chasse aux impulsions en utilisant un FA marqué par un isotope plutôt qu'un FA marqué par un alcyne. Les combinaisons étaient FA 11:0[D3]/16:0[13C16]/18:2[13C18] (Fig. 4h) et FA 16:0[13C16]/18:2[13C18]/19:1[D8] (Fig. 4j). L'analyse d'échantillons marqués par des isotopes est exigeante car le marquage des isotopes n'a pas la sensibilité et la spécificité analytiques supérieures qui caractérisent les traceurs alcynes. A titre d'illustration, les Figs. 6 et 7 montrent une comparaison des spectres primaires des expériences de la Fig. 4g, h. Les espèces de TG marquées à l'alcyne se séparent bien de la majeure partie du matériel non marqué (données étendues, Fig. 6a, b), et une inspection plus approfondie indique que les principales espèces marquées sont les mêmes que les espèces endogènes dominantes (voir le spectre annoté dans le spectre supplémentaire 1). En revanche, il est inévitable que les TG marqués par un isotope fassent partie de la région encombrée de m / z 700–900 (données étendues Fig. 7a). Au moins le pic du TG 43:1 marqué dominant pouvait être directement identifié dans le mélange, mais les autres espèces n'étaient pas identifiables visuellement. Un équivalent de la recherche NL73 pour les espèces marquées par un alcyne n'existe pas pour les espèces marquées par un isotope, mais les TG qui contenaient le FA marqué 11: 0 [D3] pourraient être identifiés en utilisant une recherche NL pour la perte de ce FA avec l'ammoniac, c'est-à-dire à NL m / z 206,2. Une telle analyse a été effectuée (Extended Data Fig. 7b) et a donné un spectre raisonnable. Un algorithme de recherche équivalent LipidXplorer a ensuite été utilisé pour identifier et quantifier les TG marqués. Des recherches correspondantes ont également été effectuées pour les autres AF marqués par des isotopes. Bien que cela soit nécessaire pour atteindre la spécificité requise, cela signifie que chaque groupe de TG marqués par un isotope est quantifié par une perte neutre différente, contrairement à la quantification uniforme des espèces marquées par un alcyne, introduisant un possible biais quantitatif dans les données. Enfin, nous avons pu identifier 105 espèces de TG marquées par un isotope (contre 270 espèces de TG marquées par un alcyne), juste assez pour les calculs pour les TG à simple, double et triple marquage (Fig. 4h, j). Ces données ont montré que le cycle des TG se déroule de la même manière et avec une cinétique comparable pour les espèces marquées aux isotopes et aux alcynes.

a–c, Évolution dans le temps des quantités des trois FA;Y d'entrée dans les TG simples (a), doubles (b) et triples (c);Yn dans l'expérience de chasse aux impulsions. d, Distribution relative en pourcentage du FA;Y total sur les classes marquées de TG;Yn. e, Illustration du cycle TG et de son effet sur la distribution de l'étiquette entre les pools mono- et multi-étiquetés. Les nombres noirs sont des pmol des formes moléculaires respectives au point temporel 0 dérivées des données des panneaux a à d et représentent la somme des trois FA; Y. La quantité de TG;Y0 non marqué a également été mesurée dans les mêmes échantillons. Les nombres bleus sont des valeurs prédites pour un cycle de désacylation de TG suivi d'une réacylation stochastique. A noter que ce calcul suppose des étapes discrètes au cours du cycle, ce qui n'est en réalité pas le cas puisque dégradation et resynthèse sont simultanées. f, Les courbes montrent la distribution théorique binominale calculée des marqueurs dans les pools de TG;Y1, TG;Y2 et TG;Y3 en fonction de la fraction de FA;Y de tous les FA (non marqués et marqués ; trois par molécule de TG) dans le pool total de TG;Yn. Les symboles sont les valeurs mesurées dérivées de l'expérience. La position des symboles et les nombres correspondants 3,5 %, 5 %, 12 % et 26 % indiquent le point de meilleur ajustement des données mesurées aux courbes calculées. Toutes les valeurs de données mesurées ont été normalisées au total FA;Y dans TG;Y pour compenser ses variations. g – k, en utilisant la représentation des données comme dans le panneau d, le cycle TG dans des expériences de poursuite d'impulsions séparées est comparé. Toutes les expériences ont été réalisées avec un temps de chasse maximal plus court de 24 h et des temps de chasse minimaux plus courts de 2 h et 4 h. Les combinaisons d'étiquettes FA sont FA 11:0/16:0/18:2 avec marquage alcyne (g) ou isotope (h) et 16:0/18:2/19:1 avec marquage alcyne (i) ou isotope (j), comme indiqué dans les panneaux. Toutes les données sont moyennes ± sd, n = 11–12 (g–j, n = 4). Les barres d'erreur inférieures à la taille du symbole sont omises pour plus de clarté.

Nous avons ensuite approfondi l'analyse en avançant au niveau des espèces lipidiques. L'analyse des espèces TG; Y1 après marquage avec FA 18: 2; Y (Fig. 5a) a montré qu'au sein de cette classe de lipides, certaines espèces étaient relativement constantes (Fig. 5a, flèche ouverte) et d'autres (Fig. 5a, flèche fermée) ont augmenté plus fortement que la tendance générale (Fig. 5a, total).

a, Évolution dans le temps de l'abondance relative des espèces TG;Y1 lors du marquage avec FA 18:2;Y. Les quantités relatives de toutes les espèces TG; Y1 de l'expérience de chasse aux impulsions sont représentées par un code couleur. Chaque ligne représente une espèce. b, analyse MS2 d'une espèce (flèche ouverte) au temps de chasse 48 h. Le pic précurseur à m/z 1 025,8 est omis. Les quatre séries de pics de fragments indiquent la composition FA 16:1_18:1_18:2;Y. c, analyse MS2 d'une espèce (flèche fermée) au temps de chasse 48 h. Le pic du précurseur à m/z 1 021,8 est omis. Les trois séries de pics de fragments indiquent la composition FA 16:1_16:1_20:4;Y. Notez qu'en b et c, les FA;Y incorporés réels sont directement identifiés à partir des masses maximales et imprimés en rouge. Dans a, les nombres sont codés par intensité de couleur (min-max de l'ensemble du bloc de données), dérivé des moyennes, n = 12. Les données statistiques détaillées de cette expérience sont présentées dans le tableau supplémentaire 2.

Par analyse MS2, l'espèce constante (Fig. 5b) a été identifiée comme TG 52: 4; Y, contenant des FA non marqués 16: 1 et 18: 1 avec FA 18: 2; Y. En revanche, l'espèce croissante (Fig. 5c) a été identifiée comme TG 52: 6; Y, contenant deux FA non marqués 16: 1 et un FA marqué 20: 4; Y, indiquant le métabolisme du marquage FA; Y lui-même par élongation et désaturation. Cela a été confirmé par des recherches directes dans les données spectrales d'origine (données étendues Fig. 8 pour FA 20: 4; Y et données étendues Fig. 9 pour FA 18: 2; Y) et une analyse statistique détaillée (tableau supplémentaire 2). Par conséquent, à l'aide de fichiers LipidXplorer mfql dédiés, nous avons systématiquement recherché les spectres MS2 de toutes les espèces TG;Y1 à marquage unique pour les FA;Y transformés par voie métabolique, qui ont tous été clairement identifiés et quantifiés. TG;Y1 a été choisi parce que (1) ses spectres contenaient les informations les plus claires sur l'identité de FA;Y1 et (2) il contenait la majorité du matériel marqué, en particulier à des moments de chasse ultérieurs. Les données des deux combinaisons FA, 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y et 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y, ont été analysées. Les résultats, normalisés au pourcentage du total dans TG; Y1, ont montré que dans les deux combinaisons de FA, la modification la plus forte s'est produite dans le FA polyinsaturé 18: 2; Y (Fig. 6a, b), qui a été allongé et désaturé pour donner FA 18: 3; Y, FA 20: 3; Y et FA 20: 4; Y comme produits les plus importants. Le FA 16: 0; Y saturé a été légèrement moins modifié (Fig. 6c, d), principalement par désaturation et allongement, donnant naissance à FA 16: 1; Y et FA 18: 1; Y. FA 11: 0; Y a été partiellement dégradé, donnant FA 7: 0; Y et 9: 0; Y, et partiellement allongé en FA 13: 0; Y et 15: 0; Y (Fig. 6e). FA 19:1;Y a été partiellement dégradé en FA 17:1;Y et dans une très faible mesure également allongé en FA 21:1;Y. En général, la modification était plus forte dans la combinaison FA 16: 0; Y / 18: 2; Y / 19: 1; Y, ce qui était corrélé à un cycle TG global plus rapide dans cette expérience (Extended Data Fig. 10b, c).

Les cellules 3T3-L1 ont été marquées avec la combinaison FA 11:0;Y/16:0;Y/18:2;Y (a,c,e) ou 16:0;Y/18:2;Y/19:1;Y (b,d,f) pendant 1 h, suivies de périodes de chasse entre 6 h et 48 h, comme indiqué. Les pics de fragments FA illustrés sur les figures 5b, c ont été détectés, identifiés et quantifiés dans toutes les espèces TG; Y1 à marquage unique. Les diagrammes montrent la fraction de chaque métabolite aux quatre points dans le temps. Les métabolites de FA 18:2;Y sont présentés dans les panneaux a et b, de FA 16:0;Y dans les panneaux c et d, de FA 11:0;Y dans le panneau e et de 19:1;Y dans le panneau f. Tous les nombres sont normalisés au total des FA;Y respectifs dans TG;Y1 au temps de poursuite respectif pour compenser les changements dans le total TG;Y1. Les ordonnées sont divisées pour montrer la diminution des FA;Y d'entrée et l'augmentation de leurs métabolites dans un panneau. Tous les nombres sont des moyennes ± sd, n = 11–12. Les barres d'erreur inférieures à la taille du symbole sont omises pour plus de clarté.

L'augmentation observée des doubles liaisons et de la longueur de chaîne ne se limitait pas au TG;Y1. Dans les phospholipides, la conversion de FA 18: 2; Y en FA 20: 4; Y ne peut pas être tracée aussi directement que dans les TG car les phospholipides ne libèrent pas de fragment FA; Y marqué dans MS2. Pourtant, le nombre d'atomes C de la chaîne latérale et de doubles liaisons a augmenté de manière constante pour les trois principales classes de phospholipides, avec des temps de chasse croissants dans les deux combinaisons d'AF (Extended Data Fig. 10a). Cette découverte exclut que l'augmentation de FA 20:4;Y dans le TG;Y1 soit alimentée par FA 20:4;Y libéré du pool PC;Y1.

Enfin, nous avons effectué des expériences de chasse aux impulsions dans des adipocytes primaires blancs et bruns murins. Dans les deux systèmes, il y avait clairement un cycle TG avec des taux comparables à ceux trouvés dans les adipocytes 3T3-L1 (Fig. 7, triangles noirs). L'inhibition partielle de la bêta-oxydation à l'aide de 30 µM de l'inhibiteur CPT1 teglicar14, dont la valeur de concentration inhibitrice demi-maximale (CI50) a été déterminée à 40 µM (réf. 15), a entraîné une augmentation apparente des taux de cyclisme (Fig. 7, carrés bleus) dans les deux types d'adipocytes. Cette observation est cohérente avec l'idée que le cycle nécessite à la fois le clivage initial de TG et la re-synthèse d'une molécule de TG. Si le FA initialement libéré est, cependant, dégradé par la bêta-oxydation, moins de TG;Y1 marqué sera produit à partir de DG non marqué, et par conséquent l'efficacité apparente et le taux de cyclage seront diminués.

a, b, les adipocytes blancs (a) et bruns (b) ont été marqués avec la combinaison FA 16: 0; Y/18: 2; Y/19: 1; Y pendant 1 h, suivis de périodes de chasse entre 6 h et 48 h, comme indiqué. Les diagrammes montrent la distribution de la somme des trois FA;Y sur les pools TG;Y1, TG;Y2 et TG;Y3, normalisée à la quantité totale de FA;Y dans l'ensemble du pool TG;Yn. Toutes les valeurs sont moyennes ± sd, n = 4 (n = 12 pour le temps de chasse 0 h). Les symboles bleus indiquent la présence de l'inhibiteur CPT1, teglicar, pendant les périodes de chasse, et les symboles noirs son absence.

Une analyse détaillée et quantitative du cycle TG était impossible jusqu'à présent en raison de l'absence d'une méthode appropriée. La méthode de traçage multiplex multilabel qui a été développée pour ce projet a permis une telle étude, comme présenté ici. La stratégie employée pour la discrimination des étiquettes à l'aide de trois traceurs alcyne-FA (FA; Y impair / pair plus un FA; Y marqué par un isotope) a bien fonctionné, même dans le système difficile d'adipocytes avec un fond considérable de FA impairs endogènes16. La différence de longueur considérable de sept atomes de carbone entre les FA;Y impairs et pairs s'est avérée utile pour la discrimination des espèces marquées. Le marquage au 13C9 du troisième FA;Y excluait toute interférence pertinente avec les deux autres FA;Y. Pour des systèmes biologiques encore plus difficiles ou pour l'ajout futur d'un quatrième traceur, la préparation d'autres FA;Y marqués par des isotopes, par exemple, par incorporation de certains atomes D dans un FA;Y monoinsaturé, serait une option intéressante. Il est important de noter que notre méthodologie ne se limite pas à des combinaisons particulières de FA ou à des types de cellules. Outre les traceurs 11:0/16:0/18:2 et 16:0/18:2/19:1 de cette étude, nous avons également testé avec succès la combinaison 12:0/16:0/19:1 dans des adipocytes ainsi que toutes ces combinaisons dans des hépatocytes fraîchement isolés.

La démonstration directe du cycle TG dans les adipocytes 3T3-L1 ouvre plusieurs points de discussion. La première est de savoir si les données permettraient d'autres explications. Cela peut essentiellement être nié. L'argument crucial vient de l'observation qu'au cours des 6 premières heures de chasse, pour FA 16: 0; Y et FA 18: 2; Y, une forte augmentation de TG monomarqué; Y1 est trouvée. La libération de marqueur des espèces doublement et triplement marquées est la seule source pouvant expliquer cette augmentation. En utilisant FA 16:0;Y comme exemple, il y a une augmentation du marqueur dans TG;Y1 de 461 pmol et une diminution parallèle correspondante de TG;Y2 et TG;Y3 de 449 pmol. En revanche, la diminution totale de toutes les autres classes de lipides totalise 99 pmol, ce qui n'est pas suffisant pour expliquer l'augmentation de TG;Y1. Les nombres correspondants pour 18:2;Y indiquent une augmentation de TG;Y1 de 468 pmol, une diminution combinée de TG;Y2 et TG;Y3 de 360 ​​pmol, et dans toutes les autres classes de lipides de 56 pmol. Encore une fois, les chiffres indiquent que 76 % de l'augmentation de TG;Y1 provient de TG;Y2 et TG;Y3, qui est par définition un cycle TG.

Le deuxième point concerne la voie du cycle des TG. Le minimum absolu est un cycle TG/DG comme illustré (Fig. 1 et 4e), mais il pourrait également y avoir un cycle plus long qui impliquerait une dégradation supplémentaire en monoacylglycérol (MG) ou en glycérol libre. En fait, la libération de glycérol par le tissu adipeux est un indicateur classique de l'hydrolyse des TG17 et a été utilisée pour estimer le cycle des TG3. Des recherches plus récentes sur les cellules 3T3-L1 et les adipocytes primaires ont montré que le glycérol libéré peut également provenir de la glycolyse18,19, remettant en question l'idée que la libération de glycérol est un indicateur quantitatif de l'hydrolyse des TG. À l'heure actuelle, nos données ne peuvent pas différencier les formes possibles du cycle TG et ne peuvent pas non plus indiquer l'identité des activités enzymatiques impliquées. Le fait que les données correspondent bien à une distribution d'étiquettes binominale indique la nature stochastique du processus. Pour des informations mécanistes plus approfondies, davantage de données à des périodes de chasse plus courtes ainsi que des études d'inhibiteurs et d'ablation de gènes dirigées contre des enzymes candidates sont nécessaires. Ces données doivent être introduites dans la modélisation mathématique qui doit inclure non seulement TG;Yn, mais également étiquetés DG;Yn, MG;Y, PA;Y et PC;Y.

Un troisième point qui mérite d'être discuté est la vitesse et les coûts énergétiques du cycle. A partir de la dégradation de TG;Y3, nous pouvons estimer une demi-vie de 4 h pour TG dans un cycle TG/DG. Avec ce taux, et en ignorant le problème de la spécificité de position des réactions cycliques, chaque FA dans TG serait retourné une fois par jour, avec des coûts énergétiques de 1 ATP par jour. Avec un contenu énergétique net de 106 ATP par molécule de palmitate, le stockage des TG coûterait environ 1 % de son contenu énergétique par jour dans les adipocytes 3T3-L1. Cela semble être un grand nombre lorsqu'il est transféré dans le tissu adipeux, car cela signifierait qu'un dépôt de graisse de 50 kg rétrécirait à un rythme de 0,5 kg par jour uniquement par le cycle TG. Il est probable que dans le tissu adipeux blanc avec ses gouttelettes lipidiques plus grosses, le cycle des TG se produise à des taux inférieurs à ceux des cellules 3T3-L1 qui ont des gouttelettes d'un diamètre généralement de 5 à 10 µm, car certaines des réactions métaboliques pertinentes se produisent à la surface des gouttelettes.

Enfin, la question des avantages biologiques du cyclage par rapport à un stockage statique doit être discutée. L'argument classique des manuels pour les cycles de substrat est l'amélioration de la flexibilité de régulation en augmentant l'amplitude de régulation d'une paire d'enzymes antagonistes sur une seule agissant de manière unidirectionnelle. Cela semble également vrai pour le cycle des TG, car une grande partie de la réduction de la consommation de TG après la fin de l'activité physique peut être attribuée à une ré-estérification accrue au lieu d'une hydrolyse réduite des esters3. Une autre fonction peut résider dans la thermogenèse indépendante de l'UCP1 dans le tissu adipeux blanc20,21.

Nos données pointent vers un troisième aspect important : la composition du pool de FA stocké dans les TG. Les données montrent que chacun des trois FA de marquage a un destin spécifique : une majorité de 82 % des FA à chaîne moyenne incorporés 11: 0; Y ont été perdus des cellules dans les 48 h, vraisemblablement par oxydation préférentielle. Environ 10 % du reste ont été modifiés, principalement par allongement et désaturation, donnant FA 15:1;Y et 17:1;Y. Seuls 16 % du FA 11:0;Y d'origine étaient encore présents après 48 h. Après le même temps, 100 ± 13 % d'acide alcyne palmitique 16:0;Y étaient toujours présents, et 88 % de celui-ci restaient sous leur forme originale. Les modifications ont produit principalement des FA désaturés 16:1;Y et 18:1;Y. Le PUFA 18:2;Y n'a pas montré de perte significative de matière. Environ 20 à 30 % des AG d'origine ont été modifiés, principalement en AG 20:3;Y et 20:4;Y, l'équivalent de l'acide arachidonique et de son précurseur. En résumé, ces données montrent (1) une clairance rapide des AG à chaîne moyenne, (2) une désaturation lente des AG saturés pour produire des équivalents d'acide palmitoléique et oléique, et (3) un métabolisme des équivalents d'acide linoléique vers l'acide arachidonique. Les trois processus sont potentiellement bénéfiques pour la cellule ou l'organisme. Les AG à chaîne moyenne sont inutiles voire potentiellement dangereux en tant que constituants membranaires. Leur élimination élimine un problème potentiel et leur conversion en AG monoinsaturés à longue chaîne fournit des éléments de construction membranaires utiles. L'acide palmitique est un constituant alimentaire abondant, mais des concentrations élevées de palmitate dans les lipides sont en corrélation avec plusieurs conditions défavorables22. Une désaturation lente en AG monoinsaturés bénéfiques réduirait le risque d'accumulation de palmitate dans les TG stockés et empêcherait les effets négatifs du palmitate libéré lors de la mobilisation des graisses stockées. L'arachidonate est un AG important avec des enzymes uniques dans le renouvellement des lipides membranaires23,24 et joue un rôle clé en tant que précurseur des eicosanoïdes dans la signalisation inflammatoire. Des niveaux soutenus d'acide arachidonique sont essentiels pour la vie des mammifères, comme en témoignent de nombreuses études expérimentales chez la souris et par le besoin absolu d'acide arachidonique dans l'alimentation infantile25. La conversion de l'acide linoléique abondant en acide arachidonique chez les mammifères est un processus complexe en plusieurs étapes actif dans les hépatocytes26. Nos données suggèrent que le tissu adipeux peut soutenir d'autres organes dans ce processus.

En l'absence de cycle TG, les trois FA; Y resteraient entièrement inchangés après incorporation dans TG, car toutes les modifications ou voies de dégradation des FA observées nécessitent des esters de coenzyme A de FA libre (FA-CoA) comme substrat. Par conséquent, la modification en cours des FA nécessite la libération répétée des FA à partir des TG en conjonction avec leur réactivation par les acyl-CoA synthétases dans la voie du cycle des TG. La même logique s'applique également à l'élimination des AG endommagés, par exemple par peroxydation, du pool TG. Dans une piscine statique, les matériaux endommagés s'accumuleraient ; Le cycle TG donne accès aux FA endommagés pour une dégradation ultérieure. En résumé, nos expériences mettent l'accent sur la fonction essentielle du cycle TG pour surveiller et maintenir la composition du pool de FA stocké dans les adipocytes.

Pour éviter toute confusion entre les doubles liaisons lipidiques normales et la triple liaison terminale de l'étiquette alcyne, nous traitons la triple liaison comme une fonctionnalisation du FA et l'indiquons avec un suffixe '; Y'. Cela suit la stratégie de la nomenclature LipidMaps27, qui ne dispose pas encore de système pour indiquer les triples liaisons dans la dernière mise à jour28. La nomenclature utilisée ici a été discutée et convenue avec un groupe de scientifiques intéressés qui ont participé à la dernière mise à jour de la nomenclature LipidMaps et a déjà été utilisée dans nos publications récentes. Le Y rend la triple liaison visible dans l'abréviation et conserve le nombre correct de doubles liaisons dans l'abréviation. Il en résulte FA 18: 2; Y pour l'alcyne terminal-FA avec 18 atomes de carbone et deux doubles liaisons, qui est utilisé comme équivalent d'acide linoléique dans cette étude. Par cela, à la fois la fonctionnalisation avec une triple liaison et l'équivalence biochimique à l'acide linoléique est facilement accessible. Pour les classes de lipides, nous utilisons également le suffixe Y, c'est-à-dire que PC;Y et TG;Y indiquent la phosphatidylcholine et le triacylglycérol qui contiennent un alcyne-FA (FA;Y), respectivement. La présence de deux FA;Y dans une molécule de TG doublement marquée donne TG;Y2, et celle de trois FA;Y dans une molécule triplement marquée donne TG;Y3, en conséquence. Dans les noms d'espèces de glycérolipides, le « Y » sera placé à côté du numéro de la double liaison, par exemple, TG 52 :3 ;Y est un produit très fréquent de marquage avec FA 18 :2 ;Y. En conséquence, si l'identité de l'autre FA dans le TG;Y est connue, la molécule pourrait devenir TG 18:2;Y_16:0_18:1, et, si les positions étaient connues, TG 16:0/18:2;Y/18:1.

FA 11:0;Y a été obtenu auprès de TCI Allemagne et FA 18:2;Y a été synthétisé comme décrit29. FA 19: 1 [D8] a été synthétisé par réaction de Wittig entre le bromure de carboxyoctyl-triphényphosphonium et le décanal [D8]. Ce dernier a été préparé à partir de décatétraénal30 par deutération avec du deutérium gazeux et du catalyseur de Wilkinson dans CH3OD. 13C9-FA 16:0;Y a été obtenu dans une synthèse chimique en plusieurs étapes. En bref, un ester méthylique FA mixte marqué à l'U-13C commercial a été mis à réagir avec du cis-1,4-diacétoxy-2-butène en présence de nitro-Grela comme catalyseur de métathèse. A partir du mélange obtenu, l'ester méthylique de l'acide 13C9-11-acétoxyundéc-9-énoïque a été purifié. La double liaison a été réduite avec H2/Pd et l'ester acétylique clivé avec HCl dans du méthanol. L'ester méthylique d'acide 13C9 11-hydroxyundécanoïque résultant a été purifié et oxydé avec du chlorochromate de pyridinium dans du dichlorométhane en l'aldéhyde correspondant, l'ester méthylique d'acide 11-oxoundécanoïque. Celui-ci a été couplé avec le réactif de Wittig obtenu à partir du bromure de dioxolanylpropyl-triphénylphosphonium. La double liaison résultante a été réduite avec H2/Pd. Le groupe protecteur sur l'aldéhyde terminal a été éliminé avec de l'acide toluènesulfonique dans de l'acétone humide pour obtenir l'ester méthylique de l'acide 13C9-15-oxo-pentadécanoïque. La triple liaison terminale finale a été introduite par réaction avec le réactif Bestmann – Ohira et l'ester méthylique clivé avec KOH dans du tétrahydrofurane / eau pour obtenir le produit final à environ 100 mg. L'analyse MS a indiqué une pureté d'environ 87 %. Les principales impuretés sont de 4 à 5 % chacune de 13C10-17:0;Y et 13C12-19:0;Y. Ces impuretés, provenant probablement des migrations de doubles liaisons dans la réaction de métathèse initiale, ne perturbent pas l'analyse puisque les pics MS qui en résultent sont facilement discriminés de ceux qui contiennent 13C9-16:0;Y.

Les standards internes étaient ceux utilisés dans les études précédentes12,31 avec des standards supplémentaires pour surveiller TG;Y3, PA;Y2, PC;Y2 et PE;Y2. À chaque échantillon, un mélange contenant les étalons internes a été ajouté (pour la composition et les quantités, voir le tableau supplémentaire 3). Les étalons internes pour chaque classe de lipides sont fournis en différentes quantités pour tenir compte des différentes abondances des classes respectives. L'objectif est d'avoir des intensités standard qui se situent dans la plage typique des intensités d'échantillon pour la même classe de lipides.

Des préadipocytes 3T3-L1 (ATCC CL-173) ont été cultivés dans un milieu de croissance (DMEM 4,5 g l−1 glucose, 10 % FCS plus pénicilline/streptomycine), ensemencés dans des plaques 48 puits et induits à se différencier après 24 h par addition de 1 µM de rosiglitazone, 10 µg ml−1 d'insuline, 10 µM dexaméthasone et 0,5 mM de 3-isobutyl- 1-méthylxanthine pendant 3 jours, suivi d'une culture dans un milieu de croissance avec de l'insuline uniquement pendant 2 à 4 jours, avec des changements de milieu tous les deux jours. La différenciation a été contrôlée régulièrement par l'apparition de gouttelettes lipidiques visibles en microscopie à contraste de phase.

Les souris ont été maintenues et élevées dans l'animalerie de l'Institut des sciences de la vie et des sciences médicales de Bonn. Les souris avaient libre accès aux régimes alimentaires standard des rongeurs et à l'eau. Les animaux ont été logés dans un cycle lumière/obscurité de 12:12, à 23 ± 1 °C. Toutes les études sur les animaux ont été réalisées conformément aux lois allemandes sur le bien-être des animaux. Les expérimentations animales ont été autorisées par le Landesamt für Natur, Umwelt und Verbraucherschutz (LANUV) Nordrhein-Westfalen, Allemagne, 81-02.04.2021.A166. Les adipocytes primaires ont été isolés à partir de souris C57BL/6 âgées de 8 à 12 semaines. Le tissu adipeux blanc inguinal disséqué et le tissu adipeux brun interscapulaire de 2 à 3 souris différentes ont été digérés dans du DMEM (Invitrogen) contenant 0, 5% de BSA et de la collagénase NB46 à 37 ° C, puis centrifugés à 1 000 tr / min pendant 10 min. Le culot résultant a été remis en suspension et filtré à l'aide d'un tamis cellulaire de 100 μm. La solution filtrée a été ensemencée dans un flacon de culture T175 dans du DMEM additionné de 10 % de FBS, 1 % de pénicilline/streptomycine et 1 % d'amphotéricine B (milieu de croissance des adipocytes blancs (WA)), et maintenue à 37 °C et 5 % de CO2. 24 h après l'ensemencement, les cellules ont été lavées avec du PBS et maintenues avec du milieu de croissance WA à 37 ° C, 5 % de CO2. Le milieu a été changé tous les deux jours jusqu'à ce que les cellules aient atteint la confluence et les cellules ont ensuite été cryoconservées.

Les cellules ont été étalées à une densité de 20 000 cellules par puits dans une plaque à 48 puits dans un milieu de croissance. Les cellules ont été cultivées jusqu'à confluence dans le milieu de croissance. Une fois confluents, les préadipocytes ont été induits pendant 48 h (jour 0 à jour +2) en changeant le milieu en milieu d'induction WA (DMEM contenant 5 % FBS, 1 % P/S, 1 nM T3, 0,172 µM insuline, 50 mg ml-1 l-ascorbate, 1 mM d-biotine, 17 mM pantothénate, 1 µM rosiglitazone, 0,25 µM dexaméthasone et 0,5 mM de 3-isobutyl-1-méthylxantine). Du jour +2 au jour +12, les cellules ont été maintenues dans du milieu WA Maintenance (DMEM contenant 5% FBS, 1% P/S, 1 nM T3, 0,172 µM insuline, 50 mg ml-1 l-ascorbate, 1 mM d-biotine, 17 mM pantothénate), en le rafraîchissant tous les deux jours. Les cellules ont été utilisées pour des expériences au jour +12.

Pour l'expérience d'étalonnage, le milieu de culture a été remplacé par un milieu de croissance contenant des FA; Y comme indiqué dans les légendes des figures, chacune à une concentration de 50 µM, pendant 1 h. Les milieux ont été retirés, puis les cellules lavées et les lipides extraits pour une analyse plus approfondie. Pour l'expérience de chasse aux impulsions, les cellules ont été marquées avec un milieu de croissance contenant 50 µM de chacun des trois FA; Y ou FA marqué par isotope lourd, tous deux comme indiqué dans les légendes des figures, pendant 1 h. Les milieux ont été retirés, les cellules lavées une fois, puis soit traitées pour l'extraction et l'analyse des lipides (pas de chasse), soit du milieu de croissance frais ajouté pour les temps de chasse, comme indiqué. Après la chasse, les milieux ont été retirés et les cellules ont été lavées et traitées pour extraction et analyse.

Les cellules sur des boîtes multipuits ont été lavées une fois avec du milieu chaud et une fois avec du PBS glacé et rapidement une fois avec de l'acétate d'ammonium 155 mM, en prenant soin d'éliminer le liquide après le dernier lavage aussi complètement que possible. Dans chaque puits, 500 µl de mélange d'extraction (490 µl de MeOH/CHCl3 5:1, 10 µl de mélange standard interne contenant des lipides standard marqués à l'alcyne et un standard interne non alcyne pour TG (TG 50:1[D4])) comme indiqué ci-dessus ont été ajoutés et la plaque entière a été soniquée pendant 1 min dans un sonicateur à bain. Les extraits, y compris les restes de cellules, ont été collectés dans des tubes Eppendorf originaux de 1,5 ml et centrifugés à 20 000 g pendant 5 min pour sédimenter la protéine. Les surnageants ont été transférés dans des tubes frais. Après addition de 400 µl de CHCl3 et 600 µl d'AcOH à 1 % dans l'eau, les échantillons ont été secoués pendant 30 s et centrifugés pendant 5 min à 20 000 g. La phase supérieure a été retirée et la phase inférieure transférée dans un nouveau tube et séchée pendant 20 min à 45 ° C dans un speed-vak. CHCI3 (8 ul) a été ajouté et les tubes ont été brièvement vortexés. À chaque tube, 40 µl de mélange Click ont ​​été ajoutés (préparés en mélangeant 10 µl de 100 mM C175-7x dans 50 % de MeOH (conservés sous forme d'aliquotes à -80 °C) avec 200 µl de 5 mM Cu(I)AcCN4BF4 dans AcCN et 800 µl d'éthanol), suivi d'une sonication pendant 5 min et d'une incubation à 40 °C pendant 16 h.

Aux échantillons cliqués avec C175-7x, 100 µl de CHCl3 par échantillon ont été ajoutés et les échantillons multiplexés ont été regroupés. Au pool, 600 ul d'eau ont été ajoutés et les pools ont été brièvement secoués et centrifugés pendant 2 min à 20 000 g. La phase supérieure a été retirée et la phase inférieure a été séchée dans un speed-vac comme ci-dessus. Un tampon de pulvérisation (2-propanol/méthanol/eau 8:5:1 + acétate d'ammonium 10 mM) (200 à 1 000 µl) a été ajouté, les tubes soniqués pendant 5 min et les lipides dissous analysés par MS.

Les spectres de masse ont été enregistrés sur un spectromètre Thermo Q-Exactive Plus équipé d'une source d'ionisation à électropulvérisation chauffée standard (HESI) utilisant une injection directe à partir d'une seringue Hamilton entraînée par une pompe à seringue sous le contrôle du logiciel de contrôle de l'instrument Tune. Pour minimiser les volumes morts, le port de la seringue a été directement connecté à la source HESI sans raccord de tubulures. Les échantillons ont été pulvérisés à un débit de 10 µl min−1 dans un tampon de pulvérisation avec les paramètres suivants : gaz de gaine 6, gaz auxiliaire 2, gaz de balayage 0, chauffage du gaz désactivé, tension de pulvérisation en mode positif 4,1 kV, température capillaire de transfert d'ions 280 °C.

Les spectres MS1 ont été enregistrés sous forme de scans segmentés avec des fenêtres de m/z 100 entre m/z 300 et 1 400 pendant 1,2 min, suivis de spectres MS2 par acquisition indépendante des données pendant 19 min en utilisant des listes d'inclusion de m/z 305,373 à 1 400,119 à m/z 1,0006 intervalles, pour s'adapter aux défauts de masse typiques des lipides aux masses respectives. Les paramètres de balayage typiques étaient, pour les balayages MS1 : cible de contrôle de gain automatique 3 × 106, temps ionique maximum 800 ms, résolution 280 000, centroïde en mode crête ; pour les scans MS2 : cible de contrôle de gain automatique 2 × 105, temps d'ionisation maximum 700 ms, résolution 280 000, pas de multiplexage spectral, première masse dynamique, fenêtre d'isolation m/z 0,4, énergie de collision normalisée étagée 10, 35, 40, centroïde du type de données spectrales. De plus, un deuxième balayage pour les espèces à double charge a été effectué dans la plage de balayage de m/z 300–700, avec des balayages MS2 de m/z 300,8052 à 700,0648 à des intervalles de m/z 0,5002 et une fenêtre d'isolement de m/z 0,4. Les espèces triplement chargées (TG;Y3 et PC;Y2) ont été analysées à l'aide d'une liste d'inclusion ciblée comprenant toutes les combinaisons théoriques de FA;Y avec une fenêtre d'isolement de m/z 0,3.

Les fichiers bruts ont été convertis en fichiers .mzml à l'aide de MSConvert et analysés à l'aide de LipidXplorer32. Pour l'identification et la quantification des lipides marqués, des fichiers mfql ont été écrits qui identifient l'espèce par la présence d'un pic correspondant aux masses attendues de la classe de lipides marqués combinées aux pertes neutres caractéristiques. Pour plus de détails et d'exemples, voir les informations supplémentaires et la réf. 12. Une recherche complète comprenait 44 fichiers mfql pour les espèces à charge unique, 69 pour les espèces à double charge et 18 pour les espèces à triple charge. Pour la recherche de modification FA dans les espèces TG;Y, un autre ensemble de 20 fichiers mfql a été utilisé. Le traitement ultérieur des données a été effectué à l'aide du calcul standard MS Excel.

Les expériences réelles de chasse aux impulsions ont été réalisées exactement de la même manière que celle décrite ci-dessus pour les FA marqués par des alcynes, à l'exception que des FA marqués par des isotopes lourds ont été utilisés à la place des FA;Y. Les extraits lipidiques ont été analysés directement par MS1/MS2 sans réaction de clic et sans multiplexage. Pour tous les TG marqués aux isotopes, des algorithmes de recherche mfql ont été écrits pour identifier les TG par une combinaison de la masse non fragmentée des adduits d'ammonium dans MS1 et des pertes neutres combinées des FA marqués aux isotopes plus l'ammoniac dans MS2. Ces pics MS2 ont également été utilisés pour la quantification, par rapport au fragment MS2 correspondant du standard interne TG 50:1[D4]. Pour la combinaison FA 11: 0 [D3] / 16: 0 [13C16] / 18: 2 [13C18], la recherche a inclus des espèces à marquage simple et double de 40 à 56 atomes de C, et pour FA 16: 0 [13C16] / 18: 2 [13C18] / 19: 1 [D8], des espèces à 48 à 57 atomes de C. Les espèces triplement marquées ont été identifiées à l'aide de fichiers de recherche ciblés individuels.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les fichiers .raw de données primaires MS et les fichiers .sc d'importation LipidXplorer et les feuilles de calcul Excel sont disponibles à partir de la date de publication de l'article dans une archive accessible au public : https://doi.org/10.22000/925. Le fichier de sortie annoté LipidXplorer qui contient toutes les identifications primaires, les intensités brutes et les calculs de pmol de l'expérience résolue en temps qui donne lieu aux Figs. 3, 4a–f et 6a,c,e sont soumis en tant que données supplémentaires 1.

Les fichiers de recherche LipidXplorer .mfql qui contiennent les algorithmes de recherche utilisés dans cette publication sont disponibles à partir de la date de publication de l'article dans une archive accessible au public : https://doi.org/10.22000/925.

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Ce travail a été financé par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) - ID de projet : SFB 1454 numéro de projet 432325352, TH 780/4-1 Traçage lipidique multiparallèle, TH 780/5-1 SPP 2306 Ferroptose to CT ; KU 2374/3-1 à LK ; et par la stratégie d'excellence allemande - EXC2151 - subvention no. 390873048 à CT

LIMES Life and Medical Sciences Institute, Université de Bonn, Bonn, Allemagne

Klaus Wunderling, Jelena Zurkovic, Fabian Zink, Lars Kuerschner & Christoph Thiele

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KW, JZ et FZ ont conçu et réalisé des expériences et analysé des données. LK a conçu des figures et contribué à l'organisation du manuscrit et à la rédaction du texte. CT a conceptualisé le projet, effectué la synthèse chimique, écrit le code mfql, analysé les données, conçu les figures et écrit le texte.

Correspondance avec Christoph Thiele.

L'Université de Bonn (propriétaire) et CT (inventeur) ont déposé un brevet (EP3587382, US Patent App. 17/254,922) qui couvre les principales parties de la technologie de traçage MS des lipides alcynes qui est au cœur méthodologique de cette publication.

Nature Metabolism remercie Guanghou Shui, Douglas Mashek et Zheng Ouyang pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Rédactrice en chef de la manipulation principale : Isabella Samuelson, en collaboration avec l'équipe de Nature Metabolism.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

L'exemple est un TG 50:2;Y1 contenant FA 13C9-16:0;Y d'un échantillon multiplexé. Après une réaction de clic d'échantillons individuels avec l'un des réactifs C175-7x associés (Thiele et al., 2019), les échantillons regroupés ont été analysés par MS2 du pic précurseur à m/z 1010,92. Ce précurseur commun subit une fragmentation par perte neutre des quatre trialkylamines isotopiques pour donner la série de pics à m/z 937,83. Une perte neutre supplémentaire d'acides gras par élimination donne lieu à deux séries de pics à m/z 683,61 et 655,58. La différence avec la série à 937,83 identifie les deux FA non marqués dans la molécule TG. Si la molécule de TG à l'étude contient deux AG non marqués identiques, une seule série de pics est observée dans cette plage de masse (voir Fig. 5b, c à titre d'exemple). L'encart montre la structure de pic multiplex typique produite par les pertes de trialkylamine de 73, 75, 76 et 77 Da qui permet une attribution claire aux échantillons individuels dans le pool multiplex. La série de pics à m / z 363, 34 est le signal du FA; Y ayant réagi au clic après la perte neutre de 73, 09 qui a été libéré sous forme de FA libre à partir de la molécule TG. Cette série de pics contient des informations indiquant si le FA;Y d'entrée d'origine a été utilisé pour la synthèse de TG sous une forme inchangée ou a fait l'objet d'une modification préalable, par exemple par allongement, désaturation ou dégradation partielle.

Les cercles symbolisent les puits de la plaque 24 puits, contenant des adipocytes 3T3-L1 différenciés. Les numéros 16/11/18 font référence à l'entrée ci-dessus FA; Y utilisée à 50 µM pendant 2 h. Après incubation, les milieux ont été retirés, les cellules lavées et les lipides extraits en présence d'étalons internes. Les lipides extraits ont été soumis à une réaction de clic avec les molécules rapporteurs C175-7x indiquées à droite. Après la réaction, les échantillons ont été regroupés de manière à ce qu'un pool contienne les quatre répliques multiplexées avec une entrée identique mais des rapporteurs de clics différents, qui ont ensuite été analysés par MS1 et MS2, suivis d'un traitement des données à l'aide du logiciel LipidXplorer (Herzog et al., 2011).

Le diagramme montre toutes les espèces TG;Y1 marquées contenant FA 11:0;Y ou FA 18:2;Y de 35 à 58 atomes de carbone (#C) dans les chaînes FA, avec des quantités pmol (a) ou relatives (b) codées par couleur. Chaque ligne représente une espèce. Dans la première étape, chaque espèce a été analysée pour déterminer si elle présentait le modèle d'étiquetage typique attendu pour FA 11: 0; Y (par exemple 1 →) ou FA 18: 2; Y (2 →) ou un modèle mixte (3 →). Dans la deuxième étape, les espèces ont été affectées à l'entrée FA;Y respective ou n'ont pas été affectées (c). La quantité de pmol de ces attributions prélevées sur les échantillons triplement marqués est résumée en bas à droite, indiquant qu'environ 95 % du matériel marqué a été attribué. Notez que, contrairement aux attentes initiales, de nombreuses espèces paires ont été attribuées à FA 11:0;Y et de nombreuses espèces impaires à FA 18:2;Y. La raison en est l'abondance relativement élevée d'AF endogènes impairs, principalement 15: 0, 15: 1, 17: 0 et 17: 1, dans les adipocytes 3T3-L1 (Crown et al., 2015). Les nombres sont codés par intensité de couleur (min-max par bloc de données), dérivé de moyennes, n = 4.

Les quantités de picomole (à gauche) et relatives (à droite) de 100 TG doublement marqués; Y2 sont indiquées avec chaque bloc AF représentant une combinaison de FA; Y dans les algorithmes de recherche d'espèces et chaque colonne représentant une combinaison d'entrée FA; Y comme indiqué en haut. Chaque rangée correspond à une espèce TG;Y2 définie. Les nombres sont codés par intensité de couleur (min-max par bloc de données), dérivé de moyennes, n = 4.

Les quatre spectres sont des spectres de perte neutre m/z 73,1 qui montrent les lipides neutres marqués au C175-73 pour les durées d'impulsion et de chasse comme indiqué dans les panneaux. Dans le panneau supérieur, les régions spectrales qui contiennent des pics pour TG;Y1, TG;Y2 et TG;Y3 sont indiquées par des barres noires. Veuillez noter la diminution progressive du signal de TG;Y3 et TG;Y2 et l'augmentation parallèle de TG;Y1. Au sein du TG;Y1, la perte sélective d'espèces contenant FA 11:0;Y est clairement visible.

Les cellules 3T3-L1 ont été marquées avec de l'alcyne FA (11: 0; Y, 16: 0; Y, 18: 2; Y, chacune à 50 µM) pendant 1 h, et des extraits lipidiques ont été cliqués avec des réactifs C175-7x. Les spectres MS2 ont été enregistrés et, à l'aide de la fonction de carte ionique du logiciel Themo Xcalibur, les spectres de fragmentation ont été reconstruits. Le panneau a est un spectre MS2 de perte neutre de 0 Da. Dans ces expériences, la fragmentation se fait à trois énergies différentes, dont la plus basse ne conduit pas à la fragmentation. Par conséquent, tous les spectres MS2 contiennent un fort pic de l'ion précurseur non fragmenté, qui est le pic NL 0 . Les principales espèces endogènes non marquées sont marquées en bleu, les espèces marquées par un alcyne en rouge. En effet, le panneau a est un spectre MS1 total. Le panneau b est le spectre de perte neutre m/z 73,1 qui montre les lipides neutres marqués par un alcyne cliqués sur C175-73. Le panneau c montre le spectre des ions précurseurs pour le fragment m/z 284.23, qui est [FA 11:0;Y + (C175-73) - NL 73.1], spécifique de TG;Y1 contenant FA 11:0;Y.

Les cellules 3T3-L1 ont été marquées avec du FA marqué aux isotopes lourds (11: 0, 16: 0, 18: 2, chacun à 50 µM) pendant 1 h et les lipides extraits. Les spectres ont été enregistrés et, à l'aide de la fonction de carte ionique du logiciel Themo Xcalibur, les spectres de fragmentation ont été reconstruits. Le panneau a est le spectre MS2 de perte neutre de 0 Da, équivalent à un spectre MS1 total. Le panneau b montre le spectre de perte neutre pour le fragment m/z 206.2, qui est FA 11:0[D3] + NH3, spécifique pour TG contenant FA 11:0[D3]. Commentaire : Il est évident que les données de marquage isotopique dans la Fig. 7 des données étendues n'atteignent pas la qualité du marquage par clic dans la Fig. 6 des données étendues correspondantes. 76.1 et 77.1). De plus, les données de la figure 7b des données étendues sont plus complexes que celles de la figure 6c des données étendues, car elles contiennent non seulement les espèces à marquage unique, mais également toutes les combinaisons de FA 11: 0 [D3] avec lui-même et les autres acides gras marqués. En revanche, Extended Data Fig. 6c est un spectre propre de TG; Y1 avec FA 11: 0; Y, car les espèces à double et triple marquage se situent à différentes plages du spectre et présentent des préférences de fragmentation différentes.

Les spectres MS2 bruts d'échantillons de l'expérience de chasse aux impulsions ont été recherchés pour le fragment m/z 398,28, tolérance 0,01 Da, caractéristique de la présence de FA 20:4;Y dans TG;Y1. Les panneaux montrent les spectres d'ions précurseurs résultants; tous sont tracés à la même échelle pour une intensité maximale. Les principales espèces sont : TG 52 : 6 ; Y à m/z 1 021,8, TG 52 : 5 ; Y à m/z 1 023,8, TG 54 : 6 ; Y à m/z 1 049,8, TG 54 : 5 ​​; Y m/z 1 051,8.

Les spectres MS2 bruts d'échantillons de l'expérience de chasse aux impulsions ont été recherchés pour le fragment m/z 374,27, tolérance 0,01 Da, caractéristique de la présence de FA 18:2;Y dans TG;Y1. Les panneaux montrent les spectres d'ions précurseurs résultants; tous sont tracés à la même échelle pour une intensité maximale. Les principales espèces sont : TG 50 : 4 ; Y à m/z 997,8, TG 50 : 3 ; Y à m/z 999,8, TG 50 : 2 ; Y à m/z 1 001,8, TG 52 : 4 ; Y à m/z 1 025,8, TG 52 : 3 ; Y à m/z 1 027,8.

Les adipocytes 3T3-L1 différenciés ont été marqués avec des combinaisons FA comme indiqué pendant 1 h, suivis de périodes de chasse comme indiqué. Les cellules ont été lavées et les lipides extraits, soumis à une réaction de clic avec les reporters C175-7x et analysés par MS1/MS2 multiplexé. a, L'abondance des espèces marquées contenant 2 à 5 doubles liaisons (# db) et 34 à 38 atomes de carbone (# C) dans les chaînes FA a été calculée et exprimée en pourcentage du total des lipides marqués 18: 2; Y de la classe de phospholipides respective. Les nombres sont codés par intensité de couleur, dérivée des moyennes, n = 12. b,c, Distribution relative en pourcentage du FA;Y total sur les classes étiquetées de TG;Yn. Les données sont moy. +/- StdDev, n = 11-12. Notez que les données du panneau b sont identiques à celles de la figure 4d.

Tableaux supplémentaires 1 à 3, spectre 1 et méthodes.

Fichier de données de spectrométrie de masse traité et annoté contenant les données source de la Fig. 3 et des parties des Fig. 4, 5 et 6.

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Réimpressions et autorisations

Wunderling, K., Zurkovic, J., Zink, F. et al. Le cycle des triglycérides permet la modification des acides gras stockés. Nat Metab 5, 699–709 (2023). https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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Reçu : 13 avril 2022

Accepté : 27 février 2023

Publié: 03 avril 2023

Date d'émission : avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s42255-023-00769-z

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