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Oct 25, 2023

Susceptibilité comparative du SRAS

Le volume 17 de la revue ISME,

The ISME Journal volume 17, pages 549–560 (2023)Citer cet article

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L'exploration des réservoirs sauvages de virus pathogènes est essentielle pour leur contrôle à long terme et pour prédire les futurs scénarios de pandémie. Ici, une analyse comparative d'infection in vitro a d'abord été effectuée sur 83 cultures cellulaires dérivées de 55 espèces de mammifères à l'aide de virus pseudotypés portant des protéines S du SRAS-CoV-2, du SRAS-CoV et du MERS-CoV. Les cultures cellulaires des chauves-souris fer à cheval de Thomas, des chauves-souris fer à cheval royales, des singes verts et des furets se sont avérées très sensibles aux virus pseudotypés SARS-CoV-2, SARS-CoV et MERS-CoV. De plus, cinq variantes (del69-70, D80Y, S98F, T572I et Q675H), qui, à côté du domaine de liaison au récepteur de pointe, peuvent modifier de manière significative le tropisme de l'hôte du SRAS-CoV-2. Un examen des signaux phylogénétiques des taux de transduction a révélé que les taxons étroitement apparentés ont généralement une sensibilité similaire au MERS-CoV mais pas aux virus pseudotypés SARS-CoV et SARS-CoV-2. De plus, nous avons découvert que l'expression de 95 gènes, par exemple PZDK1 et APOBEC3, était couramment associée aux taux de transduction des virus pseudotypés SARS-CoV, MERS-CoV et SARS-CoV-2. Cette étude fournit une documentation de base sur la sensibilité, les variantes et les molécules qui sous-tendent la transmission inter-espèces de ces coronavirus.

Le coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV-2) a constitué une menace considérable pour la santé publique et l'économie mondiale, avec plus de 500 millions de cas d'infection humaine et plus de 6,6 millions de décès dans le monde en janvier 2023. Le SRAS-CoV-2 a été supposé provenir de chauves-souris, puis se propager à la population humaine via un hôte animal intermédiaire [1,2,3]. Bien que des virus similaires au SRAS-CoV-2, tels que BANAL-20-52 dérivé de la chauve-souris fer à cheval malaise (Rhinolophus malayanus), RaTG13 dérivé de la chauve-souris fer à cheval intermédiaire (Rhinolophus affinis) et Pangolin‐CoV présent dans les pangolins malais (Manis avania) [4,5,6] aient été identifiés, à l'heure actuelle, l'origine animale exacte du SRAS-CoV-2 reste incertaine. Deux autres coronavirus qui ont provoqué des épidémies avant le COVID-19 sont le coronavirus du syndrome respiratoire aigu sévère (SRAS-CoV), qui s'est peut-être propagé des chauves-souris en fer à cheval à l'homme par l'intermédiaire de civettes palmistes infectées, et le coronavirus du syndrome respiratoire du Moyen-Orient (MERS-CoV), qui était peut-être un débordement des chauves-souris aux humains via des dromadaires infectés [7,8,9]. Bien que la menace actuelle du SRAS-CoV et du MERS-CoV soit minime, nous devons être vigilants quant aux risques potentiels de retour sur l'homme à partir de leurs réservoirs naturels [10, 11].

Le SRAS-CoV-2 est capable d'infecter un large éventail d'hôtes, notamment les chiens, les visons, les furets, les loutres, les hamsters, les campagnols, les cerfs, les souris sylvestres, les chauves-souris, les petits et grands félins et plusieurs primates non humains [12,13,–14]. Cependant, il reste un défi de comparer la sensibilité de ces espèces car des mesures standardisées entre les espèces n'ont pas été utilisées. À cet égard, plusieurs études ont prédit la probabilité d'infection par le SRAS-CoV-2 en analysant les orthologues de l'enzyme de conversion de l'angiotensine 2 (ACE2). Par exemple, Damas et al. ont utilisé les séquences ACE2 de 410 espèces de vertébrés et ont constaté que certains taxons en voie de disparition (par exemple, les doucs à tige rouge, les singes proboscis, les macaques rhésus et les petits rorquals de l'Antarctique) étaient les plus à risque d'infection par le SRAS-CoV-2 [15]. Dans le même temps, la résolution de la structure cristalline, les analyses de résonance plasmonique de surface et les simulations de dynamique moléculaire ont été utilisées pour évaluer l'affinité de liaison de différents orthologues ACE2 aux protéines de pointe [15, 16, -17]. Bien que ces études fournissent des informations précieuses sur la gamme d'hôtes probable du SRAS-CoV-2, leurs prédictions nécessitent une validation expérimentale. De plus, les effets des facteurs de l'hôte autres que l'ACE2 associés à l'invasion virale ont été sous-estimés dans ces prédictions [15, 18, 19].

Les expériences d'infection animale offrent la meilleure opportunité de comprendre la sensibilité, la pathogénicité et la transmissibilité des agents pathogènes à travers différents taxons [20,21,22,–23]. Cependant, il n'est pas pratique d'effectuer des études d'inoculation in vivo dans un large éventail d'espèces, en particulier dans la faune. Alternativement, un test d'infection in vitro de diverses lignées cellulaires a le potentiel d'offrir des informations essentielles sur l'infectivité du SRAS-CoV-2 [24, 25]. Par exemple, Chu et al. ont évalué la cinétique de réplication et les effets cytopathiques de 25 lignées cellulaires dérivées d'espèces différentes. Ils ont démontré que le SRAS-CoV-2 peut se répliquer dans des cellules de primate non humain, de chat, de lapin et de porc [24]. Dans une autre étude, des cellules épithéliales des voies respiratoires ont été collectées à partir de 12 espèces animales, et le SRAS-CoV-2 s'est avéré se répliquer efficacement dans des modèles de culture de singes et de chats [25]. Outre la demande de tests cellulaires pour évaluer le spectre d'hôtes potentiel, il est également urgent d'explorer comment les mutations peuvent affecter à la fois l'infectivité et la transmissibilité du SRAS-CoV-2 à différentes espèces. L'évolution adaptative continue du SRAS-CoV-2 a entraîné l'émergence rapide de nouvelles mutations ; cependant, on ne sait pas combien de ces mutations ont amélioré la sensibilité des animaux au SRAS-CoV-2.

Ici, nous avons d'abord évalué la gamme d'hôtes potentielle du SRAS-CoV, du MERS-CoV et du SRAS-CoV-2 à l'aide de virus pseudotypés et de cultures cellulaires dérivées de 55 espèces de mammifères. La capacité des mutations de site dans les protéines S à affecter la gamme d'hôtes du SRAS-CoV-2 a été déterminée à l'aide de la mutagenèse dirigée. Nous avons ensuite utilisé une approche de transcriptomique comparative pour identifier les expressions géniques associées à la sensibilité des espèces à ces virus. Cette étude fournit de nouvelles informations sur le tropisme plausible de l'hôte du SARS-CoV, du MERS-CoV et du SARS-CoV-2. De plus, nous avons découvert l'expression de facteurs hôtes susceptibles d'affecter la transmission inter-espèces du SRAS-CoV-2 et d'empêcher le futur retour de ces coronavirus des humains vers d'autres espèces.

Afin d'améliorer la reproductibilité de cette étude, dans la mesure du possible, nous avons échantillonné de jeunes mâles adultes en bonne santé de chaque espèce afin de réduire les effets du sexe, de l'âge, de l'immunité et des facteurs connexes. Pour récapituler les cellules avec la sensibilité la plus élevée, nous avons isolé les cultures de cellules primaires utilisées dans cette étude (tableau S1) à partir de plusieurs tissus (c. Les animaux ont été euthanasiés avec du CO2 ou du pentobarbital calcique (200 mg/kg). Les carcasses ont été disséquées, suivies du prélèvement de reins, de poumons, de cœurs, de rates ou de cerveaux dans des conditions aseptiques. Pour éviter le dessèchement, tous les tissus ont été placés dans du PBS stérile additionné d'une solution de pénicilline-streptomycine à 2% (Gibco, USA) jusqu'à l'extraction des cellules. Chaque tissu a été transféré dans une boîte de 35 mm et haché en petits morceaux à l'aide de ciseaux à dissection. Les fragments de tissu ont ensuite été transférés dans un tube conique de 50 ml, suivis d'une digestion enzymatique à l'aide d'EDTA-trypsine à 0, 25% (Gibco, USA) à 37 ° C pendant 30 min. Pendant la digestion, le mélange a été secoué vigoureusement toutes les 10 min. La digestion de la trypsine a été arrêtée par l'ajout de FBS dans le tube conique. Le mélange contenant des fragments de tissu a été pipeté de haut en bas pendant 3 minutes à l'aide d'un pipeteur de 5 ml pour briser les amas. La solution résultante a été centrifugée à 250 g pendant 5 min à 4 °C. Les cellules en culot ont ensuite été collectées, remises en suspension, comptées et ensemencées dans des boîtes de Pétri de 100 mm. Toutes les boites ont été placées à 37°C avec 5% de CO2. Les cellules ont été contrôlées quotidiennement pour la croissance cellulaire et la contamination. Des passages cellulaires réguliers ont été effectués lorsque les cellules ont atteint la confluence. Toutes les cellules primaires ont été isolées et cultivées dans du DMEM-F12 avec 10 % de FBS, une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % et 20 mM d'HEPES. Toutes les expériences ont été menées dans une installation de niveau de biosécurité 2 (BSL-2) et approuvées par le Comité d'éthique animale de l'Institut de zoologie de l'Académie chinoise des sciences (n° d'autorisation : IOZ-IACUC-2021-163).

Lignées cellulaires comprenant Huh-7 (Homo sapiens, foie), A549 (Homo sapiens, poumon), SW480 (Homo sapiens, côlon), HEK-293T (Homo sapiens, rein embryonnaire), Vero-E6 (Cercopithecus aethiops, rein), Marc-145 (Cercopithecus aethiops, rein), OK (Monodelphis domestica, rein), BHK-21 (Mesocricetus aura tus, rein), SP2/0 (Mus musculus, cellules de myélome), NIH3T3 (Mus musculus, embryon), MDBK (Bos taurus, rein), PK-15 (Sus scrofa, rein), MDCK (Canis familiaris, rein), F81 (Felis catus, rein) et Mv.1.lu (Neovison vison, poumon) ont été cultivées dans du DMEM. Des lignées cellulaires HT-29 (Homo sapiens, côlon) ont été cultivées dans du RPMI-1640 (Gibco, USA). Des lignées cellulaires NEF (rat taupe nu, embryon) ont été cultivées dans du DMEM-F12. Les lignées de cellules de chauve-souris immortalisées PaKi (Pteropus alecto, rein), PaLu (Pteropus alecto, poumon) et PaBr (Pteropus alecto, cerveau) ont été aimablement fournies par le Dr Linfa Wang (Duke-NUS Medical School) et cultivées dans du DMEM-F12. Toutes les lignées cellulaires ont été incubées à 37 ° C en présence de 5% de CO2 en utilisant des milieux de culture spécifiés qui ont été complétés par 10% de sérum bovin fœtal (FBS, Gibco, USA), une solution à 1% de pénicilline-streptomycine et 20 mM d'acide hydroxyéthylpipérazine éthane sulfonique (HEPES, Gibco, USA).

Les plasmides pVSV-eGFP-dG (Addgene #31842), pCAG-VSVN (Addgene #64087), pCAG-VSVP (Addgene #64088), pCAG-VSVL (Addgene #64085), pCAG-VSVG (Addgene #64084) et pCAG-T7pol (Addgene #59926) ont été acquis à partir d'Addgene. Les gènes S humains optimisés en codons du SARS-CoV (SARS coronavirus Tor2, GenBank accession No. NC_004718.3), SARS-CoV-2 (SARS coronavirus 2 Wuhan-Hu-1, GenBank accession No. NC_045512.2) et MERS-CoV (MERS coronavirus HCoV-EMC, GenBank accession No. NC_019843.3) ont été synthétisés et clonés dans un pcDNA3 .1 vecteur pour la génération de virus pseudotypés. Les plasmides construits ont été nommés respectivement pcDNA3.1-SARS-S, pcDNA3.1-SARS2-S et pcDNA3.1-MERS-S. L'expression des protéines S dans les cellules HEK-293T a été vérifiée par Western Blot. La mutagenèse dirigée a été réalisée en utilisant pcDNA3.1-SARS2-S comme matrice. Les amorces directes ont été conçues avec une Tm d'environ 75 ° C et les mutations étaient centrées au milieu, tandis que les séquences complémentaires inverses de correspondance ont été sélectionnées comme amorces inverses. Un volume de 20 μL de mélange PCR a été préparé pour contenir 10 μL 2 × Phanta Max Master Mix (Vazyme, République populaire de Chine), 10 pmol d'amorces sens et antisens et 10 ng de plasmide matrice. Après 20 cycles de PCR de mutagenèse dirigée, le plasmide matrice a été digéré à l'aide de l'endonucléase de restriction DpnI (NEB, USA). Ensuite, le produit de PCR a été transformé en cellules compétentes E. coli DH5a (Transgen, PR China). Des clones uniques ont été sélectionnés et séquencés. Tous les plasmides ont été extraits à l'aide du kit QIAGEN Plasmid Maxi (Qiagen, USA). Pour éviter l'introduction de contamination dans la culture cellulaire lors de la génération de virus pseudotypés, les plasmides extraits ont été inactivés dans un bain-marie à 65 ° C pendant 30 min. Les concentrations de plasmides ont été quantifiées à l'aide de Nanodrop2000 (Thermo Scientific, USA).

Premièrement, nous avons sauvé le virus VSVΔG*-G en nous basant sur des méthodes développées dans une publication précédente [27]. En détail, les cellules HEK-293T avec 80 % de confluence ont été co-transfectées avec les plasmides pVSV-eGFP-dG, pCAG-VSVN, pCAG-VSVP, pCAG-VSVL, pCAG-VSVG et pCAG-T7pol avec un rapport de 10, 3, 5, 1, 3 et 5 μg, respectivement, à l'aide de Lipofectamine 3000 (Invitrogen, Lituanie ), en suivant les instructions du fabricant. Le liquide surnageant a été récolté 48 h après la transfection et la moitié du liquide a été affectée à l'infection d'une deuxième plaque de cellules HEK-293T transfectées avec le plasmide pCAG-VSVG. Les cellules HEK-293T ont été examinées par microscopie à fluorescence pour l'expression de l'EGFP 24 h après l'infection. Le titrage du virus VSVΔG*-G a été quantifié par l'infection de cellules HEK-293T, suivie d'une analyse par cytométrie en flux pour un signal positif à l'EGFP.

Deuxièmement, nous avons construit des virus pseudotypés incorporés avec des protéines S du SARS-CoV, du MERS-CoV et du SARS-CoV-2 en utilisant un protocole rapporté dans des recherches antérieures [28]. Des cellules HEK-293T avec une confluence de 70 à 90 % ont été transfectées avec 15 μg de plasmides codant pour les protéines SARS-CoV, MERS-CoV et SARS-CoV-2 S à l'aide de Lipofectamine 3000. Simultanément, le plasmide codant pour les protéines VSV-G a été transfecté ou simulé transfecté dans des cellules 293 T comme contrôle positif ou négatif. Les cellules transfectées ont été cultivées à 37°C avec 5% de CO2. 24 h plus tard, les cellules ont été infectées avec des virus VSVΔG*-G à MOI = 3–4 et incubées pendant 2 h. Ensuite, le surnageant cellulaire a été jeté et les cellules ont été doucement rincées avec du PBS chaud deux fois. Ensuite, 10 ml de DMEM frais additionné de 10 % de FBS, d'une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % et d'HEPES 20 mM ont été ajoutés aux boîtes et incubés à 37 °C avec 5 % de CO2. 24 h plus tard, ces cellules ont été vérifiées pour un signal positif EGFP, et le liquide surnageant a été collecté, centrifugé, filtré et divisé en aliquotes. Tous les virus pseudotypés ont été stockés à -80 °C. Les cycles répétés de congélation-décongélation ont été évités.

Les cellules Huh-7 ont été utilisées pour la quantification des virus pseudotypés générés. En détail, les cellules Huh-7 ont été cultivées un jour avant la quantification. Une fois la confluence de 80 % atteinte, les cellules ont été digérées, quantifiées et ensemencées dans une plaque de 48 puits. Après une nuit d'incubation, les cellules ont été infectées par une série de 100, 50, 25, 12,5, 6,3, 3,2 et 1,6 μL de virus pseudotypés avec trois réplicats. Les cellules infectées ont été placées à 37°C avec 5% de CO2. 24 h après l'infection, ces cellules ont été examinées à l'aide d'un microscope à fluorescence, suivies d'une quantification par cytométrie en flux pour les cellules EGFP-positives. Les virus pseudotypés ont été titrés (unités de transduction, TU) en comptant les cellules individuelles infectées par les virus pseudotypés. La concentration finale de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS était de 4,85 × 106 TU/mL, 5,54 × 106 TU/mL et 1,14 × 107 TU/mL, respectivement.

Pour améliorer la reproductibilité de cette recherche, des passages P3 et P4 de cultures de cellules primaires ont été utilisés pour l'infection in vitro de virus pseudotypés. Les cultures cellulaires ont été ensemencées dans des plaques à 48 puits (10 000 cellules par puits), cultivées dans du DMEM-F12 additionné de 10 % de FBS, d'une solution de pénicilline-streptomycine à 1 % et d'HEPES 20 mM. Lorsque les cellules ont atteint 70 % de confluence, les surnageants de culture ont été jetés. Les cellules ont été rincées deux fois à l'aide d'un tampon PBS chaud additionné d'une solution de pénicilline-streptomycine à 1 %. Les cultures cellulaires ont été infectées par des virus pseudotypés, y compris des virus pseudotypés portant des protéines S de type sauvage et mutées, des glycoprotéines VSV-G et un contrôle négatif (surnageant de culture récolté à partir de cellules transfectées fictives). Chaque expérience d'infection avait trois répétitions indépendantes. Les virus ont été maintenus dans le milieu de culture additionné de 1% de FBS et d'une solution de pénicilline-streptomycine à 1% pendant 24 h, suivis d'une observation au microscope et d'une analyse par cytométrie en flux pour les cellules positives à la GFP. Pour VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-SARS2, les cultures cellulaires ont été infectées à MOI = 0,15 (référées aux cellules Huh-7). Pour VSVAG*-MERS, les cultures cellulaires ont été infectées à MOI = 0,3 (référées aux cellules Huh-7). Aucune corrélation n'a été observée entre les taux de transduction de VSVΔG*-noG et VSVΔG*-SARS2 (cor = −0,0637, p > 0,05), entre VSVΔG*-noG et VSVΔG*-SARS (cor = −0,0324, p > 0,05), et entre VSVΔG*-noG et VSVΔG*-MERS (cor = −0,0 723, p > 0,05).

Étant donné que le dosage d'infection qui transduit le même pourcentage de cellules ne reflète pas le même nombre de particules virales, et que la même quantité de particules virales de virus pseudotypés portant différentes protéines S mutées n'infecte pas les cellules avec les mêmes efficacités, il est difficile d'ajuster les virus pseudotypés dans le même dosage d'infection lorsque les cellules sont infectées par des virus pseudotypés portant des protéines S mutées du SRAS-CoV-2. Et, bien que nous ayons tenté de quantifier les virus pseudotypés par RT-qPCR, nous avons trouvé que les résultats contenaient des erreurs systématiques élevées en raison 1) du manque de gènes de référence raisonnables ; 2) le fait que l'efficacité de l'extraction de l'ARN varie selon les différents virus ; 3) l'erreur induite par les technologies qPCR ; et 4) la concentration de rendement des virus pseudotypés n'était pas idéalement stable. Par conséquent, nous avons utilisé un volume de 75 μL de virus pseudotypés pour infecter chaque culture cellulaire dans chaque test d'infection cellulaire.

Les cellules infectées ou faussement infectées par des virus pseudotypés ont été observées au microscope à fluorescence. Une fois le milieu de culture jeté, les cellules ont été rincées deux fois dans du PBS chaud, suivies d'une digestion EDTA-trypsine à 0, 25% pendant 5 min. Ensuite, les cellules ont été recueillies dans des tubes de 1,5 mL. Les cellules ont été lavées deux fois avec du PBS pour éliminer la trypsine et filtrées à l'aide d'un tamis cellulaire de 70 μm (BD Falcon, USA) pour éliminer les amas de cellules. Les cellules finales ont été placées sur de la glace dans une chambre noire. Des analyses de cytométrie en flux ont été réalisées (CytoFLEX, Beckman Coulter, USA). Des cellules infectées par des virus VSV△G*-G ou un contrôle négatif ont été utilisées pour optimiser la tension des détecteurs FSC, SSC et FITC, et pour quantifier les populations cellulaires pour les particules positives ou négatives. Pour chaque test d'infection, au moins 5000 cellules au total ont été saisies. Le pourcentage des taux de transduction a été affiché sous forme de moyenne ± SD sur la base de trois répétitions indépendantes.

L'interface entre le RBD de la protéine S du SRAS-CoV-2 et les orthologues ACE2 de différentes espèces a été examinée par des simulations de dynamique moléculaire (MD) à l'aide d'Amber 20 [29,30,–31]. Nous avons d'abord téléchargé les séquences d'acides aminés de la base de données NCBI (National Center for Biotechnology Information) ou de notre ensemble de données RNA-seq généré. La structure cristalline RBD-ACE2 (PDB ID : 6M0J) a été téléchargée à partir de la Protein Data Bank [32] et a servi de modèle pour préparer des modèles 3D pour les orthologues SARS-CoV-2 S-RBD et ACE2 sur SWISS-MODEL [33]. Ensuite, chaque système a été vérifié par saut et solvaté dans une boîte périodique cubique d'eau TIP3P prolongée de 10 Å du soluté. Le système a été neutralisé à l'aide d'un nombre rationnel de contre-ions de Na+ ou Cl−, suivi d'un paramétrage à l'aide d'un champ de force Amber ff14SB [34]. Ensuite, 10 000 étapes de minimisation d'énergie dont 5 000 étapes utilisant la méthode de descente la plus raide et 5 000 étapes de minimisation du gradient conjugué ont été effectuées. Chaque système a ensuite été chauffé à 300 K dans l'ensemble NVT par 0,2 ns. Les simulations de minimisation, d'échauffement et d'équilibre ont été réalisées avec de fortes contraintes (500 kcal/mol/Å2) sur des atomes lourds avec le programme sander d'Amber20. Les simulations MD de 30 ns ont été réalisées sous température constante à 300 K avec ensemble NPT et pmemd.cuda. La température du système a été maintenue en utilisant la dynamique de Langevin. La distance de coupure entre l'énergie de Van der Waals et l'énergie électrostatique à courte portée était de 10 Å. La méthode d'Ewald à mailles de particules a été utilisée pour calculer les interactions électrostatiques à longue portée. Au moins 3000 instantanés ont été extraits de la trajectoire d'équilibre pour la structure moyenne finale de chaque complexe RBD-ACE2. La méthode MM/GBSA a été utilisée pour calculer l'énergie libre de liaison (ΔG), et l'énergie libre de liaison a été décomposée en la contribution énergétique de chaque résidu [35].

Nous avons exploré si une variante de pointe interagissait avec un résidu ACE2 spécifique en fonction du taux de transduction d'une espèce à l'autre. Pour chaque variante de pointe, les lignées/espèces cellulaires ont été classées en deux groupes (groupes hautement et faiblement infectés, respectivement) à l'aide d'une méthode de regroupement k-means. Ensuite, à chaque position de 42 résidus clés d'ACE2 estimés par simulation MD, l'acide aminé avec le nombre le plus élevé a été identifié comme le résidu majeur pour cette position, et sa fréquence a été calculée. Enfin, un test exact de Fisher a été utilisé pour quantifier si le résidu majeur était uniformément réparti entre les groupes hautement et faiblement infectés. Un résidu avec une valeur p du test exact de Fisher inférieure à 0,05 indique que la fréquence du résidu différait significativement entre les groupes d'infection élevée et faible. Cela implique qu'il peut avoir interagi avec une variante de pointe.

Pour améliorer encore la reproductibilité de cette étude, nous avons effectué une analyse ARN-seq pour les cultures cellulaires générées. Les ARN totaux des cultures cellulaires utilisées pour l'analyse de l'infection in vitro ont été isolés à l'aide du réactif TRIzol conformément au guide de l'utilisateur (Invitrogen, USA). La qualité et la concentration de l'ARN ont été évaluées à l'aide d'un bioanalyseur Agilent 2100 (Lexington, États-Unis) avant la construction de la bibliothèque. Pour chaque échantillon d'ARN, une taille de bibliothèque de 150 pb a été construite à l'aide du kit de préparation de bibliothèque NEBNext Ultra RNA Library Prep Kit for Illumina® (NEB, USA). Le séquençage apparié a été réalisé à l'aide de Novogene Co. Ltd sur la plate-forme "Illumina" NovaSeq 6000. Cela a généré environ 2,7 milliards de lectures. Nous avons utilisé IllQC_PRLL.pl dans le package "NGSQCTools" pour supprimer les lectures de mauvaise qualité des données brutes [36]. Pour générer les ensembles d'orthologues spécifiques à l'espèce et calculer les valeurs d'expression, nous avons téléchargé les génomes de référence des espèces (si disponibles) à partir de la base de données publique. Pour ceux qui n'avaient pas de génome de référence, Trinity a été utilisé pour effectuer un assemblage de novo de transcrits [37] basé sur le transcriptome hépatique, rénal et cérébral précédemment généré pour assembler les transcrits [38]. La taille k-mer du paramètre fixe était de 25, la longueur minimale du contig était de 200 et la longueur des fragments appariés était de 500. Nous avons ensuite utilisé "cd-hit-est" pour traiter les transcrits assemblés à partir de différents tissus de la même espèce, regrouper les séquences avec 90% de similarité et laisser le transcrit le plus long dans chaque cluster [39, 40]. Enfin, Augustus a été employé pour effectuer une prédiction génétique sur les transcrits dé-redondants et pour obtenir des fichiers d'annotation GTF.

Pour construire la séquence de référence humaine, nous avons utilisé "gffread" dans le package "cufflink" pour extraire la séquence CDS humaine, filtré les transcrits ORF incomplets et les transcrits pseudogènes, et extrait le transcrit le plus long pour chaque gène [41]. BLAST a été utilisé pour éliminer les gènes hautement répétitifs et hautement similaires avec une valeur e <10-6 et une identité > 90 % comme seuil de filtrage [42]. Les taux de mappage dans l'ensemble de données variaient de 9,63 % à 66,58 %. Enfin, 18 552 gènes uniques codant pour des protéines ont été obtenus comme séquences de référence.

Le transcrit le plus long de chaque gène a été extrait et un "BLAST" réciproque a été réalisé avec les séquences protéiques des échantillons humains [43]. Le seuil de filtrage a été fixé à 10−6 pour les e-values ​​et 30% pour l'identité. Deux gènes les mieux alignés l'un avec l'autre ont été définis comme des gènes orthologues. Étant donné que le génome complet et le génome de novo sont assez différents lorsqu'ils sont comparés, nous avons utilisé la séquence CDS de gènes orthologues comme génome de référence et généré des fichiers d'annotation au format GTF pour la cartographie des données ARN-seq. STAR a été utilisé pour construire un indice basé sur la taille de la séquence de l'ensemble de gènes orthologues et la longueur de lecture des différentes espèces. Nous avons utilisé les paramètres par défaut pour aligner les données RNA-seq avec le génome de référence [44]. Nous avons utilisé "featureCounts" dans le progiciel Subread pour compter les lectures et éliminer les lectures à correspondance multiple [45].

Enfin, nous avons calculé la taille de la bibliothèque de chaque échantillon en tant que facteur de normalisation. Le progiciel R "edgeR" a été utilisé pour normaliser la taille de la bibliothèque et la longueur du gène (basée sur l'homme) par log2 (RPKM-TMM + 1) [46, 47]. Les informations sur les échantillons, les taux de cartographie, la liste des orthologues, la longueur des gènes et les niveaux d'expression sont disponibles dans les tableaux S12 à S17.

Afin d'identifier les gènes dont l'expression est associée à la transduction de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS, un modèle linéaire généralisé a été utilisé pour tester la corrélation entre l'expression des gènes et les taux de transduction. Si un gène orthologue n'était pas identifié dans une espèce particulière, ce gène était supposé ne pas être exprimé dans cette espèce (valeur d'expression du gène = 0). Nous avons filtré les gènes exprimés dans moins de trois échantillons. Les moindres carrés ordinaires, le modèle brownien et le modèle d'Ornstein-Uhlenbeck ont ​​été utilisés pour déterminer la meilleure corrélation dans le taux de transduction de chaque gène. Étant donné qu'aucun signal phylogénétique n'a été détecté pour les taux de transduction de VSVΔG*-SARS2 et VSVΔG*-SARS, les relations phylogénétiques n'ont pas été prises en compte dans les analyses de régression des taux de transduction des deux virus pseudotypés. Cependant, une méthode en deux étapes a été utilisée dans toutes les analyses de régression pour corriger la valeur de p [47, 48]. Dans la première étape, les espèces qui avaient le plus grand impact sur la pente (c'est-à-dire les valeurs aberrantes potentielles) ont été supprimées par les résidus, puis la régression a été effectuée à nouveau. Nous avons défini la valeur p résultante comme p.robust pour supprimer l'influence des valeurs aberrantes sur la régression. La deuxième étape consistait à répéter le processus de régression pour les espèces restantes et à supprimer une des espèces restantes à chaque fois jusqu'à ce que toutes les espèces restantes soient supprimées une fois. Nous avons ensuite noté la valeur p la plus grande (la moins significative) du processus comme p.max pour supprimer l'impact des espèces sur la régression. Le seuil des gènes significatifs a été fixé à p.robust < 0,01 et p.max < 0,05. Des analyses d'enrichissement de gènes ont été réalisées à l'aide de DAVID 2021 mis à jour (Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery) [49]. Le paramètre pour EASE était de 0,3 avec le test exact de Fisher.

R a été utilisé pour le tracé et l'analyse statistique ; les valeurs ont été exprimées en moyenne ± ET. Lorsque des cultures cellulaires ont été infectées par le VSVΔG*-SARS2 portant la protéine S de type sauvage, les taux de transduction relatifs ont été classés en quatre catégories (transduction minimale, légère, modérée et efficace) sur la base des principes suivants. Tout d'abord, nous avons répertorié le quantile de tous les taux de transduction et calculé l'intervalle interquartile (IQR). Ensuite, nous avons calculé l'écart type (SD) des taux de transduction allant du minimum à Q1. Cela a été nommé SDQ1. Une infection cellulaire avec un taux de transduction inférieur à dix fois SDQ1 a été classée comme une infection négligeable ; une infection cellulaire avec un taux de transduction compris entre 10* SDQ1 et Q3 a été classée comme une infection légère ; un taux de transduction entre Q3 et Q3 + 1,5*IQR a été classé comme une infection modérée ; et un taux de transduction supérieur à Q3 + 1,5*IQR a été classé comme une infection efficace. Ce principe a également été appliqué pour évaluer les résultats d'infection de cultures cellulaires par VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS. Lorsque des cultures cellulaires ont été infectées par des virus pseudotypés VSVΔG*-SARS2-Smut portant des protéines S mutées du SARS-CoV-2, les résultats d'infection de chaque VSVΔG*-SARS2-Smut ont été normalisés aux résultats de transduction relatifs des cellules A549. Les valeurs aberrantes ont été postulées comme des mutations qui ont considérablement amélioré le tropisme du SRAS-CoV-2.

Pour évaluer la sensibilité au SARS-CoV-2, au SARS-CoV et au MERS-CoV, des virus pseudotypés codant pour la GFP portant des protéines S pertinentes, nommés respectivement VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS, ont été générés (Fig. S1). Ensuite, nous avons collecté des cultures cellulaires issues de 55 espèces de mammifères appartenant à 12 ordres, dont Diprotodontia (une espèce), Didelphimorphia (une espèce), Hyracoidea (une espèce), Scandentia (une espèce), Primates (trois espèces), Lagomorpha (une espèce), Rodentia (huit espèces), Eulipotyphla (une espèce), Perissodactyla (deux espèces), Artiodactyla (trois espèces), Carnivora (sept espèces) et Chiroptera ( 26 espèces) (Fig. 1, Fig. S1). Un total de 83 cultures cellulaires, dont 64 cultures cellulaires primaires, trois cultures cellulaires immortalisées et 16 lignées cellulaires ont été obtenues (tableau S1). Parmi ces cultures cellulaires, 56 provenaient des reins dans lesquels les ACE2 étaient abondamment exprimés ; 10 provenaient des poumons ; sept provenaient du cœur; et les 10 cultures cellulaires restantes provenaient d'autres tissus, tels que l'embryon, le côlon et la rate (Fig. 1, Tableau S1). Ces cultures cellulaires ont été infectées par des virus pseudotypés et soumises à une analyse par cytométrie en flux des signaux GFP-positifs pour quantifier leurs taux de transduction (Fig. S1). Dans l'ensemble, les cultures cellulaires dérivées des reins ont montré des taux de transduction relativement plus élevés que ceux des autres tissus (Fig. S2A). Aucune différence significative dans les taux de transduction vers des virus pseudotypés n'a été observée entre les cultures de cellules primaires et les lignées cellulaires permanentes (Fig. S2B).

Un arbre phylogénétique de 55 cultures de cellules de mammifères a été utilisé dans cette étude. Une phylogénie a été extraite de TIMETREE (http://www.timetree.org/). Les taxons indiqués en police rouge sont des espèces qui peuvent être naturellement infectées par le SRAS-CoV-2 sur la base d'études antérieures, tandis que les taxons indiqués en police bleue sont des espèces qui ont été testées par des analyses d'infection expérimentales in vivo. De plus, 83 cultures cellulaires ont été dérivées des reins, du cœur, des poumons, du cerveau et d'autres tissus. Les éléments de dessin animé avec des cadres noirs sont des lignées cellulaires dérivées de ces tissus. Les minuscules dessins animés ont été obtenus auprès de BioRender (https://biorender.com/). B Taux de transduction (moyenne ± ET, n = 3) de 83 cultures cellulaires infectées par les virus VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS. Certaines cultures cellulaires provenaient du même hôte. Dans ce cas, les cultures cellulaires avec les taux de transduction les plus élevés sont affichées dans ce panneau. Les lignes pointillées grises et noires représentent la norme pour définir respectivement une transduction modérée et efficace.

Lors de l'infection par VSVΔG * -SARS2, les 83 cultures cellulaires présentaient des sensibilités différentes, avec un taux de transduction global de 0 à 26, 7% (Fig. 1, Fig. S3, Tableau S1). Quarante-quatre cultures cellulaires ont été minimalement transduites par VSVΔG*-SARS2 (taux de transduction < 1,2 %). Au total, 32 cultures cellulaires ont été légèrement (taux de transduction de 1,2 à 3,8 %) ou modérément (taux de transduction de 3,8 à 8,8 %) transduites par VSVΔG*-SARS2, y compris des cultures cellulaires provenant de chiens (BcKi, BcLu et MDCK), de chats (F81), de furets (MpuHe), de chiens viverrins (NpKi), de visons (Mv.1.Lu), de musaraignes arboricoles (Tb Ki) et les porcs (PK-15) (Fig. 1, Fig. S3). Ceci est cohérent avec le fait que les chiens viverrins, les chiens, les chats, les visons, les furets, les musaraignes arboricoles et les hamsters sont connus pour être sensibles au SRAS-CoV-2 avec des signes cliniques asymptomatiques à modérés (tableau S2) [22, 50]. Nous avons constaté que VSVΔG * -SARS2 peut infecter les cellules PK-15 (4, 9%) (Fig. 1), mais des conclusions incohérentes ont été tirées par des infections expérimentales antérieures. Plusieurs études ont montré que les porcs étaient résistants au SRAS-CoV-2 [23, 51, 52], tandis que d'autres études ont montré que le SRAS-CoV-2 pouvait infecter les porcs et être transmis aux porcs sentinelles naïfs co-hébergés [53, 54]. Les cultures cellulaires de plusieurs animaux de compagnie, telles que les cellules cardiaques (OdHe), pulmonaires (OdLu) et rénales (OdKi) du dègue commun (Octodon degus, un rongeur hystricomorphe) et les cultures cellulaires cardiaques (GkHe) du loir de Kellen (Graphiurus kelleni, un rongeur gliride) ont été modérément transduites par VSVΔG*-SARS2 (Fig. 1). Des souris se sont avérées résistantes à l'infection SARS-CoV-2 ; cependant, les cultures cellulaires de souris (NIH3T3 et SP2/0) ont été légèrement transduites par VSVΔG*-SARS2 (Fig. S3, Tableau S1). Étant donné que le SRAS-CoV-2 peut s'adapter par passages en série dans les voies respiratoires de souris BALB/c âgées [55, 56], nous avons supposé que les animaux qui n'étaient pas sensibles au SRAS-CoV-2 pourraient être des hôtes potentiels suite à l'évolution virale lors d'expositions répétées.

Enfin, sept cultures cellulaires dérivées de chauves-souris fer à cheval de Thomas (RtKi), de chauves-souris fer à cheval royales, d'humains, de civettes palmistes, de singes verts d'Afrique et de furets se sont révélées très sensibles au VSVΔG*-SARS2 (taux de transduction > 8,8 %). Parmi eux, les humains, les civettes palmistes et les furets ont été identifiés comme des hôtes sensibles au SRAS-CoV et au SRAS-CoV-2 sur la base d'analyses in vivo (tableau S2) [57]. En particulier, 14,0 % de Huh-7 (lignée cellulaire humaine), 11,4 % de Vero-E6 (lignée cellulaire de singe vert), 11,9 % de Marc-145 (lignée cellulaire de singe vert) et 10,0 % de MpuKi.2 (lignée cellulaire de rein de furet) ont été transduits, ce qui a confirmé que ces lignées cellulaires sont très sensibles au SARS-CoV-2, comme cela a été constaté dans des études antérieures [28, 58]. Nous avons noté que les cellules rénales de la civette palmiste (PlKi) étaient très sensibles au VSVΔG*-SARS2, car les civettes palmistes ont été reconnues comme l'un des hôtes de réplication du SRAS-CoV [8, 59] (Fig. 1, Fig. S2). Fait important, les cellules rénales du furet (Mustela putorius furo) (MpuKi.2) étaient également très sensibles au SRAS-CoV-2. Des études expérimentales ont montré que les furets sont sensibles au SARS-CoV-2 [23, 51, 60,61,62]. Les cultures de cellules primaires dérivées de la chauve-souris en fer à cheval de Thomas et de la chauve-souris en fer à cheval royale se sont révélées plus sensibles au VSVΔG*-SARS2 que la lignée cellulaire humaine Huh-7 (Fig. 1, Tableau S1), ce qui suggère qu'elles pourraient servir d'hôtes probables pour le SRAS-CoV-2.

Les estimations du maximum de vraisemblance du λ de Pagel pour les taux de transduction de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS étaient de 6,74 × 10−5 (test de signal phylogénétique : logλ = −163,95, p > 0,05), 6,33 × 10-5 (logλ = −192,22, p > 0,0 5) et 0,74 (logλ = −174,13, log0 = 1475,26, p = 0,09 × 10−2), respectivement, indiquant que les taxons étroitement apparentés ont généralement une sensibilité similaire au VSVΔG*-MERS mais pas au VSVΔG*-SARS et au VSVΔG*-SARS2. De manière constante, VSVΔG*-SARS a montré un profil de tropisme plus similaire avec VSVΔG*-SARS2 (R2 = 0,61, p < 0,001, test des moindres carrés phylogénétique généralisé) qu'avec VSVΔG*-MERS (R2 = 0,29, p < 0,001, test des moindres carrés phylogénétique généralisé). En particulier, les 83 cultures cellulaires infectées par le VSVΔG*-SARS ont affiché un taux de transduction de 0 à 38,4 % (Fig. 1). Dans l'ensemble, 38 cultures cellulaires étaient minimalement (taux de transduction de 0 à 1,1 %), 23 légèrement (1,1 à 3,8 %), 10 modérément (3,8 à 8,9 %) et 11 fortement (8,9 à 38,4 %) transduites par le VSVΔG*-SARS. Les cultures cellulaires qui ont montré la sensibilité la plus élevée au VSVΔG*-SRAS provenaient de furets domestiques, avec 38,4 % de cellules MpuKi.2 de rein de furet et 31,1 % de cellules MpuKi.1 de furet transduites. Cela représente une augmentation de 2,6 fois et 2,0 fois par rapport à celle des cellules humaines (Huh-7) (Fig. 1, Fig. S4, Tableau S1). Ceci est remarquable car les furets ont été utilisés comme modèle animal pour le SRAS-CoV et présentent des signes cliniques, notamment des éternuements, de la fièvre et de la diarrhée [63]. La culture cellulaire qui s'est classée la plus élevée après les cellules rénales du furet était dérivée de la chauve-souris en fer à cheval de Thomas, qui avait un taux de transduction de 37,2 %, indiquant que cette espèce pourrait également servir d'hôte important pour le SRAS-CoV.

Les civettes palmistes ont été reconnues comme un hôte de réplication du SARS-CoV. Nos résultats indiquent un taux de transduction constant et élevé (9,1 %) pour les cellules PlKi de civette palmiste. De plus, VSVΔG*-SARS a montré une capacité supérieure à VSVΔG*-SARS2 dans la transduction de cultures cellulaires d'espèces hautement sensibles, telles que RtKi (37,2 % contre 25,5 %), PK-15 (13,4 % contre 4,9 %), MpuKi.2 (38,4 % contre 10,0 %), MpuKi.1 (33,3 % contre 1,9 %) et BcKi (21. 1 % contre 3,8 %) cellules (Fig. 1, Fig. S4). Cela implique que le SARS-CoV pourrait être plus facile à transmettre des humains aux hôtes naturels que le SARS-CoV-2.

Nous avons constaté que 41 cultures cellulaires étaient minimalement (taux de transduction allant de 0 à 1, 3%), 21 légèrement (1, 3–4, 3%), 13 modérément (4, 3–10, 0%) et 8 efficacement (10, 0–32, 9%) transduites par VSVΔG * -MERS (Fig. 1, Fig. S3). De manière frappante, les lignées cellulaires humaines ont montré le taux de transduction le plus élevé lors de l'infection par VSVΔG*-MERS, ce qui était différent de celui de VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-SARS2. De plus, parmi les 10 premières cultures cellulaires avec les taux de transduction les plus élevés, six (MlKi, RrKi, RtKi, MsKi, PlaKi et MfiKi) provenaient de chauves-souris (Fig. 1, Fig. S3), ce qui suggère que plusieurs espèces de chauves-souris servent d'hôtes réservoirs potentiels pour le MERS-CoV. En particulier, la chauve-souris pipistrelle japonaise (Pipistrellus abramus) est une espèce préoccupante. Ils vivent à proximité des communautés humaines et ont le potentiel de transmettre le virus aux humains [64]. Et, bien que des études antérieures aient suggéré que les furets sont résistants à l'infection par le MERS-CoV [65], nous avons constaté que 10,0 % des cultures de cellules MpuKi.2 de rein de furet étaient transduites par le virus pseudotypé MERS-CoV (Fig. 1). De plus, le récepteur DPP4 du MERS-CoV [66] est faiblement exprimé dans les cellules rénales du furet. Ces résultats impliquent qu'il existe des facteurs autres que la DPP4 qui peuvent contribuer à l'entrée du MERS-CoV et que les furets sont sensibles au SARS-CoV, au SARS-CoV-2 et au MERS-CoV.

Pour déterminer si les variants de la protéine S du SRAS-CoV-2 modifient la sensibilité au SRAS-CoV-2, 77 125 gènes de pointe du SRAS-CoV-2 ont été extraits du GISAID (extrait le 26/10/2020) et 65 variants avec des fréquences de résidus supérieures à 0,075 % ont été sélectionnés (Fig. 2A). De plus, quatorze mutations de résidus dans les protéines S de variants du SRAS-CoV-2 isolés à partir d'échantillons de souris, de chat, de chien, de vison et de tigre ont été sélectionnées, ainsi que des mutations des protéines S du bat-CoV RaTG13 (GISAID : EPI_ISL_402131), du bat-CoV RmYN02 (GISAID : EPI_ISL_412977) et du pangolin-CoV MP789 (GISAID : EPI_ISL_ 412860). Au total, 79 virus pseudotypés avec des protéines SARS-CoV-2 S mutées ont été construits, suivis de l'infection in vitro de 44 cultures cellulaires (Fig. 2B).

A La fréquence de substitution pour chaque site a été analysée sur la base des séquences S extraites de la base de données GISAID. B Distribution de 79 mutations de sites de la protéine S. Le site avec un cadre noir signifie que cette mutation a été sélectionnée sur la base d'une analyse comparative du génome viral dérivé d'hôtes animaux. C Les taux de transduction normalisés globaux de toutes les mutations dans différentes cultures cellulaires. Les minuscules dessins illustrés sur la figure représentent des espèces de différents ordres de mammifères. L'origine tissulaire de ces cultures cellulaires est indiquée sur l'axe des abscisses. Structure DA 3D du complexe S-ACE2 montrant que del69-70, D80Y, S98F, T572I et Q675H sont situés à l'extérieur du RBD des protéines S.

Nous avons constaté que la plupart de ces mutations avaient peu d'impact sur l'efficacité de la transduction des virus pseudotypés VSVΔG*-SARS2-Smut sur les cultures cellulaires (Fig. 2C, Fig. S5). Comme prévu, les cultures cellulaires d'humains, de singes et de chauves-souris (Huh-7, Vero-E6, Marc-145 et PabKi.1) étaient plus sensibles aux virus pseudotypés par rapport aux autres cultures cellulaires (Fig. 2C). Des études antérieures ont montré que les substitutions N439K, N501Y, D614G et H655Y dans les protéines S améliorent la pathogénicité et la transmission du SARS-CoV-2 chez l'homme [67,68,–69]. Dans la présente étude, nous avons constaté que ces substitutions ne favorisent pas toujours le taux de transduction. Par exemple, H655Y a augmenté la transduction de VSVΔG * -SARS2 vers les cellules de musaraigne des arbres (TbKi) (Fig. S5), tandis que la substitution D614G a considérablement réduit la capacité de VSVΔG * -SARS2 à transduire dans les cellules de fibroblastes de rat-taupe nu et dans les cellules de chauves-souris pipistrelles japonaises (PabKi.1) (Fig. S6). De plus, la substitution T22I a considérablement réduit le tropisme du SRAS-CoV-2 en F81 (lignée cellulaire de rein de chat) et BHK-21 (lignée cellulaire de rein de hamster doré). De plus, les substitutions H519N et T716I ont montré une capacité réduite à transduire PK-15 (lignée cellulaire de rein de porc) et PaKi (lignée cellulaire de rein de renard volant noir). Enfin, les substitutions T29I, E281V et S939F ont considérablement réduit le tropisme du SRAS-CoV-2 en cultures de cellules MfuKi (cellule rénale de chauve-souris à ailes courbées orientales) (Fig. S5).

Plusieurs mutations se sont avérées augmenter de manière significative les efficacités de transduction de VSVΔG*-SARS2-Smut dans certaines cultures cellulaires (Fig. 2C, Fig. S5). En particulier, del69-70 dans la protéine S a favorisé la capacité de VSVΔG*-SARS2-Sdel69-70 à transduire les cellules PabKi.1 de chauve-souris (17,8 %) à un niveau deux fois supérieur à celui des cellules Huh-7 (9,8 %) (Fig. S5B). De même, VSVΔG * -SARS2-SD80Y a provoqué un taux de transduction de 7, 2% dans les cellules de hamster doré, supérieur à celui des cellules Huh-7 (6, 6%) (Fig. S5C). Nous avons constaté que la substitution S98F augmentait de manière significative le taux de transduction dans les cellules rénales de chien viverrin (62, 4%) et les cellules rénales de chauve-souris à grandes pattes de Rickett (45, 0%) par rapport aux cellules Huh-7 (38, 9%) (Fig. S5D). De même, la substitution T572I a augmenté de manière significative l'efficacité de transduction de VSVΔG * -SARS2 vers les cellules porcines PK15 (11, 3%) par rapport aux cellules Huh-7 (12, 2%) (Fig. S5E). La mutation Q675H a également considérablement amélioré la capacité du virus pseudotypé SARS-CoV-2 à infecter les cellules rénales de la gerbille à queue grasse, avec un taux de transduction de 13,4 % contre 15,7 % dans les cellules Huh-7 (Fig. S5F). Notamment, ces cinq mutations étaient situées en dehors du domaine de liaison au récepteur (RBD) de la protéine S (Fig. 2D). Ainsi, ces résultats soutiennent l'idée que différentes mutations ont un impact unique sur la sensibilité virale chez des espèces de mammifères particulières, et que les variants à l'intérieur et à l'extérieur de la région RBD sont d'une importance égale pour l'entrée et la liaison virales.

Des simulations dynamiques moléculaires utilisant Amber 20, ainsi que le complexe cristallin de RBD-hACE2 (PDB ID : 6M0J), indiquent que l'énergie libre de liaison (ΔG) entre RBD et différents orthologues ACE2 variait de -64,7 à -24,8 kcal/mol. Les ACE2 de singes verts (Chlorocebus sabaeus) et de grandes chauves-souris en fer à cheval (Rhinolophus ferrumequinum) ont montré l'énergie libre de liaison la plus élevée et la plus faible avec le SARS-CoV-2 S-RBD, respectivement (Fig. S6A). Nous avons ensuite analysé les contributions d'énergie libre basées sur une base par résidu (Fig. S6B – D). Les résultats ont montré qu'il y avait 42 résidus d'acides aminés qui étaient importants pour les interactions entre RBD et ACE2 (Fig. S6B – E).

À cet égard, le spectre d'infection inter-espèces de différentes variantes de pointe nous a permis d'explorer la possible « interaction » au niveau du site entre les résidus d'acides aminés ACE2 et les variantes de pointe qui peuvent affecter le taux de transduction d'une espèce à l'autre. En testant si la fréquence des principaux résidus était uniformément répartie entre les groupes d'infection élevée et faible suggérés par chaque variante de pointe, nous avons identifié 98 combinaisons de variantes de pointe et de résidus ACE2 qui étaient candidats à de telles «interactions» potentielles («matériel et méthodes», Fig. S7, tableau S3). Les positions ACE2 les mieux classées impliquées dans ces interactions significatives étaient 49, 31, 354, 82, 75, 35, 353, tandis que les variantes de pointe les mieux classées comprenaient P26L, S254F, H519N, H146Y, A262S et T478I. La majorité de ces interactions (86,7 %) impliquaient les variantes de pointe de la région RBD (tableau S3). Ces résultats soutiennent la possibilité que différentes variantes de pointe aient un impact unique sur la sensibilité virale en interagissant avec des résidus ACE2 distincts et/ou d'autres facteurs intrinsèques chez des espèces de mammifères particulières.

Des profils transcriptomiques de cultures cellulaires de 42 espèces de mammifères ont été générés et des analyses de régression ont été effectuées pour identifier les gènes dont les expressions étaient significativement corrélées aux taux de transduction de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS. Au total, il y avait 590 gènes dont les niveaux d'expression étaient significativement associés aux taux de transduction de VSVΔG*-SARS2 (Fig. 3A, Tableau S4). La voie la plus significativement enrichie était l'infection par le virus Herpes simplex 1 (p = 4, 30 × 10-23, test exact de Fisher), dans laquelle 93, 6% (59 des 63 gènes) des gènes associés sont des protéines à doigt de zinc (Fig. 3B, Tableau S5). Les processus biologiques enrichis correspondants qui contiennent des protéines à doigt de zinc sont la régulation de la transcription basée sur l'ADN (p = 2,40 × 10−12, test exact de Fisher) et la régulation de la transcription du promoteur de l'ARN polymérase II (p = 5,10 × 10−10, test exact de Fisher) (Tableau S6). Les protéines à doigts de zinc semblent fonctionner dans les interactions hôte-virus et jouent de multiples rôles dans la réplication virale en régulant les profils de transcription des cellules hôtes [70]. De nombreuses protéines à doigts de zinc sont positivement corrélées aux taux d'infection par VSVΔG*-SARS2. Cela indique que les niveaux de transcription des cellules hôtes sont importants pour l'entrée du SARS-CoV-2, qui dépend généralement d'un mécanisme appelé "cap snatching", comme observé dans le virus de la grippe [71]. Les cinq principaux gènes associés aux taux de transduction de VSVΔG*-SARS2 dans les cultures cellulaires étaient PDZK1 (p.robust = 5,87 × 10−11), SERPINF2 (p.robust = 2,31 × 10−9), SCG5 (p.robust = 3,51 × 10−9), DEPP1 (p.robust = 4,57 × 10−9) et ABCC6 ( p.robust = 2,71 × 10-8) (Fig. 3C, Fig. S8, Tableau S4). Ces gènes méritent d'être explorés plus avant. Par exemple, PDZK1 code pour une protéine d'échafaudage contenant un domaine PDZ (PSD95/DLG/ZO-1) (nommée NHERF3), qui appartient à un groupe de protéines qui interviennent dans les jonctions cellule-cellule et est impliquée dans la coordination d'une gamme variée de processus de régulation. Une étude précédente a montré que le SRAS-CoV et le virus de la rage neurotrope sont liés aux fonctions de liaison au PDZ de leurs protéines d'enveloppe [72]. PDZK1 peut interagir avec SR-B1 et faciliter l'entrée du virus de l'hépatite C [73]. De plus, le motif de reconnaissance PDZ C-terminal de l'ACE2 802QTSF805 se lie à NHERF1 et/ou NHERF3 et favorise l'entrée des cellules SARS-CoV-2 médiée par ACE2 [74, 75]. SERPINF2 code pour l'un des inhibiteurs de la sérine protéase. Une étude récente a révélé que l'expression de SERPINF2 augmente dans les taux sériques des patients atteints de COVID-19, ainsi que plusieurs autres SERPIN (SERPINA1 et SERPINA3) [76]. De plus, plusieurs gènes, tels que MAK16 (p.robust = 1,92 × 10−5), H3Y2 (p.robust = 4,08 × 10−5) et RBMX (p.robust = 6,14 × 10−5), ont montré une corrélation négative significative avec les taux de transduction (Fig. S8, Tableau S4). Le rôle de MAK16 et H3Y2 dans l'infection virale n'est pas clair, tandis que RBMX, qui code pour les protéines de motif de liaison à l'ARN X-ed, répond à l'entrée du SRAS-CoV-2 via des interactions ARN viral-protéine hôte [77, 78].

Graphique de Venn AA montrant 590 gènes, 453 gènes et 416 gènes significativement associés aux taux de transduction des virus pseudotypés VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS, respectivement. Au total, 95 gènes étaient couramment associés aux trois virus pseudotypés. B Les voies KEGG qui étaient enrichies par ces gènes et avaient des expressions associées aux taux de transduction de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS. C Tracés de plusieurs gènes dont les expressions étaient associées aux taux de transduction de VSVΔG*-SARS2, VSVΔG*-SARS et VSVΔG*-MERS. D Carte thermique de 95 gènes couramment associés aux trois virus pseudotypés. Le niveau d'expression était représenté par log2(RPKM + 1). Les cultures cellulaires marquées par des polices rouges ont été efficacement transduites par VSVΔG*-SARS2. Les barres bleues sous l'arbre indiquent les gènes négativement associés à la transduction VSVΔG*-SARS2, tandis que les barres rouges indiquent les gènes positivement associés à la transduction VSVΔG*-SARS2.

Nous avons identifié une association significative entre les niveaux d'expression de 453 gènes associés au taux de transduction de VSVΔG*-SRAS et 416 gènes associés au taux de transduction de VSVΔG*-MERS. Ces gènes sont principalement enrichis en voies métaboliques et en infection par le virus de l'herpès simplex 1, ce qui concorde avec le fait que plus de la moitié de toutes les expressions géniques étaient corrélées à la transduction VSVΔG*-SARS2 (Fig. 3B, Tableaux S6 à S11). Les gènes dont les expressions étaient associées à VSVΔG*-MERS présentaient un profil similaire à VSVΔG*-SARS2 dans l'enrichissement des processus biologiques, en particulier dans la régulation de la transcription basée sur l'ADN et la régulation de la transcription du promoteur de l'ARN polymérase II. Cependant, le processus biologique le plus riche en gènes dont les expressions étaient associées à la transduction VSVΔG*-SARS était la protéolyse (p = 7,7 × 10−4, test exact de Fisher) (Tableau S8), soulignant que les protéases des cellules hôtes sont essentielles pour l'infectivité du virus pseudotypé SARS-CoV [79]. De plus, une étude récente suggère que les protéases sont au cœur du processus d'infection du SRAS-CoV-2, et que les médicaments ciblant les protéases peuvent entraîner une réduction dose-dépendante des titres de SRAS-CoV-2 [80]. Cela suggère que les protéases pourraient être une cible commune pour le traitement des maladies de type SRAS. Cependant, les expressions des récepteurs reconnus (ACE2 et DPP4) du SRAS-CoV et du MERS-CoV n'étaient pas significativement corrélées aux taux de transduction. Compte tenu de ce résultat, nous avons examiné les rôles potentiels de ces gènes apparentés. Plusieurs réponses géniques ont été trouvées (par exemple, HSD17B2, IGLL1) dans l'infection par le SRAS-CoV-2 [81, 82], alors que le rôle des gènes les mieux classés associés à la transduction VSVΔG*-SARS était plus limité.

Nous avons compilé une liste de 95 gènes couramment associés aux taux de transduction des virus pseudotypés SARS-CoV, MERS-CoV et SARS-CoV-2 (Fig. 3D, Tableau S12). Cette liste comprenait non seulement les gènes mentionnés ci-dessus, mais également des gènes tels que APOBEC3B, MYO5B et HPN (hepsine), qui peuvent être impliqués dans les interactions virus-hôte du SRAS-CoV-2. Par exemple, APOBEC3B, qui appartient à une famille de protéines chez les mammifères, est constitué de cytosine désaminases cellulaires et sert de barrière qui empêche potentiellement la transmission inter-espèces des lentivirus [83]. De plus, APOBEC3 peut constamment façonner le génome du SRAS-CoV-2 en modifiant la cytidine en uridine [84]. En revanche, MYO5B est régulé à la baisse dans un modèle de dégranulation des mastocytes induit par Spike-RBD et joue un rôle dans le transport endosomal [85]. MYO5B interagit également avec les protéines virales. Une étude précédente suggère que l'inhibition des protéines MYO5 pourrait être une cible efficace pour le traitement du COVID-19 [85]. Ces résultats impliquent largement ces gènes communs dans l'entrée et la réplication virales, et par conséquent, ils restent des cibles appropriées pour une évaluation plus approfondie des risques de transmission inter-espèces.

Ici, nous avons démontré que le SRAS-CoV-2, le SRAS-CoV et le MERS-CoV peuvent infecter les cellules de dizaines d'espèces de mammifères, indiquant qu'il s'agit de virus généralistes et non spécifiquement adaptés à l'homme. De plus, les cultures cellulaires de différents mammifères montrent des sensibilités variables aux virus pseudotypés SARS-CoV-2, SARS-CoV et MERS-CoV. Cela implique que le SRAS-CoV-2 a la capacité de se propager à plusieurs espèces et d'établir des réservoirs naturels après des changements évolutifs adaptatifs mineurs ou majeurs. Nos résultats ont mis en évidence le potentiel des chauves-souris fer à cheval de Thomas, des chauves-souris fer à cheval royales, des singes verts et des furets à servir d'hôtes réservoirs pour ces coronavirus. En particulier, les cultures de cellules primaires dérivées de la chauve-souris en fer à cheval de Thomas et de la chauve-souris en fer à cheval royale se sont révélées plus sensibles au VSVΔG*-SARS2 que les lignées cellulaires humaines. Ceci est important, car les chauves-souris en fer à cheval (Rhinolophidae) sont considérées comme un réservoir pour de nombreux virus zoonotiques et sont supposées être généralement tolérantes à l'infection. Cependant, de très rares sarbecovirus ont été signalés à la fois chez les rhinolophes de Thomas et les rhinolophes royaux, mais pas chez les autres rhinolophes (par exemple, les rhinolophes chinois) [86]. Cela soulève non seulement la crainte que le SRAS-CoV-2 ne se propage des humains à ces deux espèces de chauves-souris, mais donne également la priorité à la surveillance de l'intolérance au virus chez les chauves-souris en fer à cheval.

Étant donné que l'ACE2 s'est avéré être le récepteur fonctionnel de la protéine de pointe du SRAS-CoV et du SRAS-CoV-2, des études pionnières ont prédit la sensibilité de diverses espèces animales au SRAS-CoV-2 en utilisant les séquences ACE2 et/ou leur affinité de liaison aux protéines de pointe [15, 87, 88]. Bien que notre test expérimental ait validé la sensibilité de plusieurs espèces (par exemple, le macaque rhésus et le hamster doré) au SRAS-CoV-2, il existe une incohérence considérable entre les prédictions in silico et nos tests cellulaires. Par exemple, on prévoyait que la musaraigne chinoise et le furet présenteraient un risque faible ou nul d'infection par le SRAS-CoV-2 [15], peut-être en raison du fait que leurs séquences ACE2 divergeaient de l'ACE2 humain. Cependant, nos expériences ont indiqué que les deux espèces sont de sensibilité moyenne. De même, on prévoit généralement que les chauves-souris présentent un faible risque d'infection, mais nos résultats suggèrent que plusieurs espèces de chauves-souris sont susceptibles d'être fortement infectées. Ainsi, les études qui examinent expérimentalement la sensibilité aux infections sont extrêmement précieuses pour la comparaison avec les futures prédictions in silico. De plus, comme indiqué dans le tableau S2, 75 % des sensibilités in vitro présentées dans notre étude ont été étayées par des tests d'inoculation in vivo. Des différences entre les tests in vitro et in vivo ont été observées chez la souris, le renard roux et la vache. Par exemple, le test d'inoculation a suggéré que les souris sont résistantes à l'infection par le SRAS-CoV-2, mais notre étude a révélé que leurs cultures cellulaires affichent des taux de transduction modérés. Cela peut être dû au fait que les modèles cellulaires peuvent ne pas ressembler à la complexité d'un organisme entier, ou aux défis particuliers de la traduisibilité des données générées in vitro en modèles in vivo [57]. Néanmoins, les tests in vivo peuvent bénéficier des tests in vitro pour déterminer le risque de sensibilité et les hôtes naturels du SRAS-CoV-2 et d'autres sarbecovirus.

Nous avons également examiné les sensibilités de plusieurs espèces de mammifères à différentes variantes de pointes et avons constaté que chaque variante de pointe présentait un spectre d'infection distinct. En particulier, il a été démontré que plusieurs variantes de pointe (Del69-70, D80Y, S98F, T572I et Q675H) qui ne se trouvent pas dans la région RBD augmentent l'infectiosité du SRAS-CoV-2. La variante del69-70 a été initialement identifiée au début de 2020, et au cours des dernières années, elle a muté en trois variantes différentes (c'est-à-dire Y453F, S493K et N501Y) [89]. Des rapports antérieurs ont montré que del69-70 augmente le clivage de la protéine S et l'infectivité dans la variante SARS-CoV-2 B.1.1.7 [90, 91]. Cette mutation peut favoriser la propagation du SRAS-CoV-2 à d'autres animaux, comme la chauve-souris pipistrelle japonaise, qui habite les zones urbaines à forte densité de population humaine. De plus, une interaction entre les résidus ACE2 et les variantes de pointe, qui affectent potentiellement les taux d'infection, a été trouvée dans notre étude. Certains de ces résidus ACE2 sont importés pour l'interface entre le SARS-CoV RBD et ACE2. Par exemple, Lys31 et Lys353 sont des points chauds de liaison virale, qui consistent en des ponts salins entre Lys31 et Glu35 et entre Lys353 et Asp38 [92, 93]. Cependant, la plupart des variantes de pointe dans ces interactions prédites étaient situées dans le domaine N-terminal (NTD). Ainsi, les régions à l'intérieur et à l'extérieur de RBD peuvent être d'égale importance pour l'entrée virale et l'infection. Une plus grande attention devrait être accordée à ces variantes de pointe, car elles (par exemple, P26L, S254F, H146Y et A262S) constituent le « supersite des MTN », qui est reconnu par tous les anticorps neutralisants spécifiques des MTN connus [94], et pourraient donc favoriser l'évasion immunitaire.

Un examen des signaux phylogénétiques indique que le SARS-CoV présente un profil de tropisme plus similaire avec le SARS-CoV-2 qu'avec le MERS. Cela peut être dû au fait que le SARS-CoV et le SARS-CoV-2 utilisent le même récepteur. Cependant, le virus pseudotypé SARS-CoV avait une efficacité plus élevée dans la transduction de plusieurs cultures cellulaires de chiens, de porcs et de furets, ce qui suggère qu'une enquête plus approfondie pourrait découvrir des variantes de pointe et d'autres facteurs entre le SARS-CoV et le SARS-CoV-2 qui contribuent à cette différence (Fig. S4). Les analyses de régression ont indiqué que l'expression de récepteurs et de facteurs connus pour faciliter l'entrée du SRAS-CoV-2, du SRAS-CoV et du MERS-CoV n'était pas corrélée à une infection inter-espèces (Fig. S8). En particulier, les niveaux d'expression d'ACE2 (p.robust = 0,14), FURIN (p.robust = 0,89) et TMPRSS2 (p.robust = 0,11) ont montré une corrélation insignifiante avec les taux de transduction VSVΔG*-SARS2 (Figs. S9A – C ; S9D et Tableau S4, Tableau S6). En revanche, CTSL (p.robust = 7,4 × 10−3) était significativement corrélé aux taux de transduction VSVΔG*-SARS2.

Nous avons constaté que certaines lignées cellulaires exprimaient des niveaux élevés d'ACE2 (par exemple, des cellules dérivées du planeur à sucre, de la chauve-souris à moustaches népalaise et de la grande chauve-souris en fer à cheval), mais celles-ci étaient peu ou seulement légèrement transduites par VSVΔG * -SARS2 (Fig. S9A-C et tableau S1). Cependant, ceci peut ne pas nier le rôle d'ACE2 en déterminant la susceptibilité SARS-CoV-2 dans d'autres espèces parce que l'expression d'ARN ne peut pas entièrement représenter la protéine ACE2 sur la surface cellulaire. De plus, des analyses ultérieures du modèle de régression pénalisé ont révélé que les changements de séquence dans les ACE2 sont significativement corrélés aux taux de transduction entre des taxons phylogénétiquement divers (F = 15, 78, p = 8, 9 × 10-13) (Figs. S10, S11). Ceci propose que les changements des séquences ACE2 plutôt que l'expression contribuent aux différences dans la susceptibilité. Cependant, la variance totale des taux de transduction expliquée par la séquence ACE2 change d'environ 28,9 %. Par conséquent, les études futures devraient explorer d'autres facteurs intrinsèques de l'hôte associés à la susceptibilité, tels que les gènes identifiés dans cette étude dont l'expression était significativement corrélée aux taux de transduction.

Enfin, nos résultats mettent en évidence le fait que les modèles de culture cellulaire représentent une méthode importante pour comprendre la transmission inter-espèces des sarbecovirus en identifiant le spectre des hôtes mammifères sensibles au SRAS-CoV-2, au SRAS-CoV et au MERS-CoV et à leurs variantes.

Les données de séquençage de l'ARN de cette étude ont été déposées dans ScienceDB (https://doi.org/10.57760/sciencedb.j00001.00445) et dans le Genome Sequence Archive du National Genomics Data Center, China National Center for Bioinformation/Beijing Institute of Genomics, Chinese Academy of Sciences (GSA : CRA009056) et NCBI (PRJNA906190).

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Nous remercions Pengcheng Wang, Xuanjing Li, Yun Huang, Linfa Wang et Alice C. Hughes pour leur soutien à la collecte et à la préparation des échantillons. Nous remercions également Chrissie, Sara, Jenni et Dax pour leur soutien lors de la rédaction de ce manuscrit. Ce projet a été financé par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (32070528), des National Key Research and Development Projects of the Ministry of Science and Technology of China (2021YFC2301300), de la National Natural Science Foundation of China (82050002), du programme clé de l'Académie chinoise des sciences (KJZD-SW-L11) et de la Beijing Natural Sciences Foundation (JQ19022).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Meng Li, Juan Du.

Laboratoire clé d'écologie animale et de biologie de la conservation, Institut de zoologie, Académie chinoise des sciences, Pékin, 100101, Chine

Meng Li, Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Yichen Dai, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang, Gaoming Liu, Qi Pan, Xiao Wang, Pingfen Zhu et Xuming Zhou

Université de l'Académie chinoise des sciences, Pékin, 100049, Chine

Juan Du, Weiqiang Liu, Zihao Li, Fei Lv, Chunyan Hu, Xiaoxiao Zhang, Zhan Zhang et Qi Pan

École des sciences de la vie, Université des sciences et technologies de Chine, Anhui, Chine

Yu Yang

Beijing Advanced Center for Structural Biology, Beijing Frontier Innovation Center, School of Pharmaceutical Sciences, Tsinghua-Peking Center for Life Sciences, Tsinghua University, 100084, Beijing, Chine

Xu Tan

Département d'anthropologie, Programme d'écologie, d'évolution et de biologie de la conservation, Université de l'Illinois, Urbana, Illinois, États-Unis

Paul A. Garber

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XZ et ML ont conçu l'étude et conçu le projet. ML a effectué des expériences, terminé l'analyse et rédigé le manuscrit ; JD, ZL et FL ont préparé les cultures cellulaires ; WL et CH mettent en œuvre l'analyse de l'ARN, l'analyse des données et les figures structurelles générées ; GL, LW., XW, QP, XT, PAG et XZ ont discuté des résultats et révisé ce manuscrit ; Tous les auteurs ont contribué à l'interprétation des données.

Correspondance avec Xuming Zhou.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Li, M., Du, J., Liu, W. et al. Sensibilité comparative du SRAS-CoV-2, du SRAS-CoV et du MERS-CoV chez les mammifères. ISME J 17, 549–560 (2023). https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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Reçu : 15 août 2022

Révisé : 10 janvier 2023

Accepté : 12 janvier 2023

Publié: 23 janvier 2023

Date d'émission : avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41396-023-01368-2

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