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Oct 16, 2023

Un génome

Nature Genetics volume 55,

Nature Genetics volume 55, pages 54–65 (2023)Citer cet article

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L'identification des gènes et des processus médiateurs des signaux d'association génétique pour les maladies complexes représente un défi majeur. Comme de nombreux signaux génétiques du diabète de type 2 (T2D) exercent leurs effets par le dysfonctionnement des cellules des îlots pancréatiques, nous avons effectué un dépistage de perte de fonction CRISPR regroupé à l'échelle du génome dans une lignée de cellules bêta pancréatiques humaines. Nous avons évalué la régulation de la teneur en insuline en tant que lecture pertinente de la fonction des cellules bêta et identifié 580 gènes influençant ce phénotype. L'intégration avec les données génétiques et génomiques a fourni un support expérimental pour 20 transcrits effecteurs candidats du DT2, y compris le récepteur de l'autophagie CALCOCO2. La perte de CALCOCO2 était associée à des mitochondries déformées, à moins de granules immatures contenant de la proinsuline et à une accumulation d'autophagosomes lors de l'inhibition de l'autophagie à un stade avancé. Les porteurs de variants associés au DT2 au locus CALCOCO2 présentaient en outre une sécrétion d'insuline altérée. Notre étude met en évidence la façon dont les écrans cellulaires peuvent augmenter les efforts multi-omiques existants pour soutenir la compréhension mécaniste et fournir des preuves d'effets de causalité au niveau des locus d'études d'association à l'échelle du génome.

Les études d'association à l'échelle du génome (GWAS) ont fourni des milliers d'associations robustes pour le diabète de type 2 (DT2) et les traits associés, mais la plupart correspondent à des régions non codantes avec une fonction régulatrice probable1. Une cartographie fine incomplète signifie que la plupart des loci GWAS ne sont pas cartographiés sur une seule variante causale, mais plutôt sur plusieurs variantes dans un ensemble crédible, chacune pouvant potentiellement influencer l'expression des gènes dans un contexte cellulaire différent. L'étape typique après la cartographie fine consiste à connecter les variantes présumées causales et les éléments régulateurs aux gènes qu'ils régulent, en utilisant des méthodes telles que la colocalisation des locus de traits quantitatifs d'expression cis (eQTL), la co-accessibilité de la chromatine unicellulaire et les tests de proximité de l'ADN2,3,4,5. Les limites de ces approches sont leur dépendance au type de cellule et au contexte (les essais effectués dans des types ou états cellulaires inappropriés peuvent révéler des connexions variant-à-gène non liées à la pathogenèse de la maladie) et la pléiotropie moléculaire (des variants d'intérêt peuvent réguler la transcription de plusieurs gènes en cis, obscurcissant l'identité du transcrit causal). Ces approches peuvent générer des hypothèses sur les effecteurs candidats, mais ne fournissent généralement pas de preuves définitives.

Les études de perturbation peuvent fournir des preuves plus convaincantes de la causalité, mais uniquement si elles utilisent des modèles authentiques et des phénotypes pertinents pour la maladie6. Les preuves les plus solides proviennent des variantes de codage associées à la maladie qui fournissent une lecture des conséquences des perturbations de la fonction des gènes et des protéines chez l'homme, mais la faible fréquence de la plupart de ces variantes limite cette approche2. Les modèles cellulaires humains et les technologies basées sur CRISPR offrent une alternative intéressante pour générer des profils à l'échelle du génome des conséquences phénotypiques de la perturbation des gènes et comprendre la biologie de la maladie6. Au centre de cette aspiration se trouve la confiance dans la pertinence d'un type de cellule pour la maladie. Pour le DT2, les preuves physiologiques et épigénomiques mettent en évidence le rôle central des îlots pancréatiques, et par conséquent des cellules bêta productrices d'insuline, dans la médiation du risque de maladie3,4,5,6,7. Des différences substantielles entre les îlots ou les cellules bêta des rongeurs et des humains plaident en faveur de l'utilisation de tissus humains et de lignées cellulaires8,9,10,11,12,13. Nous et d'autres avons généré d'importantes ressources transcriptomiques et épigénomiques dans ce tissu humain clé permettant l'intégration à l'échelle du génome des données génétiques et génomiques pour identifier les transcrits effecteurs candidats aux locus T2D GWAS4,7,14,15. Nous complétons maintenant ces ressources avec un écran de perte de fonction CRISPR (LoF) à l'échelle du génome dans la lignée de cellules bêta pancréatiques humaines bien caractérisée EndoC-βH1 pour identifier les gènes qui régulent la teneur en insuline16,17,18. La lignée cellulaire EndoC-βH1 immortalisée affiche une signature multi-omique similaire aux cellules bêta humaines primaires, mais avec des caractéristiques distinctes mettant en évidence l'origine fœtale et transformée de la lignée cellulaire18,19. Alors que la teneur en insuline est inférieure à celle des îlots primaires, les cellules EndoC-βH1 présentent des propriétés électrophysiologiques et sécrétoires similaires, ce qui en fait un modèle physiologiquement pertinent pour étudier la fonction des cellules bêta in vitro17,20,21,22.

Cet écran CRISPR à l'échelle du génome dans une lignée de cellules bêta humaines fournit des preuves cellulaires de 580 gènes en tant que régulateurs de la fonction des cellules bêta, soutient un rôle causal pertinent et probablement causal de 20 gènes aux locus T2D et identifie le récepteur d'autophagie CALCOCO2 comme un régulateur de la fonction des cellules bêta humaines. Nous démontrons que les porteurs d'allèles à risque de diabète dans CALCOCO2 ont une sécrétion d'insuline altérée et que la perte de CALCOCO2 dans les cellules bêta humaines entraîne une altération de l'homéostasie des granules d'insuline médiée par l'autophagie.

La sécrétion d'insuline stimulée par le glucose est la principale mesure de la fonction des cellules bêta, mais une lecture phénotypique inappropriée pour le dépistage groupé à haut débit, car l'insuline sécrétée ne peut pas être liée à sa source cellulaire. Contrairement à la sécrétion d'insuline, la teneur en insuline intracellulaire peut cependant être quantifiée à l'aide du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS). Des modifications de la teneur en insuline ont également été associées à des gènes à risque associés au DT2, comme au locus peptidylglycine α-amidating monooxygénase (PAM) où les allèles à risque de DT2 entraînent une expression et/ou une fonction réduites et une expression réduite de PAM est associée à une teneur réduite en insuline ou pour le TCF7L2, le locus médiant le risque le plus élevé de DT2 et un régulateur principal de la production d'insuline avec une diminution de la teneur en insuline chez les porteurs de l'allèle à risque23,24,25 .

À l'aide d'une lecture FACS, nous avons conçu un pipeline de criblage CRISPR LoF regroupé dans la lignée de cellules bêta pancréatiques humaines EndoC-βH1 basé sur l'introduction de knock-outs monogéniques (KO) via une bibliothèque CRISPR à l'échelle du génome lentiviral (Fig. 1a). Les cellules ont été triées en populations contenant des niveaux faibles ou élevés d'insuline intracellulaire, et des sgARN intégrés de manière stable ont été identifiés par séquençage de nouvelle génération.

a, Pipeline pour un écran CRISPR LoF à l'échelle du génome dans EndoC-βH1 de la transduction virale (à gauche) à la sélection d'antibiotiques (au milieu) et une sélection finale FACS suivie d'un séquençage et d'une analyse d'enrichissement des sgARN intégrés (à droite). b, c, coloration FACS pour l'insuline intracellulaire dans EndoC-βH1 silencieux INS (siINS, bleu) ou leurs contrôles respectifs non ciblant (siNT, rose) en tant que parcelles individuelles (b) ou superposition d'histogramme (c). d, e, L'expression d'ARNm associée de l'INS (d) et les niveaux correspondants d'insuline intracellulaire tels que mesurés par alphaLISA (e). f, g, coloration FACS utilisant l'anticorps anti-insuline (bleu) ou le contrôle isotypique (rose) dans la lignée de cellules rénales embryonnaires humaines HEK293T sous forme de parcelles individuelles (f) ou de superposition d'histogramme (g). h, Pipeline pour un écran CRISPR à petite échelle dans EndoC-βH1 ciblant seulement trois gènes (NMS, INS et PAM) aux côtés des cellules témoins EV. Les portes de tri FACS pour une faible insuline (ligne pointillée) ont été déterminées sur la base de cellules témoins transduites en parallèle. L'enrichissement en sgRNA a été évalué dans INSlow par rapport à INShigh. i, j, coloration FACS dans EndoC-βH1 comparant la coloration à l'insuline des cellules témoins EV (rose) et des cellules de l'écran CRISPR à petite échelle (bleu) en tant que parcelles individuelles (i) ou superposition (j). Les cases respectives indiquent les portes de tri INSlow et INShigh. k, enrichissement en ARNsg pour tous les ARNsg individuels dans INSlow par rapport à INShigh à partir d'échantillons témoins (gris) et de témoins positifs (INS et PAM, violet et rose). La boîte à moustaches couvre les valeurs minimales à maximales, tandis que la ligne centrale représente la médiane. Toutes les données sont moyennes ± sem de deux (i – k) ou trois expériences indépendantes et des parcelles FACS représentatives sont présentées avec leur efficacité de silence respective. Les données ont été analysées par le test t à deux échantillons (e). Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. NT, sans ciblage. log2(FC), log2(changement de pli); EV, vecteur vide ; SSC-A, zone de diffusion latérale.

Pour nous assurer que la lecture de la teneur en insuline basée sur FACS dans EndoC-βH1 était hautement spécifique et sensible, nous avons choisi un anticorps et un protocole basés sur la comparaison de plusieurs stratégies complémentaires (Extended Data Fig. 1). L'inactivation presque complète de l'INS à base de siRNA dans EndoC-βH1 a donné lieu à deux populations avec des intensités de fluorescence moyennes distinctes, validant la sensibilité (Fig. 1b – d). Le niveau de séparation était en concordance avec une quantification alphaLISA indépendante de la teneur en insuline démontrant environ 46 % de protéines résiduelles (Fig. 1e). La spécificité de l'anticorps a été confirmée dans la lignée cellulaire humaine HEK293T n'exprimant pas l'INS (Fig. 1f, g). Enfin, le protocole de criblage a été validé en ciblant trois gènes dans un crible à petite échelle comprenant les gènes témoins positifs INS et PAM, connus pour induire une réduction de la teneur en insuline lors de la suppression, et NMS, un contrôle négatif non exprimé dans EndoC-βH1 (réf. 23) (Fig. 1h). Par rapport à un contrôle de vecteur vide (EV) codant uniquement pour Cas9, les cellules ont démontré un signal INS FACS réduit et un enrichissement des sgRNA INS et PAM au sein de la population INSlow, alors que les sgRNA ciblant NMS n'ont montré aucune différence (Fig. 1i – k). Conformément à son effet plus faible sur la teneur en insuline précédemment démontré, les sgRNA ciblant PAM ont démontré un enrichissement hautement réplicable mais inférieur par rapport aux sgRNA ciblant INS, confirmant la pertinence du pipeline pour le dépistage à l'échelle du génome23.

Nous avons effectué deux répétitions indépendantes de criblage à l'échelle du génome dans la lignée de cellules bêta humaines EndoC-βH1, en utilisant la bibliothèque CRISPR Toronto KnockOut version 3.0 (TKOv3) ciblant 18053 gènes humains codant pour des protéines avec quatre sgARN par gène26. Par réplicat, un minimum de 670 millions de cellules ont été transduites de manière lentivirale à une faible multiplicité d'infection (MOI) avec une couverture d'environ 500 cellules par sgRNA (Fig. 1a). Par rapport aux témoins, les cellules de dépistage ont démontré une distribution plus large du signal d'insuline dans le FACS, en particulier vers une insuline plus faible, indiquant une teneur en insuline altérée en raison des effets médiés par CRISPR KO (Fig. 2a, b et Données étendues Fig. 2). Deux populations de cellules ont été collectées, celles à faible teneur en insuline (INSlow) et celles à forte teneur en insuline (INShigh), suivies d'une amplification et d'un séquençage d'ARNsg (Extended Data Fig. 3). Nous avons utilisé l'algorithme MAGeCK pour comparer l'abondance des ARNsg et identifier les ARNsg enrichis ou appauvris en cellules INSlow par rapport aux cellules INShigh27. Les sgARN enrichis identifient les gènes régulateurs positifs conduisant à une réduction de la teneur en insuline sur le gène KO, et les sgARN appauvris identifient les régulateurs négatifs associés à une augmentation de la teneur en insuline sur le gène KO. Pour réduire le nombre de résultats faussement positifs, les gènes n'ont été classés comme résultats de dépistage que si les sgRNA ont démontré des effets cohérents entre les répliques et ont atteint le seuil (FDR < 0,1) pour au moins deux des quatre sgRNA dans les deux répliques de dépistage indépendantes. Au total, 580 gènes remplissaient ces critères rigoureux, nous les avons considérés comme des résultats de dépistage robustes et reproductibles et les avons poursuivis pour une évaluation plus approfondie (tableau supplémentaire 1).

a, b, coloration FACS pour l'insuline intracellulaire dans EndoC-βH1 transduite avec la bibliothèque de criblage CRISPR par rapport aux cellules transduites avec le virus EV ou aux cellules colorées avec des anticorps correspondant à l'isotype présentés sous forme de parcelles individuelles (a) et de superposition d'histogramme (b). c, Changements dans le nombre de sgRNA d'un échantillon de dépistage à faible à haute teneur en insuline, chaque couleur représentant le même sgRNA sur les deux répliques d'écran pour INS et NKX2-2 (log2(FC) 1,06 et 1,21, respectivement). La ligne pointillée noire représente le nombre médian de sgRNA pour ce gène. d, distribution sgARN de log2(FC) pour tous les sgARN (bleu) par rapport aux sgARN témoins ciblant LacZ, EGFP et la luciférase (gris). La ligne noire indique les valeurs médianes pour chaque groupe. e, distribution de sgRNA de log2(FC) dans chaque réplique de dépistage avec des sgRNA spécifiques d'intérêt (quatre par gène) mis en évidence dans des couleurs individuelles par gène, tandis que la distribution globale de sgRNA est représentée en gris clair. f, Gènes individuels d'intérêt avec leurs sgRNAs respectifs par répétition, la couleur varie de non significatif (blanc) à hautement significatif (bleu foncé) en fonction du FDR représentant ainsi un enrichissement ou un épuisement significatif de sgRNA entre INSlow et INShigh. INS (+) et NMS (-) sur le panneau supérieur représentent respectivement les gènes témoins positifs et négatifs. Les données proviennent de deux répliques indépendantes de l'écran CRISPR à l'échelle du génome, et les valeurs FDR de l'écran ont été déterminées à l'aide de MAGeCK (e, f) ou d'un test t à deux échantillons (d). log2(FC), log2(changement de pli); EV, vecteur vide.

Pour évaluer la pertinence biologique de ces résultats, nous avons demandé si notre crible était capable d'identifier des gènes connus pour être impliqués dans la régulation de l'insuline et la fonction des cellules bêta. Les sgARN ciblant l'INS ont été enrichis dans la population INSlow, confirmant la sensibilité du dépistage (Fig. 2c, e, f). L'enrichissement global de l'INS était inférieur à celui des autres régulateurs connus de la sécrétion d'insuline, car seuls trois des quatre sgRNA induisaient un effet (Fig. 2c, f). D'autres régulateurs établis de la fonction des cellules bêta et des gènes impliqués dans le diabète monogénique ou le risque de DT2 ont été identifiés parmi les résultats de dépistage, tels que NKX2.2, SLC2A2, PPP1R15B et IGF2 (Fig. 2c,e,f)28,29,30,31,32,33,34,35. Les sgRNA témoins non ciblants n'ont montré aucun effet sur la teneur en insuline (Fig. 2d). En plus des régulateurs directs de la teneur en insuline, le criblage a également identifié plusieurs régulateurs généraux de la transcription et de la traduction avec des effets indirects sur le phénotype (Fig. 2f), tous classés comme gènes essentiels communs dans les cribles CRISPR avec des durées de culture plus longues36,37,38.

Nous avons ensuite examiné si les résultats du dépistage étaient enrichis pour les classifications fonctionnelles impliquées dans la régulation de la teneur en insuline. Le terme Gene Ontology (GO) et l'analyse des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) ont mis en évidence les catégories associées à la fonction de l'insuline et des cellules bêta et les catégories liées à la transcription et à la traduction compatibles avec la modification des niveaux totaux de protéines intracellulaires (Fig. 3a)39,40. L'analyse du réseau de protéines STRING a en outre souligné le rôle fondamental de l'INS dans l'écran en tant que nœud central avec plusieurs connexions indépendantes (Fig. 3b)41. Les résultats de dépistage ont été considérablement enrichis pour les réseaux de protéines partagés, offrant une confiance supplémentaire dans la sensibilité pour identifier les complexes interdépendants (Fig. 3c et Extended Data Fig. 4). De nombreux résultats sont cartographiés dans les catégories fonctionnelles de la protéolyse et de l'autophagie médiées par l'ubiquitine, la synthèse d'ATP mitochondriale, le trafic et l'exocytose des vésicules, la signalisation GPCR, le métabolisme des lipides et la voie de signalisation MAPK, tous contenant à la fois des régulateurs jusqu'alors inconnus de la teneur en insuline et ceux ayant des rôles connus dans la sécrétion d'insuline ou la fonction des cellules bêta.

a, Analyse d'enrichissement des voies évaluant les voies KEGG ou les termes GO pour les processus biologiques. Les voies sélectionnées sont affichées, classées par valeur P. b, c, analyse de la voie STRING montrant les associations protéine-protéine, y compris les interactions physiques et fonctionnelles entre l'INS et d'autres résultats de dépistage (b) et pour le dépistage des résultats regroupés en groupes fonctionnellement associés (c).

Ensuite, nous avons cherché à utiliser notre écran cellulaire comme preuve de perturbation complémentaire pour soutenir l'attribution de gènes effecteurs aux locus T2D. Nous avons appliqué trois approches complémentaires (https://t2d.hugeamp.org) qui ont été développées pour combiner les résultats d'association génétique pour le DT2 avec diverses sources de données génétiques et génomiques afin de générer des listes du ou des gènes « effecteurs » les plus susceptibles de médier les associations génétiques42,43,44,45. Les attributions de gènes effecteurs fusionnés à partir des trois méthodes ont généré une liste de 336 transcrits effecteurs candidats aux locus T2D, sans aucun candidat identifié par les trois méthodes. L'intersection de cette liste avec l'ensemble des résultats de l'écran a donné 20 gènes (tableau supplémentaire 2) pour lesquels notre écran a fourni des preuves biologiques d'un rôle dans un phénotype pertinent pour la maladie. Sur ces 20 gènes, 5 (25%) gènes sont classés comme «causaux» par la méthode de prédiction heuristique des gènes effecteurs avec 4 autres gènes (20%) attribués entre fort, modéré et possible.

Pour comparer les performances de notre criblage de perturbations par rapport à d'autres approches couramment appliquées pour la hiérarchisation des transcriptions effectrices, nous avons exploré une étude eQTL relativement modeste, bien que la plus importante à ce jour, de 420 donneurs d'îlots humains15. Dans cette étude, la colocalisation entre les signaux T2D GWAS et cis-eQTL des îlots a été prise en charge par deux méthodes à 20 loci, passant à 39 lorsque la prise en charge statistique de la colocalisation était requise à partir d'une seule des approches. Alors que les deux approches (écran CRISPR et eQTL) ont identifié des nombres similaires de gènes, aucun gène n'était commun entre eux, ce qui suggère que les eQTL des îlots sont peu susceptibles de provoquer une réduction de la teneur en insuline et que des phénotypes cellulaires supplémentaires (par exemple la sécrétion d'insuline) peuvent sous-tendre leur effet. Ces observations soutiennent l'inclusion de plusieurs approches pour une hiérarchisation optimale des gènes effecteurs et encouragent à la fois des études eQTL plus importantes pour détecter d'autres signaux et une expansion des écrans ciblés et/ou à l'échelle du génome pour des phénotypes cellulaires supplémentaires dans les types de cellules pertinents.

Nous avons concentré nos études de suivi sur l'un des 20 gènes effecteurs prédits et le dépistage a frappé CALCOCO2 car son rôle dans les cellules bêta humaines n'a pas été exploré (Fig. 4a) 14, 46, 47, 48, 49. CALCOCO2 joue un rôle crucial dans l'autophagie sélective en reliant la cible de dégradation à la machinerie autophagique50,51. Jusqu'à présent, il a été démontré qu'il initie l'autophagie pour les agents pathogènes envahisseurs (xénophagie) et les mitochondries endommagées (mitophagie)50,51,52. CALCOCO2 correspond à un locus GWAS T2D généralement nommé d'après le gène TTLL6, où une cartographie fine a résolu le signal dans une région d'environ 177 kb contenant plusieurs gènes et 118 variantes dans l'ensemble crédible5. Un signal variant de codage indépendant dans CALCOCO2 (rs10278, p.Pro347Ala) suggère que CALCOCO2 mérite une attention particulière en tant que transcrit effecteur5. Le regroupement physiologique a révélé que ce locus est susceptible d'exercer son effet principal sur le risque de maladie par la modulation de la fonction des cellules bêta5. Dans cet écran CRISPR, KO de CALCOCO2 a entraîné une diminution de la teneur en insuline (Fig. 4b). Aucun des autres gènes de ce locus n'a montré d'effet sur la teneur en insuline dans le dépistage, ce qui confirme davantage CALCOCO2 en tant que transcrit effecteur probable (Extended Data Fig. 5).

a, approche de priorisation des gènes évaluant les gènes avec peu de preuves en tant que transcrits effecteurs du DT2 (comme indiqué dans l'approche d'intégration) qui ont également été identifiés comme un résultat de dépistage, a souligné CALCOCO2. b, Changements dans le nombre de sgRNA d'un échantillon à faible à haute teneur en insuline, chaque couleur représentant le même sgRNA sur les deux répliques d'écran. La ligne pointillée noire représente le nombre médian de sgRNA pour ce gène (log2(FC) : 1,08). c – n, toutes les données proviennent d'EndoC-βH1 traité par siCALCOCO2 par rapport à des cellules témoins non ciblées. c, expression de l'ARNm de CALCOCO2 (P = 0,0002). d, Niveau de protéines de CALCOCO2 et son contrôle de charge GAPDH. e, Quantification des données de Western blot CALCOCO2, normalisées aux cellules témoins GAPDH et siNT (P = 0,0008). f, mesures du nombre de cellules. g, Teneur en insuline en pg pour 20 000 cellules, mesurée par alphaLISA (P = 0,0166). h, Niveau protéique de l'insuline et contrôle de sa charge GAPDH. L'anticorps détecte également les précurseurs de l'insuline mais ne donne qu'un signal faible par rapport à l'insuline mature. i, Quantification des données d'insuline et de western blot normalisées par rapport aux cellules témoins GAPDH et siNT (P = 0, 0015). j, expression de l'ARNm de l'INS. k,m, Sécrétion d'insuline normalisée à siNT (k ; P = 0,0051, 0,0336, 0,0282 et 0,0152) ou à la teneur en insuline et siNT (m) dans 1 mM, 20 mM, 1 mM + 100 μM de tolbutamide ou 20 mM de glucose + 100 μM de diazoxide. l,n, Changement du facteur de sécrétion d'insuline de 1 à 20 mM de glucose normalisé à siNT (l) ou à la teneur en insuline et siNT (n). Le niveau de protéines est affiché en pourcentage de siNT, qui est mis en évidence par une ligne pointillée à 100 %. Toutes les données sont des moyennes ± sem de trois (c,e,i,j,m,n), quatre (f), six (k,l) ou 12 (g) expériences indépendantes. Les données ont été analysées à l'aide du test t à deux échantillons (c), du test t à un échantillon (e,i,), de l'ANOVA unidirectionnelle (f,g,j,l,n) ou bidirectionnelle (k,m) avec le test de comparaison multiple de Sidak. Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001. FC, changement de pli ; NT, sans ciblage.

Données source

Nous avons obtenu une confirmation indépendante de l'effet de la perte de CALCOCO2 par knockdown à base d'ARNsi dans EndoC-βH1. Le silence de CALCOCO2 a été très efficace et a induit une réduction moyenne de l'ARNm et des protéines de 78, 1% et 80, 0% (Fig. 4c – e et Extended Data Fig. 7). La viabilité cellulaire n'a pas été affectée (Fig. 4f). La teneur en insuline intracellulaire a été évaluée à l'aide de deux méthodes de détection indépendantes basées sur les anticorps. Soulignant la sensibilité de l'écran CRISPR, la teneur en insuline a été significativement réduite dans les cellules silencieuses par CALCOCO2 de 24, 0% et 38, 0%, mesurées respectivement par alphaLISA et western blot (Fig. 4g – i). Cet effet pourrait être sauvé lors de la surexpression de CALCOCO2 hébergeant des mutations silencieuses pour empêcher l'extinction des siARN (Extended Data Fig. 5). La réduction de la teneur en insuline n'était pas due à une diminution de l'expression du gène de l'insuline (Fig. 4j).

Pour confirmer que ce dépistage a correctement identifié les gènes associés au DT2 modulant la fonction des cellules bêta, nous avons examiné des gènes supplémentaires prédits comme étant responsables du DT2 qui n'ont pas été identifiés comme résultats de dépistage (Extended Data Fig. 6)43. QSER1 et PLCB3 contiennent des variantes de codage compatibles avec un rôle causal dans le DT2 mais avec un mécanisme d'effet ou un tissu d'action non résolu5,53. Conformément à nos résultats de dépistage négatifs, l'inactivation de l'ARNsi de l'un ou l'autre des gènes n'a pas affecté la teneur en insuline intracellulaire ni la sécrétion d'insuline. Ensemble, cet écran CRISPR à l'échelle du génome a pu identifier une fonction régulatrice de l'insuline de CALCOCO2 tout en distinguant d'autres phénotypes probablement liés au développement des cellules des îlots (QSER1) ou à l'action de l'insuline (PLCB3).

Bien que nous ayons montré que la teneur en insuline est réduite lors de la perte de CALCOCO2, une altération de la sécrétion d'insuline stimulée par le glucose ne peut être conclue sur la base des modifications de la teneur en insuline. Nous avons donc évalué de manière indépendante les effets du knockdown de CALCOCO2 sur la sécrétion d'insuline. En moyenne, la sécrétion d'insuline a été significativement réduite de 39,3 % lors de l'extinction de CALCOCO2 (Fig. 4k). L'indice de stimulation du glucose d'un glucose bas à un glucose élevé était cependant inchangé, indiquant une réponse appropriée aux variations des concentrations de glucose (Fig. 4l). La normalisation à la teneur en insuline a réduit la différence entre les cellules CALCOCO2 silencieuses et les témoins à 30,2 %. Même si le niveau de sécrétion d'insuline n'a pas atteint la ligne de base lors de la normalisation, l'effet n'était pas statistiquement significatif et a mis en évidence une teneur réduite en insuline comme cause sous-jacente de la réduction de la sécrétion totale d'insuline (Fig. 4m, n).

Nous avons étendu nos études pour évaluer la fonction CALCOCO2 dans les îlots pancréatiques humains primaires. Des études d'immunofluorescence dans des coupes de pancréas humain ont confirmé l'expression et la localisation des protéines dans le cytoplasme des cellules bêta (Fig. 5a et Extended Data Fig. 7). Pour déterminer si les effets de la perte de CALCOCO2 peuvent être reproduits au-delà des modèles in vitro et des cellules bêta, nous avons effectué un knockdown de shRNA dans des îlots humains primaires. Les îlots ont été dispersés, transduits avec un shARN ciblant CALCOCO2 (shCALCOCO2) et réagrégés en pseudo-îlots (Fig. 5b). La transduction réussie des pseudo-îlots a été confirmée en évaluant la coexpression de la protéine fluorescente verte (GFP) (Fig. 5c). L'expression de CALCOCO2 était en moyenne réduite de 54, 0% par rapport au shRNA témoin non ciblé (shNT; Fig. 5d). Conformément aux résultats d'EndoC-βH1, l'insuline intracellulaire a démontré une réduction modeste mais constante de 15,7 % (Fig. 5e). Bien que la diminution de l'insuline intracellulaire dans les pseudo-îlots ait été plus faible que dans EndoC-βH1, elle a été réduite dans la même mesure à la fois dans la lignée cellulaire et dans le tissu humain primaire si elle était normalisée à l'efficacité de silence obtenue, ce qui confirme une relation entre les niveaux de CALCOCO2 et la fonction. Les pseudo-îlots, cependant, n'ont pas démontré une sécrétion d'insuline significativement affectée (Fig. 5f, g). La stimulation avec un glucose élevé et le potentialisateur de sécrétion IBMX a augmenté la sécrétion d'insuline lors de la normalisation au contenu en shCALCOCO2. Cet effet a été perdu lors de la normalisation de l'ADN génomique et reflète donc l'impact des modifications de la teneur en insuline sur la sécrétion. De même, nous avons évalué la teneur et la sécrétion de glucagon pour identifier les effets potentiels de CALCOCO2 dans les cellules alpha (Fig. 5h – j). Alors que shCALCOCO2 a montré une certaine tendance à la sécrétion de glucagon émoussée, aucune des conditions de sécrétion ou de la teneur en glucagon n'a été modifiée de manière significative. Ensemble, nos découvertes montrent que CALCOCO2 joue un rôle important dans la régulation de la teneur en insuline dans les cellules bêta humaines.

a, Coloration par immunofluorescence d'îlots humains primaires dans des coupes de pancréas. Les sections ont été doublement colorées pour INS (vert) et CALCOCO2 (rouge). Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). La barre d'échelle est de 10 μm. b – j, toutes les données proviennent de pseudo-îlots shCALCOCO2 par rapport à des pseudo-îlots de contrôle non ciblés (shNT). b, transduction et formation de pseudo-îlots à partir d'îlots humains primaires. c, pseudo-îlots shCALCOCO2 sous fond clair (en haut) et pseudo-îlots positifs à la GFP (en bas). La barre d'échelle est de 100 μm. d, expression de l'ARNm de CALCOCO2. e,h, Teneur intracellulaire en insuline (e) et en glucagon (h). f,g,i,j, Sécrétion d'insuline (f,g) ou de glucagon (i,j) normalisée au contenu (f,i) ou à l'ADN génomique (ADNg) (g,j) dans 2,8, 5,6, 16,7 ou 16,7 mM de glucose + IBMX pour la sécrétion d'insuline et 7, 1, 1 mM de glucose + ʟ-arginine ou KCl pour la sécrétion de glucagon. Toutes les données sont moyennes ± sem de deux donneurs indépendants et de trois colorations indépendantes par immunofluorescence. ʟ-Arg, ʟ-arginine; FC, changement de pli ; NT, sans ciblage.

Le mécanisme sous-jacent à la régulation par CALCOCO2 de la teneur en insuline dans les cellules bêta humaines restait cependant à explorer. Pour effectuer une évaluation impartiale des changements d'expression de l'ARNm dans EndoC-βH1 traité par siCALCOCO2, nous avons effectué un séquençage d'ARN (ARN-seq) (tableau supplémentaire 5). Seul CALCOCO2 a été identifié comme étant exprimé de manière significativement différentielle, suggérant un mécanisme principalement post-transcriptionnel sur la teneur en insuline. Bien qu'en dessous du seuil de signification, les deux gènes suivants (B4GALT5 et GCNT1) dans la liste de ceux exprimés de manière différentielle sont impliqués dans le traitement de la glycosylation/O-glycane (Extended Data Fig. 8). La glycosylation est impliquée dans la régulation de l'autophagie et, avec le rôle établi de CALCOCO2 en tant que récepteur de l'autophagie, nous avons émis l'hypothèse que l'effet de CALCOCO2 sur la teneur en insuline était médié par l'autophagie50,51,54,55,56,57.

L'immunofluorescence a été utilisée pour établir la localisation cellulaire de CALCOCO2 dans EndoC-βH1 et n'a montré aucune colocalisation avec les vésicules d'insuline (Extended Data Fig. 7). Nous avons ensuite effectué une microscopie électronique (EM) pour évaluer les changements ultrastructuraux cellulaires potentiels lors de l'extinction de CALCOCO2. Conformément à la teneur totale réduite en insuline dans les mesures groupées, la densité des vésicules d'insuline a été considérablement réduite lors de l'extinction de CALCOCO2 (Fig. 6a, b). La proportion de granules d'insuline matures a augmenté par rapport aux cellules témoins, ce qui indique qu'une réduction des granules immatures et en transition a eu un effet sur la teneur totale en insuline (Fig. 6a, c). Cela a été confirmé car la densité des granules matures n'a pas été modifiée (Fig. 6d). Les mesures regroupées ont corroboré indépendamment les données structurelles de l'EM, car la pré/proinsuline intracellulaire (appelée proinsuline) a été considérablement réduite lors de l'inactivation, un effet qui n'a pas été perdu lors de la normalisation de la teneur totale en insuline (Fig. 6e, f). Cette réduction de la proinsuline n'était probablement pas due à une altération de la maturation de l'insuline, car l'expression des gènes impliqués dans le traitement de l'insuline (PCSK1, CPE et PCSK2) était inchangée, bien que l'activité enzymatique n'ait pas été évaluée (Extended Data Fig. 8).

a–l, EndoC-βH1 traité avec siCALCOCO2 comparé à siNT. a, Images représentatives avec des granules d'insuline immatures (pointes de flèche blanches courtes), des granules matures (pointes de flèche longues blanches) et des structures vacuoliques (pointes de flèche noires/blanches). b, Quantification des granules d'insuline par micromètre carré (P = 0,0137). c, Quantification des granules d'insuline matures normalisées au nombre total de granules par cellule (P < 0,0001). d, Quantification des granules d'insuline mature normalisée au micromètre carré. e, Proinsuline (ELISA), normalisé à siNT (P = 0,0033). f, Proinsuline normalisée à l'insuline totale (ELISA) et siNT (P = 0,0081). g, Images EM représentatives avec agrandissements (en haut à droite), mitochondries (têtes de flèches blanches) et structures vacuoliques (têtes de flèches noires/blanches). h, Quantification des mitochondries altérées, normalisée au nombre total de mitochondries (P = <0,0001). i, Mesures d'ATP après incubation avec du glucose faible/élevé, avec/sans l'inducteur de mitophagie FCCP. j, Images représentatives de structures vacuolées élargies dans siCALCOCO2, mises en évidence en a et g avec des pointes de flèches noires/blanches. k, coloration représentative pour LC3 (à gauche) et INS (au milieu) traités avec de la bafilomycine A1 (BafA1) ou du DMSO. l, Grossissement supérieur des régions LC3 indiquées (boîte blanche). m–p, îlots humains primaires non diabétiques intacts. m,n, îlots porteurs (GC) et témoins (CC) pour le variant codant rs10278 (allèle protecteur G) en teneur en insuline (m) et en sécrétion d'insuline (n). P = 0,0029. o, p, îlots avec génotype indiqué au niveau du variant GWAS principal rs35895680 (allèle protecteur C) dans la teneur en insuline (o) et la sécrétion d'insuline (p). P = 0,0004. Les encadrés montrent l'intervalle interquartile entre le premier et le troisième quartile, la médiane (ligne horizontale) et les moustaches du 10e au 90e centile (m–p). Toutes les données sont des moyennes ± sem de trois (a,g,i–l) ou quatre (e,f) expériences indépendantes ; 16 (b,d), 13 (c) et 14 (h) cellules siNT et 27 (c), 40 (b,d,h) cellules siCALCOCO2 sur trois expériences indépendantes et au moins 21 donneurs (tableau supplémentaire 6 ; m–p). Les individus homozygotes pour rs10278 (GG) n'ont pas été analysés en raison de la faible taille de l'échantillon (m, n). La barre d'échelle est de 1 μm (a, g), 0,25 μm (j), 20 μm (k) et 10 μm (l). Les données ont été analysées à l'aide du test t à deux échantillons (b – d, h), du test de comparaison multiple de Sidak ANOVA à deux facteurs (i, m – p) ou du test t à un échantillon (e, f). Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. *P < 0,05, **P < 0,01, ***P < 0,001, ****P < 0,0001. NT, sans ciblage.

L'analyse EM a révélé que la structure mitochondriale était considérablement modifiée dans les cellules siCALCOCO2 avec des crêtes et une forme déformées, ce qui correspond à une séparation ou une fission mitochondriale accrue avant le ciblage par autophagie (Fig. 6g, h) 58. De manière inattendue, la production d'ATP mitochondriale n'a cependant pas été affectée lors de la stimulation avec du glucose (Fig. 6i). L'induction de la dépolarisation mitochondriale médiée par le FCCP pour induire la mitophagie a réduit la production d'ATP de manière égale dans les cellules siCALCOCO2 et témoins, indiquant une mitophagie fonctionnelle (Fig. 6i). Les niveaux d'expression des médiateurs de la mitophagie PINK1 et PARKIN (PARK2) n'ont pas été affectés (Extended Data Fig. 8). Pris ensemble, il n'y avait aucune indication que la fonction mitochondriale ou la mitophagie induite de l'extérieur ait été affectée lors de l'extinction de CALCOCO2. De plus, EndoC-βH1 réduit au silence par siCALCOCO2 a démontré une accumulation de structures vacuolisées avec de nombreux restes contenant des composants cellulaires, mettant en évidence des altérations des mécanismes basés sur la dégradation (Fig. 6j).

Nous avons ensuite évalué si cette réduction des granules immatures et de la proinsuline était médiée par un effet de CALCOCO2 sur l'autophagie. L'autophagie est très dynamique et doit être artificiellement bloquée pour mesurer avec précision l'amplitude du flux autophagique59. Nous avons incubé EndoC-βH1 avec l'inhibiteur lysosomal Bafilomycine A1 (BafA1), qui empêche la fusion autophagosome-lysosome et la dégradation lysosomale, et évalué les points lacrymaux LC3-positifs qui sont représentatifs des autophagosomes. Alors que la formation de structures positives pour LC3 a nettement augmenté dans les deux conditions, l'accumulation était plus importante dans les cellules silencieuses par CALCOCO2 (Fig. 6k, l). La colocalisation d'autophagosomes LC3-positifs avec des granules contenant de l'insuline a également soutenu une réduction des granules d'insuline médiée par l'autophagie lors de la perte de CALCOCO2 (Fig. 6k). Nous avons en outre confirmé que la réduction des granules d'insuline et de la proinsuline n'était pas médiée par le système ubiquitine-protéasome car l'inhibiteur du protéasome MG132 n'a pas restauré la teneur en proinsuline (données étendues Fig. 8).

Nos résultats indiquent que CALCOCO2 est un régulateur de l'homéostasie des granules d'insuline et médie son effet observé sur la teneur totale en insuline par le biais d'une réduction basée sur l'autophagie de la proinsuline et des granules immatures.

Après avoir identifié CALCOCO2 comme régulateur de la teneur en insuline, nous avons ensuite recherché si les porteurs d'allèles à risque de DT2 au locus CALCOCO2 présentaient des phénotypes sécrétoires similaires pour soutenir CALCOCO2 en tant que transcrit effecteur à ce locus. Nous avons évalué la teneur et la sécrétion d'insuline dans les îlots primaires intacts de donneurs d'organes non diabétiques stratifiés pour leurs génotypes à deux signaux d'association T2D indépendants au locus CALCOCO2 (tableau supplémentaire 6). Nous avons sélectionné une variante de codage causale probable (rs10278) identifiée dans une étude d'exome-array et la variante GWAS principale du grand ensemble crédible à 99 % (118 variantes) au locus associé au DT2 (rs35895680)5. Le variant rs10278 devrait entraîner une substitution de la proline par l'alanine au codon 347 dans la plupart des isoformes, y compris l'isoforme majeure dans les îlots humains (NM_005831)5. Son allèle d'effet G, qui est associé à un risque réduit de DT2, a démontré une sécrétion d'insuline stimulée par le glucose altérée mais pas une teneur en insuline altérée dans les îlots primaires (Fig. 6m, n). Le variant de plomb GWAS rs35895680 (allèle C réduit le risque) qui est en fort déséquilibre de liaison avec un variant de l'ensemble crédible situé dans le 3′-UTR de CALCOCO2 n'a pas affecté la teneur en insuline. Cependant, les îlots d'individus homozygotes pour l'allèle protecteur du DT2 ont montré une sécrétion d'insuline accrue dans des conditions de glucose élevé par rapport à ceux avec une copie (Fig. 6o, p). Collectivement, nous démontrons que les variantes de risque associées au DT2 associées à CALCOCO2 affectent la sécrétion d'insuline dans les îlots humains primaires, bien que les relations de la variante avec la teneur en insuline et la fonction CALCOCO2 restent à explorer.

Les efforts récents pour identifier les transcrits effecteurs aux signaux d'association GWAS se sont concentrés sur l'intégration d'ensembles de données transcriptomiques et épigénomiques pertinents pour la maladie ou sur des études mécanistes détaillées à un seul locus4,7,14,15,23,47,60,61,62,63,64. Les ensembles de données de perturbation à l'échelle du génome dans les types de cellules pertinentes pour la maladie pourraient combler l'écart entre le transcrit effecteur et la biologie de la maladie et permettre des efforts de traduction ciblés. Ici, nous présentons un écran CRISPR LoF regroupé à l'échelle du génome pour effectuer une caractérisation complète des régulateurs de la teneur en insuline dans la lignée de cellules bêta humaines EndoC-βH1.

Notre approche de dépistage CRISPR a réussi à identifier des modulateurs robustes de la teneur en insuline, comme le montre la détection non seulement du gène de l'insuline lui-même, mais également des gènes impliqués dans les types monogéniques de diabète ou des régulateurs connus de la transcription et de la sécrétion d'insuline. Grâce à l'intégration de nos résultats de dépistage avec des outils de priorisation, 20 gènes ont été identifiés comme transcrits effecteurs travaillant sur le dysfonctionnement des cellules bêta. Nos données s'ajoutent à un nombre croissant d'ensembles de données multi-omiques à l'échelle du génome qui peuvent être exploitées pour relier la découverte génétique et les mécanismes biologiques et servir de modèle pour de futures études cellulaires, pas seulement dans les cellules bêta humaines. De plus, nos données impartiales à l'échelle du génome seront pertinentes pour d'autres traits/maladies où la cellule bêta pancréatique joue un rôle, y compris le diabète de type 1.

Nous avons initialement identifié le gène CALCOCO2 associé au risque de DT2 comme un succès de dépistage CRISPR et un régulateur positif de la teneur en insuline. Nous avons sélectionné ce gène pour une étude plus approfondie en raison de son potentiel à sous-tendre un signal GWAS T2D et d'un manque de connaissances sur son rôle dans la biologie des cellules bêta. Nos études fonctionnelles ciblées ont confirmé son effet sur la teneur en insuline et ont montré une réduction indirecte de la sécrétion d'insuline médiée par la teneur en insuline. Nous fournissons donc des données fonctionnelles reliant CALCOCO2 à la fonction des cellules bêta, un effet probable sur la pathogenèse de la maladie et le tissu d'action, élargissant les preuves d'un rôle causal potentiel dans le risque de DT2 (discussion supplémentaire)5,53,65.

Alors que CALCOCO2 a été signalé comme un récepteur essentiel dans la mitophagie médiée par Parkin et même si nous avons observé une altération de l'ultrastructure mitochondriale, sa perte n'a pas entraîné d'altération de la fonction mitochondriale dans EndoC-βH1 ou une réduction de la clairance des mitochondries lors de l'induction artificielle de la mitophagie, pointant vers un mécanisme indépendant des mitochondries dans la régulation de la teneur en insuline par CALCOCO2. Au lieu de cela, nos résultats soutiennent un effet sur la teneur en insuline par la dégradation des granules d'insuline immatures contenant de la proinsuline. Bien que les effets de la variante de risque de codage du DT2 dans CALCOCO2 sur l'expression et la fonction restent à établir, la sécrétion réduite d'insuline observée pourrait représenter les effets à long terme de l'homéostasie altérée des granules d'insuline grâce à une expression adaptée de l'insuline et à la biogenèse des granules pour compenser les changements dans la dégradation des granules, entraînant un pool affecté de granules matures et prêts à la sécrétion.

Bien que cet écran CRISPR à l'échelle du génome ait identifié des gènes impliqués dans la fonction des cellules bêta et fournisse une ressource pour une intégration future et des études approfondies, il ne capture qu'un seul phénotype cellulaire pertinent pour la maladie dans une condition. L'écran a évalué les modifications de la teneur en insuline dans des conditions de glucose basal et, par conséquent, les gènes affectant la sécrétion d'insuline sans moduler la teneur en insuline ou les modifications du contenu intracellulaire qui ne se produisent qu'en cas de famine ou de stimulation du glucose n'ont pas été capturés.

Il s'agit d'une étape importante pour accélérer les efforts sur les écrans à l'échelle du génome, à la fois la perte et le gain de fonction dans les lignées cellulaires humaines pertinentes pour la maladie pour le DT2 et représente une preuve de concept que les écrans cellulaires peuvent augmenter les efforts génomiques reliant les variants aux éléments régulateurs et aux transcriptions pour combler le fossé entre l'expression des gènes et la biologie cellulaire pertinente pour la maladie. En résumé, nous avons développé et réalisé un criblage CRISPR regroupé à l'échelle du génome dans un modèle de cellules bêta humaines, fournissant un ensemble complet de données de perturbation pour associer les gènes d'intérêt à une direction d'effet, un tissu d'action et un mécanisme fonctionnel. Nous avons démontré avec succès comment un ensemble de perturbations à l'échelle du génome peut être utilisé comme outil de hiérarchisation des gènes causaux au niveau des loci GWAS du DT2 et mis en évidence CALCOCO2 en tant que modulateur de l'homéostasie des granules d'insuline et de la fonction des cellules bêta avec un rôle causal probable dans le DT2.

Des îlots pancréatiques humains et des tissus pancréatiques ont été isolés de donneurs décédés sous l'approbation éthique du Human Research Ethics Board de l'Université de l'Alberta (Pro00013094, Pro00001754) et obtenus auprès du NIDDK-funded Integrated Islet Distribution Program (IIDP) (RRID:SCR _014387) et du National Diabetes Research Institute (NDRI; https://ndriresource.org/). Toutes les familles des donneurs ont donné leur consentement éclairé pour l'utilisation du tissu pancréatique dans la recherche et n'ont pas été indemnisées financièrement. HEK293T et EndoC-βH1 ont été obtenus auprès de Sigma (12022001) et EndoCells, maintenant connus sous le nom de https://www.humancelldesign.com, respectivement19.

Les cellules HEK293T ont été systématiquement passées dans du DMEM 6429 (Sigma-Aldrich) contenant 10% de sérum de veau fœtal (FCS), 100 U ml-1 de pénicilline et 100 µg ml-1 de streptomycine. EndoC-βH1 ont été systématiquement passés comme décrit dans les méthodes supplémentaires. Toutes les cellules étaient exemptes de mycoplasmes (Lonza) et cultivées à 37 °C et 5 % de CO2. Si indiqué, les cellules EndoC-βH1 ont été traitées avec 10 nM BafA1, 1 μM MG132 ou DMSO pendant 7 h (toutes Sigma-Aldrich).

Des échantillons d'îlots et de pancréas humains anonymisés pour des expériences d'immunocoloration et de shRNA fonctionnel ont été obtenus auprès de quatre donneurs d'organes non diabétiques achetés par l'intermédiaire de l'IIDP et de l'Alberta Diabetes Institute Islet Core69. Des îlots humains pour les études d'allèles à risque de DT2 ont été obtenus à partir de 194 donneurs d'organes non diabétiques (hémoglobine A1C (HbA1C) < 6) isolés et évalués à l'Alberta Diabetes Institute IsletCore comme décrit précédemment et cultivés dans du DMEM avec 10 % de FCS et 100 U ml-1 pénicilline/streptomycine (tous Thermo Fisher Scientific) à 37 °C et 5 % de CO2 (réfs. 69,70). Le tissu pancréatique humain a été obtenu par l'intermédiaire du NDRI. Les détails des donneurs utilisés dans l'étude sont présentés dans les tableaux supplémentaires 3 et 6. Il n'y avait pas de différence significative d'âge, de sexe, d'IMC ou d'HbA1c entre les groupes. L'ADN a été extrait du tissu exocrine pancréatique digéré à l'aide du kit DNeasy Blood & Tissue (Qiagen) et le génotypage a été effectué sur un réseau BeadChip Infinium Omni2.5Exome-8 (Illumina).

Des sgARN CRISPR uniques ont été clonés dans plentiCRISPRv2 (Addgene, 52961) comme décrit dans les méthodes supplémentaires. En bref, des queues compatibles BsmBI ont été ajoutées à des oligonucléotides d'ARNg complémentaires et recuites (tableau supplémentaire 4). PlentiCRISPRv2 a été digéré et ligaturé avec des oligonucléotides d'ARNsg recuits, suivis d'une transformation et d'une amplification dans des cellules compétentes. L'intégration correcte du sgRNA a été validée par le séquençage de Sanger, et les plasmides ont ensuite été utilisés pour produire des lentivirus.

La bibliothèque groupée d'inactivation humaine de Toronto (TKOv3) contenant 71 090 sgARN basés sur un squelette lentiCRISPRv2 était un don de Jason Moffat, Université de Toronto (Addgene, 90294)26. La banque a été transformée et amplifiée dans Endura Competent Cells (Lucigen) comme décrit dans Supplementary Methods26. L'efficacité de la transformation a été déterminée par dilution en série pour assurer la représentation de l'ARNsg, et les plasmides ont ensuite été extraits à l'aide de kits Plasmid Mega (Qiagen). Une bibliothèque de séquençage a été préparée comme décrit ci-dessous, et la représentation de la bibliothèque a été confirmée par séquençage sur un NextSeq500 (Illumina) en utilisant des lectures d'extrémité unique de 75 pb.

Le lentivirus pour les ARNsg clonés individuellement et les bibliothèques regroupées a été produit et titré comme décrit dans les méthodes supplémentaires. En bref, les plasmides CRISPR ont été cotransfectés dans HEK293T confluent à 60% avec les vecteurs d'encapsidation pMD2.G (Addgene, 12259) et psPAX2 (Addgene, 12260) en utilisant des réactifs de transfection jetPRIME (transfection Polyplus). Le surnageant viral a été recueilli 48 h et 72 h après la transfection et concentré par ultracentrifugation. Le titre viral fonctionnel a été déterminé dans EndoC-βH1 en mesurant le pourcentage de survie après transduction avec différentes dilutions virales et sélection d'antibiotiques. La viabilité cellulaire a été évaluée à l'aide du test CyQUANT Direct Cell Proliferation (Invitrogen). La quantité requise de lentivirus pour atteindre 26 % de survie, ce qui est représentatif d'un MOI de 0,3, a été calculée et utilisée dans les transductions ultérieures à petite échelle ou à l'échelle du génome. Les cellules EndoC-βH1 ont été transduites 48 h après l'ensemencement pendant 6 h et sélectionnées pendant 7 jours dans 4 μg ml-1 de puromycine avec des changements de milieu au besoin.

Deux écrans CRISPR indépendants à l'échelle du génome ont été réalisés consécutivement dans EndoC-βH1 avec des transductions indépendantes de la bibliothèque CRISPR lentivirale, FACS et sgRNA-seq. Chaque écran a été réalisé à une couverture de 500 cellules par sgRNA et MOI de 0,3. Un total de 670 millions et 744 millions de cellules ont été transduites dans les répliques un et deux, respectivement. Les cellules ont été transduites comme décrit et incubées dans 4 μg ml-1 de puromycine pendant 7 jours avec des changements de milieu selon les besoins, suivis d'une collecte, d'une coloration et d'une analyse FACS.

Les cellules EndoC-βH1 ont été collectées et incubées avec LIVE / DEAD Fixable Far Red Dead Cell Stain (Thermo Fisher Scientific) pendant 30 min à température ambiante et lavées dans 1% de BSA dans du PBS. Les cellules ont été fixées et perméabilisées à l'aide du kit BD Cytofix/Cytoperm (BD Biosciences) pendant 20 min à 4 °C et lavées à l'aide de Perm/Wash Buffer (BD Biosciences). La coloration avec des anticorps primaires a été effectuée pendant une nuit à 4 ° C, suivie d'une incubation avec des anticorps secondaires appropriés dilués dans du tampon Perm / Wash (tableau supplémentaire 4). Après avoir testé plusieurs anticorps ciblant l'INS, un anticorps anti-INS monoclonal de lapin de Cell Signaling (3014) a été utilisé dans le criblage à l'échelle du génome. Les échantillons ont été filtrés à travers un tamis cellulaire de 70 μm et triés sur un FACSAria III (BD Biosciences) à l'aide d'une buse de 100 μm. Les contrôles d'isotype et de transduction colorés avec chaque anticorps seul ont été analysés parallèlement aux échantillons. Les échantillons ont été contrôlés sur la base de cellules vivantes et individuelles avant l'évaluation du niveau INS. Les portes pour les cellules avec un niveau d'INS réduit (INSlow) ont été définies en fonction du contrôle d'isotype et les 10 % les plus élevés de cellules exprimant l'INS ont été triés comme INShigh. Les échantillons de cellules triés ont été stockés à -80 ° C jusqu'à l'extraction de l'ADN. Les données de cytométrie en flux ont été analysées à l'aide de Flowjo 10.6 (BD Biosciences).

L'ADN a été extrait d'échantillons triés par FACS congelés à l'aide du kit QIAamp Blood Maxi/Mini (Qiagen) et traité pour le séquençage dans une approche PCR en deux étapes. Les sgARN intégrés ont été amplifiés à l'aide de la polymérase Q5 (NEB) avec un apport d'ADN de 2,5 μg par réaction et un nombre optimisé de cycles par échantillon. Des adaptateurs Illumina TruSeq spécifiques ont été attachés à chaque échantillon à l'aide de la polymérase Q5 (NEB) avec un nombre de cycles optimisé (tableau supplémentaire 4). Les produits de PCR ont été exécutés sur un gel à 2 % et purifiés à l'aide du kit d'extraction QIAquick Gel (Qiagen). Chaque échantillon de bibliothèque Illumina a été quantifié par qPCR à l'aide du kit de quantification de bibliothèque KAPA (Roche) avant le regroupement, et le séquençage multiplexé sur un NEXTSeq500 (Illumina) a été effectué en lectures de 75 pb avec une amorce de séquençage Illumina standard et PhiX à environ 20 % de pointe.

Les fichiers de lecture de séquençage fastq bruts ont été fusionnés pour chaque échantillon à l'aide de la commande 'cat'. Pour identifier les sgRNA enrichis et appauvris dans cet écran CRISPR, nous avons utilisé l'algorithme MAGeCK (v0.5.9.2)27. En bref, la commande 'count' a été utilisée pour extraire et compter les séquences de sgRNA à partir des fichiers fastq bruts en fonction de l'entrée de la bibliothèque TKOv3, ce qui a donné un nombre moyen de lectures de 981 lectures alignées par sgRNA (Extended Data Fig. 3). Les sgARN avec un faible nombre de lectures inférieur à 10 et les sgARN cartographiés sur des gènes qui n'étaient pas exprimés dans EndoC-βH1 ont été exclus. La commande « test » a été utilisée avec le module apparié pour évaluer et analyser l'enrichissement ou l'épuisement du sgRNA entre les populations INSlow et INShigh. La médiane d'analyse normalise le nombre de lectures dans les échantillons pour tenir compte de la profondeur variable du nombre de lectures et applique un modèle de variance moyenne pour identifier l'enrichissement ou l'épuisement significatif du sgRNA. Les scores d'enrichissement au niveau du sgRNA ajustés aux tests multiples de MAGeCK ont servi de base à la sélection des résultats au niveau du gène. Nous avons appliqué des critères rigoureux supplémentaires pour ne hiérarchiser que les résultats avec des effets très cohérents dans les deux répétitions nécessitant que les gènes aient un FDR <0,1 pour au moins deux des quatre sgARN dans les deux répétitions indépendantes. L'analyse d'écran CRISPR a été effectuée en Python 3.8 et R 3.5.

Les voies GO et KEGG enrichies dans les résultats de dépistage ont été déterminées à l'aide de la base de données pour l'annotation, la visualisation et la découverte intégrée 6.8 avec l'homo sapiens comme entrée de liste et d'arrière-plan39. Des réseaux de connectivité protéique basés sur des interactions physiques et fonctionnelles ont été identifiés parmi les résultats de dépistage à l'aide de STRING v11 (réf. 41). Seules les interactions avec un score de confiance élevé ≥0,9 ont été sélectionnées.

Le silençage direct basé sur les siARN dans EndoC-βH1 a été réalisé 24 h après le placage à l'aide de siARN ON-TARGET plus SMARTpool ou d'un contrôle non ciblant (Dharmacon; Tableau supplémentaire 4) à une concentration finale de 15 nM. Les siARN ont été pré-incubés avec 0, 4% de Lipofectamine RNAiMAX (Invitrogen) dans un milieu sans sérum réduit Opti-MEM (Gibco) pendant 15 min à température ambiante avant l'ajout goutte à goutte à la culture. Les cellules ont été testées ou collectées 72 h après la transfection. Le silençage de CALCOCO2 dans les expériences présentées à la Fig. 6 a été réalisé à une concentration finale de 50 nM d'ARNsi et évalué après 96 h.

Des constructions lentivirales codant pour les shARN ciblant le CALCOCO2 humain ont été obtenues auprès de Dharmacon (tableau supplémentaire 4) et le virus a été produit comme décrit ci-dessus. Les îlots primaires ont été dispersés dans des cellules individuelles par digestion enzymatique (Accumax, Invitrogen) et 1 × 106 cellules ont été transduites avec 1 × 109 unités virales par 1 ml. Les cellules d'îlots transduites ont été cultivées dans des plaques de puits à fixation ultra-faible pendant 5 jours avant une analyse plus approfondie.

Des mutations silencieuses ont été introduites dans le CDS de CALCOCO2 humain sur quatre sites cibles basés sur les régions cibles de l'ARNsi ON-TARGET plus SMARTpool CALCOCO2. Des sites de restriction contenant des motifs EcoRI et BamHI et des séquences Kozak ont ​​été ajoutés aux extrémités 5 'et 3' du CDS. Le fragment de gène a été synthétisé (IDT) et cloné dans le plasmide pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP. Le plasmide vide a servi de témoin dans les expériences ultérieures. Le lentivirus a été produit comme décrit ci-dessus, et les cellules EndoC-βH1 ont été transduites à un MOI de 0,5.

L'ARN pour l'analyse de l'expression génique d'EndoC-βH1 a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Invitrogen) et synthétisé en ADN complémentaire à l'aide du système GoScript Reverse Transcriptase (Promega). L'ARN pour l'analyse de l'expression génique à partir de pseudo-îlots humains primaires a été extrait à l'aide du kit d'isolement d'ARN PicoPure (Life Technologies), et l'ADNc a été synthétisé à l'aide du kit de synthèse d'ADNc du premier brin Maxima (Thermo Fisher Scientific), conformément aux instructions du fabricant. La qPCR quantitative (qPCR) a été réalisée à l'aide des tests de PCR en temps réel TaqMan sur un système de PCR en temps réel rapide 7900HT (tous Applied Biosystems, tableau supplémentaire 4). Les valeurs Ct ont été analysées à l'aide de la méthode ΔΔCt, et les gènes cibles ont été normalisés à la moyenne combinée des PPIA, GAPDH et TBP. L'expression de CALCOCO2 dans EndoC-βH1 et les îlots primaires a été extraite de données d'ARN-seq précédemment publiées et analysées71,72.

L'ARN-seq a été réalisé à l'aide de la capture PolyA avec une moyenne de> 20 millions de lectures appariées sur un NEXTSeq500 (Illumina). Les fichiers Fastq ont été alignés sur la référence du génome humain (GRCh38) à l'aide de STAR v2.7.9a (Spliced ​​Transcripts Alignment to Reference) avec les annotations du gène ENSEMBL (v101). Les niveaux d'expression génique ont été comptés à l'aide de featureCounts (v2.0.1) sur des lectures exoniques. L'expression différentielle a été comparée à l'aide du test de Wald dans DESeq2 (v1.26.0). Les valeurs P ont été ajustées à l'aide de la méthode de Benjamini et Hochberg.

Les intégrations de sgRNA dans le criblage à petite échelle ont été quantifiées à l'aide d'une PCR quantitative à base de SYBR Green et d'une amorce ciblant les séquences de sgRNA respectives (tableau supplémentaire 4). L'ADN d'EndoC-βH1 trié par FACS a été extrait comme décrit. Chaque échantillon a été préparé à l'aide de 20 ng d'ADN total et de SYBR Green PCR Master mix (Bio-Rad), en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons ont été amplifiés et analysés comme décrit pour les expériences d'expression génique.

Les cellules EndoC-βH1 réduites au silence ont été privées de nourriture pendant une nuit à 48 h après la transfection dans un milieu de culture contenant du glucose 2, 8 M, suivie d'une incubation de 30 min dans du glucose 0 mM. La sécrétion d'insuline a été initiée par des incubations statiques dans les conditions de glucose ou de sécrétagogues indiquées pendant 1 h. Le surnageant contenant de l'insuline a été recueilli et les cellules ont été lysées dans de l'éthanol acide glacé pour libérer de l'insuline intracellulaire. L'insuline a été quantifiée à l'aide du kit Insulin (human) AlphaLISA Detection et du EnSpire Alpha Plate Reader (tous deux Perkin Elmer) basés sur des dilutions de 1:10 et 1:200 pour le surnageant et la teneur en insuline, respectivement. La proinsuline intracellulaire a été quantifiée à l'aide du kit Proinsulin ELISA (Mercodia). L'insuline sécrétée a été normalisée au niveau de la teneur en insuline intracellulaire ou du nombre de cellules, qui a été mesuré avant la lyse cellulaire à l'aide du test de prolifération cellulaire directe CyQUANT (Invitrogen).

Des groupes de 15 îlots en triple ont été pré-incubés pendant 1 h à 37 ° C dans du tampon Krebs Ringer (KRB) (NaCl 115 mM; KCl 5 mM; NaHCO3 24 mM; CaCl2 2,5 mM; MgCl2 1 mM; HEPES 10 mM (pH 7, 4); 0, 1% de BSA) avec du glucose 1 mM. Les îlots ont ensuite été incubés pendant 1 h dans 1 mM de glucose KRB suivi d'une stimulation de 1 h dans 16,7 mM de glucose KRB. Les surnageants ont été éliminés et la teneur totale en insuline a été extraite du culot d'îlots en utilisant de l'éthanol acide. Les échantillons ont été stockés à -20 ° C et dosés pour l'insuline par chimiluminescence à l'aide du STELLUX Chemi Human Insulin ELISA (Alpco).

Des lots de 25 pseudo-îlots ont été utilisés par donneur pour des tests de sécrétion in vitro dans du RPMI 1640 (Gibco) additionné de différents niveaux de glucose. Pour les tests de sécrétion d'insuline, les pseudo-îlots ont été pré-incubés pendant 1 h à 2, 8 mM de glucose, suivis d'une incubation à 2, 8, 5, 6, 16, 7 et 16, 7 mM + concentrations de glucose IBMX pendant 60 min chacun. Pour les tests de sécrétion de glucagon, les pseudo-îlots ont été incubés à des concentrations de glucose d'arginine de 7, 1, 1 mM + 10 mM pendant 60 min chacun. Les surnageants ont été collectés et les cellules ont été lysées dans de l'éthanol acide pour extraire le contenu en insuline et en glucagon. L'insuline humaine dans les surnageants et les lysats de pseudo-îlots a été quantifiée à l'aide d'un kit ELISA d'insuline humaine (Mercodia). Le glucagon humain dans les surnageants et les lysats de pseudo-îlots a été quantifié à l'aide d'un kit ELISA de glucagon humain (Mercodia). Les niveaux d'insuline et de glucagon sécrétés sont présentés sous forme de pourcentage d'ADNg, quantifiés à partir des lysats de pseudo-îlots.

EndoC-βH1 ont été incubés pendant 1 h à 37 ° C dans un tampon de dosage de la sécrétion de glucose (SAB) (NaCl 114 mM, KCl 4,7 mM, KH2PO4 1,2 mM, MgSO4 1,16 mM, NaHCO3 25,5 mM, CaCl2 2,6 mM, HEPES 20 mM (pH 7,3), 0, 2% de BSA). Après la famine, les cellules ont été stimulées pendant 40 min avec du SAB contenant du glucose 0 mM ou 20 mM additionné de DMSO ou de FCCP 10 μM et lysées dans 100 μl de tampon de dosage ATP (Biovision). La teneur en ATP dans les lysats a été mesurée à l'aide d'un dosage luminométrique suivant les instructions du fabricant (Biovision) et normalisée à la teneur totale en protéines telle que déterminée par le dosage des protéines BCA (Pierce).

Des extraits de protéines de cellules entières ont été obtenus à partir de culots cellulaires par lyse dans un tampon RIPA (50 mM Tris pH 7, 4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0, 5% désoxycholate de sodium, 0, 1% SDS) contenant un cocktail inhibiteur de protéase 1X (Roche). Les concentrations de protéines ont été quantifiées à l'aide du test de protéines DC (Bio-Rad), 10 μg de protéines totales ont été mélangées avec un tampon d'échantillon (tampon 4 × Laemmli (Bio-Rad), 10 % de β-mercaptoéthanol (Sigma-Aldrich) et bouillies pendant 10 min à 80 °C. tampon s-glycine-SDS et transféré dans un difluorure de polyvinylidène de 0,2 μm à l'aide du système de transfert turbo Trans-Blot (tous Bio-Rad). La liaison d'anticorps non spécifique a été bloquée par incubation avec 3 % de BSA dans une solution saline tamponnée au Tris contenant 0,1 % de Tween-20 (TBST) pendant 1 h à température ambiante. Les incubations d'anticorps primaires ont été effectuées à 4 ° C pendant la nuit, suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à la HRP pendant 1 h à température ambiante (tableau supplémentaire 4). Les transferts ont été imagés à l'aide du système d'imagerie ChemiDoc MP (Bio-Rad) et sondés comme décrit à l'aide d'anticorps de contrôle de chargement de taille appropriée. Le logiciel Image Lab 6.0 (Bio-Rad) a été utilisé pour quantifier les bandes de protéines et les protéines d'intérêt ont été normalisées à leur contrôle de chargement respectif sur le même transfert.

Analyse d'immunofluorescence dans le tissu pancréatique humain. Les pancréas ont été fixés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une nuit, cryo-enrobés et des coupes de 4 μm ont été préparées. Les coupes de tissus ont été trempées dans de l'eau distillée, bouillies pendant 20 min dans une solution de récupération cible (DAKO), perméabilisée pendant 10 min à température ambiante en utilisant 1% de PBS-Triton X-100 (Sigma-Aldrich) et une liaison non spécifique sur les anticorps non spécifiques à l'aide de 1% de BSA (Roche), 0,2% de lait sans matière, Triton X-1, 1% DMSI (All Fat). Les incubations d'anticorps primaires ont été effectuées pendant une nuit à 4 ° C, suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor à température ambiante pendant 1 h (tableau supplémentaire 4). Les lames ont été montées à l'aide d'un support de montage VectaShield contenant du DAPI (Vector Laboratories) et imagées sur un microscope Zeiss AxioM1 (Zeiss) à l'aide d'un objectif ×20 et ×40. Le logiciel ImageJ 1.52b a été utilisé pour préparer des images d'immunofluorescence.

Les cellules EndoC-βH1 ont été étalées dans des lames de chambre Nunc Lab-Tek II (Thermo Fisher Scientific) et fixées avec 3% de PFA-K-PIPES et 3% de PFA-Na2BO4 pendant 5 et 10 min, respectivement, suivies d'une perméabilisation avec 0, 1% Triton X-100 pendant 30 min à température ambiante (tous Sigma-Aldrich). Les cellules ont été incubées dans une solution de blocage contenant 5% de sérum d'âne (Jackson ImmunoResearch) dans du PBS pendant 30 min. Les anticorps primaires ont été dilués dans une solution de blocage et les lames incubées pendant une nuit à 4 ° C, suivies d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor et du DAPI (MP Biomedicals) à température ambiante pendant 1 h (tableau supplémentaire 4). L'imagerie a été réalisée sur un microscope confocal STELLARIS 8 (Leica Microsystems).

Les cellules EndoC-βH1 témoins et réduites au silence ont été remises en suspension dans de la gélatine à 10% dans un tampon de cacodylate de sodium 0, 1 M (pH 7, 4) à 37 ° C et laissées s'équilibrer pendant 5 min. Les cellules ont été culottées, l'excès de gélatine retiré, refroidi à 4 ° C et incubé avec du tétroxyde d'osmium froid à 1% en rotation pendant 2 h à 4 ° C. Ils ont été lavés trois fois avec de l'eau ultrafiltrée froide, colorés en bloc pendant une nuit dans de l'acétate d'uranyle à 1 % à 4 °C tout en tournant. Les échantillons ont été déshydratés dans une série de lavages à l'éthanol (30 %, 50 %, 70 % et 95 %) pendant 20 min chacun à 4 °C, équilibrés à température ambiante, lavés deux fois dans de l'éthanol à 100 % et incubés dans de l'oxyde de propylène (PO) pendant 15 min. Les échantillons ont été infiltrés avec de la résine EMbed-812 mélangée à du PO à un rapport de 1:2, 1:1 et 2:1 pendant 2 h chacun. Ils ont été incubés dans une résine 2: 1 à PO pendant une nuit en rotation à température ambiante, placés dans EMbed-812 pendant 4 h, puis dans des moules avec de la résine fraîche, suivis d'une incubation à 65 ° C pendant la nuit. Des sections de 80 nm ont été prélevées sur des grilles de Cu 100 mesh recouvertes de formvar / carbone et colorées pendant 30 s dans de l'acétate d'uranyle à 3, 5% dans de l'acétone à 50%, puis du citrate de plomb à 0, 2% pendant 3 min. L'imagerie a été réalisée à l'aide de JEM-1400 120 kV (JEOL) et les images ont été prises à l'aide d'un appareil photo numérique Gatan Orius 4k × 4k. La quantification des images a été effectuée indépendamment par trois évaluateurs en aveugle.

Les analyses statistiques ont été effectuées dans Prism 8.1 (logiciel GraphPad). Un certain nombre de répétitions biologiques indépendantes sont présentées sous forme de points de données individuels avec des nombres exacts indiqués dans les légendes des figures respectives. Les barres d'erreur représentent l'erreur standard de la moyenne. Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille de l'échantillon. Les valeurs aberrantes significatives dans les évaluations des îlots primaires des porteurs de risque de DT2 ont été exclues sur la base du test de valeur aberrante ROUT préétabli (Q = 1%). Le cas échéant, les changements de pli ont été tracés, mais une analyse statistique a été effectuée sur les valeurs transformées en log. Si nécessaire, comme pour l'analyse d'imagerie, les évaluateurs n'étaient pas informés de la répartition de l'échantillon. Les variables normalement distribuées ont été comparées entre deux groupes ou plus à l'aide du test t de Student à deux échantillons ou d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test de comparaison multiple de Sidak. Les échantillons qui ont été normalisés à leur contrôle respectif dans un seul réplicat ont été analysés à l'aide d'un test t de Student à un échantillon.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les fichiers de séquençage Fastq de l'écran CRISPR ont été déposés dans l'European Nucleotide Archive (ENA) à l'EMBL-EBI sous le numéro d'accession PRJEB44712. Les fichiers de séquençage Fastq des expériences de séquençage d'ARN pour les échantillons de siCALCOCO2 ont été déposés dans l'European Genome-phenome Archive (EGA) sous le numéro d'étude EGAS00001006127 et les données d'expression EndoC-βh1 d'une étude précédemment publiée sont accessibles sous PRJEB15283 (ENA)71. Les données sont librement téléchargeables tandis que les décomptes traités peuvent être trouvés dans l'ensemble de données supplémentaire 1. Les données ARN-seq ont été alignées sur la référence du génome humain GRCh38 (ftp://ftp.ensembl.org/pub/release-101/fasta/homo_sapiens/dna/Homo_sapiens.GRCh38.dna.primary_assembly.fa.gz) et comptées avec l'annotation du gène (ftp://ftp.ensembl. org/pub/release-101/gtf/homo_sapiens/Homo_sapiens.GRCh38.101.gtf.gz) téléchargé depuis la base de données Ensembl. Les données sources des transferts non traités et des données étendues sont accessibles en ligne. Les données sources sont fournies avec ce document.

Le code source de MAGeCK est disponible gratuitement sur http://liulab.dfci.harvard.edu/Mageck et l'analyse différentielle de l'expression génique a été réalisée à l'aide du package DESeq2 R. Le code respectif est disponible sur https://doi.org/10.5281/zenodo.7226348.

Mahajan, A. et al. L'étude génétique multi-ascendance du diabète de type 2 met en évidence le pouvoir de diverses populations pour la découverte et la traduction. Nat. Genet. 54, 560–572 (2022).

CAS Google Scholar

Krentz, NAJ & Gloyn, AL Aperçu du dysfonctionnement des cellules des îlots pancréatiques à partir de la génétique du diabète sucré de type 2. Nat. Rév. Endocrinol. 16, 202-212 (2020).

CAS Google Scholar

Dimas, AS et al. L'impact des variants de susceptibilité au diabète de type 2 sur les traits glycémiques quantitatifs révèle une hétérogénéité mécaniste. Diabète 63, 2158–2171 (2014).

CAS Google Scholar

Thurner, M. et al. L'intégration des données génomiques des îlots pancréatiques humains affine les mécanismes de régulation au niveau des loci de susceptibilité au diabète de type 2. eLife 7, e31977 (2018).

Google Scholar

Mahajan, A. et al. Affiner la précision de l'identification cible validée grâce à la cartographie fine des variantes de codage dans le diabète de type 2. Nat. Genet. 50, 559-571 (2018).

CAS Google Scholar

Udler, MS et al. Les locus génétiques du diabète de type 2 informés par des associations multi-traits indiquent les mécanismes et les sous-types de la maladie : une analyse de regroupement souple. PLoS Med. 15, e1002654 (2018).

Google Scholar

Pasquali, L. et al. Clusters d'amplificateurs d'îlots pancréatiques enrichis en variantes associées au risque de diabète de type 2. Nat. Genet. 46, 136-143 (2014).

CAS Google Scholar

Benner, C. et al. Le paysage transcriptionnel des cellules bêta de souris par rapport aux cellules bêta humaines révèle des différences notables entre les espèces dans l'expression des gènes longs non codants et codant pour les protéines. BMC Genomics 15, 620 (2014).

Google Scholar

Fiaschi-Taesch, NM et al. Atlas du cycle cellulaire moléculaire des cellules β pancréatiques humaines G1 / S. Diabète 62, 2450–2459.

CAS Google Scholar

Henquin, J.-C., Dufrane, D., Kerr-Conte, J. & Nenquin, M. Dynamique de la sécrétion d'insuline induite par le glucose dans les îlots humains normaux. Suis. J. Physiol. Métab. 309, E640–E650 (2015).

CAS Google Scholar

De Vos, A. et al. Les cellules bêta humaines et de rat diffèrent par le transporteur du glucose, mais pas par l'expression du gène de la glucokinase. J.Clin. Investir. 96, 2489-2495 (1995).

Google Scholar

Braun, M. et al. Canaux ioniques voltage-dépendants dans les cellules bêta pancréatiques humaines : caractérisation électrophysiologique et rôle dans la sécrétion d'insuline. Diabète 57, 1618–1628 (2008).

CAS Google Scholar

Rorsman, P. & Ashcroft, FM Activité électrique des cellules β pancréatiques et sécrétion d'insuline : des souris et des hommes. Physiol. Rév. 98, 117–214 (2018).

CAS Google Scholar

Varshney, A. et al. Signatures génétiques régulatrices sous-jacentes à l'expression des gènes des îlots et au diabète de type 2. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 114, 2301–2306 (2017).

CAS Google Scholar

Viñuela, A. et al. Effets des variantes génétiques sur l'expression des gènes dans les îlots pancréatiques humains et leurs implications pour le DT2. Nat. Commun. 11, 4912 (2020).

Google Scholar

Grotz, AK et al. Un pipeline d'édition du génome CRISPR/Cas9 dans la lignée cellulaire EndoC-βH1 pour étudier les gènes impliqués dans la fonction des cellules bêta. Bienvenue Open Res. 4, 150 (2019).

Google Scholar

Hastoy, B. et al. Propriétés électrophysiologiques des lignées de cellules bêta humaines EndoC-βH1 et -βH2 sont conformes aux cellules bêta humaines. Sci. Rep. 8, 16994 (2018).

Google Scholar

Lawlor, N. et al. Le profilage multiomique identifie les réseaux cis-régulateurs sous-jacents à l'identité et à la fonction des cellules β pancréatiques humaines. Cell Rep. 26, 788–801 (2019).

CAS Google Scholar

Ravassard, P. et al. Une lignée de cellules β pancréatiques humaines génétiquement modifiées présentant une sécrétion d'insuline inductible par le glucose. J.Clin. Investir. 121, 3589–3597 (2011).

CAS Google Scholar

Andersson, LE et al. Caractérisation du couplage stimulus-sécrétion dans la lignée cellulaire EndoC-βH1 β pancréatique humaine. PLoS ONE 10, e0120879 (2015).

Google Scholar

Krishnan, K., Ma, Z., Bjorklund, A. & Islam, MS Signalisation du calcium dans une lignée de cellules bêta pancréatiques humaines génétiquement modifiées. Pancréas 44, 773–777 (2015).

CAS Google Scholar

Teraoku, H. & Lenzen, S. Dynamique de la sécrétion d'insuline par les pseudo-îlots de cellules β EndoC-βH1 en réponse au glucose et à d'autres sécrétagogues nutritifs et non nutritifs. J. Diabetes Res. 2017, 2309630 (2017).

Google Scholar

Thomsen, SK et al. Les allèles à risque de diabète de type 2 dans PAM ont un impact sur la libération d'insuline par les cellules β pancréatiques humaines. Nat. Genet. 50, 1122-1131 (2018).

CAS Google Scholar

Grant, SFA et al. La variante du gène du facteur de transcription 7-like 2 (TCF7L2) confère un risque de diabète de type 2. Nat. Genet. 38, 320-323 (2006).

CAS Google Scholar

Zhou, Y. et al. TCF7L2 est un régulateur principal de la production et du traitement de l'insuline. Hum. Mol. Genet. 23, 6419–6431 (2014).

CAS Google Scholar

Hart, T. et al. Évaluation et conception d'écrans knock-out CRISPR/SpCas9 à l'échelle du génome. Gènes Génomes Genet. 7, 2719-2727 (2017).

CAS Google Scholar

Li, W. et al. MAGeCK permet une identification robuste des gènes essentiels à partir des écrans knock-out CRISPR/Cas9 à l'échelle du génome. Génome Biol. 15, 554 (2014).

Google Scholar

Sussel, L. et al. Les souris dépourvues du facteur de transcription homéodomaine Nkx2.2 souffrent de diabète en raison de l'arrêt de la différenciation des cellules bêta pancréatiques. Développement 125, 2213–2221 (1998).

CAS Google Scholar

Doyle, MJ & Sussel, L. Nkx2.2 régule la fonction des cellules bêta dans l'îlot mature. Diabète 56, 1999–2007 (2007).

CAS Google Scholar

Sansbury, FH et al. Les mutations SLC2A2 peuvent provoquer un diabète néonatal, ce qui suggère que GLUT2 pourrait jouer un rôle dans la sécrétion d'insuline humaine. Diabetologia 55, 2381–2385 (2012).

CAS Google Scholar

Abdulkarim, B. et al. Une mutation faux-sens dans PPP1R15B provoque un syndrome comprenant le diabète, une petite taille et une microcéphalie. Diabète 64, 3951–3962 (2015).

CAS Google Scholar

Modi, H. et al. L'action autocrine de l'IGF2 régule la masse et la fonction des cellules β adultes. Diabète 64, 4148–4157 (2015).

CAS Google Scholar

Casellas, A. et al. La surexpression du facteur de croissance analogue à l'insuline 2 induit un dysfonctionnement des cellules β et augmente la sensibilité des cellules bêta aux dommages. J. Biol. Chim. 290, 16772–16785 (2015).

CAS Google Scholar

Mercader, JM et al. Une variante d'accepteur d'épissage avec perte de fonction dans l'IGF2 protège du diabète de type 2. Diabète 66, 2903–2914 (2017).

CAS Google Scholar

Flannick, J. et al. Séquençage de l'exome de 20 791 cas de diabète de type 2 et 24 440 témoins. Nature 570, 71–76 (2019).

CAS Google Scholar

Tsherniak, A. et al. Définir une carte de dépendance au cancer. Cellule 170, 564–576 (2017).

CAS Google Scholar

Behan, FM et al. Priorisation des cibles thérapeutiques anticancéreuses à l'aide des écrans CRISPR-Cas9. Nature 568, 511–516 (2019).

CAS Google Scholar

Dempster, JM et al. Accord entre deux grands ensembles de données sur la dépendance génique pancancer CRISPR-Cas9. Nat. Commun. 10, 5817 (2019).

CAS Google Scholar

Huang, DW, Sherman, BT & Lempicki, RA Analyse systématique et intégrative de grandes listes de gènes à l'aide des ressources bioinformatiques DAVID. Nat. Protocole 4, 44–57 (2009).

CAS Google Scholar

Ogata, H. et al. KEGG : encyclopédie kyoto des gènes et des génomes. Nucleic Acids Res. 27, 29-34 (1999).

CAS Google Scholar

Szklarczyk, D. et al. STRING v11 : réseaux d'association protéine-protéine avec une couverture accrue, soutenant la découverte fonctionnelle dans des ensembles de données expérimentaux à l'échelle du génome. Nucleic Acids Res. 47, D607–D613 (2019).

CAS Google Scholar

Forgetta, V. et al. Un indice effecteur pour prédire les gènes cibles aux locus GWAS. Hum. Genet. 141, 1431-1447 (2022).

CAS Google Scholar

Portail de connaissances sur le diabète de type 2. Prédictions organisées du gène effecteur du DT2. https://t2d.hugeamp.org/method.html?trait=t2d&dataset=mccarthy (2019).

Portail de connaissances sur le diabète de type 2. Prédictions de classificateur intégré. https://t2d.hugeamp.org/method.html?trait=t2d&dataset=manningexp (2020).

Portail de connaissances sur le diabète de type 2. Programme de partenariat pour l'accélération des médicaments—diabète de type 2. https://t2d.hugeamp.org/news.html (2020).

Greenwald, WW et al. L'accessibilité et la conformation de la chromatine des îlots pancréatiques révèlent des réseaux d'amplificateurs distaux du risque de diabète de type 2. Nat. Commun. 10, 2078 (2019).

Google Scholar

van de Bunt, M. et al. Les données d'expression de la transcription des îlots humains relient les signaux régulateurs des études d'association à l'échelle du génome pour le diabète de type 2 et les traits glycémiques à leurs effecteurs en aval. PLoS Genet. 11, e1005694 (2015).

Google Scholar

Dupuis, J., Langenberg, C., Prokopenko, I., Saxena, R. & Soranzo, N. Nouveaux locus génétiques impliqués dans l'homéostasie du glucose à jeun et leur impact sur le risque de diabète de type 2. Nat. Genet. 42, 408 (2010).

Google Scholar

Ingelsson, E. et al. Une caractérisation physiologique détaillée révèle divers mécanismes pour de nouveaux locus génétiques régulant le métabolisme du glucose et de l'insuline chez l'homme. Diabète 59, 1266–1275 (2010).

CAS Google Scholar

Xie, X. et al. Base moléculaire de la reconnaissance de l'ubiquitine par le récepteur de l'autophagie CALCOCO2. Autophagie 11, 1775–1789 (2015).

CAS Google Scholar

Boyle, KB, Ravenhill, BJ & Randow, F. CALCOCO2/NDP52 initie une autophagie sélective par le recrutement de complexes de kinases ULK et TBK1. Autophagie 15, 1655–1656 (2019).

CAS Google Scholar

Furuya, N. et al. NDP52 interagit avec l'ARN poly(A) polymérase mitochondriale pour favoriser la mitophagie. EMBO Rep. 19, e46363 (2018).

Google Scholar

Mahajan, A. et al. Cartographie fine d'un ensemble élargi de locus de diabète de type 2 à une résolution à variante unique à l'aide d'imputations à haute densité et de cartes d'épigénomes spécifiques aux îlots. Nat. Genet. 50, 1505-1513 (2018).

CAS Google Scholar

Fahie, K. & Zachara, NE Fonctions moléculaires des glycoconjugués dans l'autophagie. J. Mol. Biol. 428, 3305–3324 (2016).

CAS Google Scholar

Marsh, SA, Powell, PC, Dell'italia, LJ & Chatham, JC L'O-GlcNAcylation cardiaque émousse la signalisation autophagique dans le cœur diabétique. Vie Sci. 92, 648–656 (2013).

CAS Google Scholar

Park, S. et al. La modification de l'O-GlcNAc est essentielle pour la régulation de l'autophagie chez Drosophila melanogaster. Cellule. Mol. Vie Sci. 72, 3173–3183 (2015).

CAS Google Scholar

Guo, B. et al. La modification O-GlcNAc de SNAP-29 régule la maturation de l'autophagosome. Nat. Cell Biol. 16, 1215-1226 (2014).

CAS Google Scholar

Brindille, G. et al. La fission et la fusion sélective régissent la ségrégation mitochondriale et l'élimination par autophagie. EMBO J. 27, 433–446 (2008).

CAS Google Scholar

Klionsky, DJ Directives pour l'utilisation et l'interprétation des tests de surveillance de l'autophagie (3e édition). 12, 1–222 (2016).

Gaulton, KJ et al. Une carte de la chromatine ouverte dans les îlots pancréatiques humains. Nat. Genet. 42, 255-259 (2010).

CAS Google Scholar

Dwivedi, OP et al. La perte de la fonction ZnT8 protège contre le diabète en augmentant la sécrétion d'insuline. Nat. Genet. 51, 1596-1606 (2019).

CAS Google Scholar

Fadista, J. et al. L'analyse génomique et transcriptomique globale des îlots pancréatiques humains révèle de nouveaux gènes influençant le métabolisme du glucose. Proc. Natl Acad. Sci. États-Unis 111, 13924–13929 (2014).

CAS Google Scholar

Miguel-Escalada, I. et al. L'architecture tridimensionnelle de la chromatine des îlots pancréatiques humains donne un aperçu de la génétique du diabète de type 2. Nat. Genet. 51, 1137-1148 (2019).

CAS Google Scholar

Rai, V. et al. L'ATAC-Seq unicellulaire dans les îlots pancréatiques humains et la mise à l'échelle de l'apprentissage en profondeur des cellules rares révèlent des signatures régulatrices du diabète de type 2 spécifiques aux cellules. Mol. Métab. 32, 109-121 (2020).

CAS Google Scholar

Bonàs-Guarch, S. et al. Une nouvelle analyse des données génétiques publiques révèle une variante rare du chromosome X associée au diabète de type 2. Nat. Commun. 9, 321 (2018).

Google Scholar

Lazarou, M. et al. L'ubiquitine kinase PINK1 recrute des récepteurs de l'autophagie pour induire la mitophagie. Nature 524, 309–314 (2015).

CAS Google Scholar

Fex, M. et al. Le rôle pathogénétique des mitochondries des cellules β dans le diabète de type 2. J. Endocrinol. 236, R145–R159 (2018).

CAS Google Scholar

Heo, J.-M., Ordureau, A., Paulo, JA, Rinehart, J. & Harper, JW La voie d'ubiquitylation mitochondriale PINK1-PARKIN pilote un programme de recrutement OPTN/NDP52 et d'activation de TBK1 pour favoriser la mitophagie. Mol. Cellule 60, 7-20 (2015).

CAS Google Scholar

Lyon, J. et al. Isolement axé sur la recherche d'îlots humains de donneurs avec et sans diabète à l'Alberta Diabetes Institute IsletCore. Endocrinologie 157, 560–569 (2016).

CAS Google Scholar

Lyon, J., Spigelman, AF, Fox, JEM & Macdonald, PE ADI Protocoles IsletCore pour l'isolement, l'évaluation et la cryoconservation d'îlots pancréatiques humains de langerhans à des fins de recherche V.2. https://www.protocols.io/view/adi-isletcore-protocols-for-the-isolation-assessme-x3mfqk6.html (2021).

Thomsen, SK et al. Caractérisation fonctionnelle systématique des gènes causaux candidats pour les variants de risque de diabète de type 2. Diabète 65, 3805–3811 (2016).

CAS Google Scholar

Nica, AC et al. Signatures cellulaires, alléliques et génétiques dans le transcriptome des cellules bêta pancréatiques humaines. Génome Res. 23, 1554-1562 (2013).

CAS Google Scholar

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ALG est un Wellcome Senior Fellow en sciences biomédicales fondamentales. AKR et SKT sont boursiers du département de médecine de Radcliffe et AKR a reçu une bourse de voyage de la Fondation européenne pour l'étude du diabète (EFSD). ALG a été financé par le Wellcome (200837), le National Institute of Diabetes and Digestive and Kidney Diseases (NIDDK) (U01-DK105535, U01-DK085545, UM1DK126185) et le Stanford Diabetes Research Center (prix NIDDK P30DK116074). Le projet a en outre été soutenu par le National Center for Research Resources (NCRR) (1S10RR026780-01) et les National Institutes of Health (NIH) (subventions R01 DK108817 et R01 DK107507 à SKK) et une Fondation de recherche sur le diabète juvénile (bourse FRDJ) (à RJB). PEM est soutenu par la Chaire de recherche du Canada en biologie des îlots et en partie par les Instituts de recherche en santé du Canada (MOP, 148451). Nous remercions les membres passés et actuels du laboratoire Gloyn pour leurs conseils et leurs encouragements, Dylan Jones pour l'amplification de la bibliothèque, Ruddy Montandon pour le tri FACS, l'Oxford Genomics Center (Wellcome Center for Human Genetics) pour le séquençage, Gene Vector and Virus Core (GVVC) pour la génération du lentivirus avec les plasmides vecteurs CALCOCO2, le noyau EM du Cell Sciences Imaging Facility (CSIF) pour la préparation des échantillons EM et le projet décrit a été soutenu, en partie, par le prix ARRA 1 S10RR026780-01 du National Center for Research Resources (NCRR). Nous remercions Karla Kirkegaard pour ses conseils avec la coloration LC3. Nous remercions Yan Hang, Mollie Friedlander et l'Islet Core du Stanford Diabetes Research Center pour leur soutien dans les tests de sécrétion hormonale. Nous tenons à remercier les donneurs d'organes et leurs familles, ainsi que l'approvisionnement en îlots par l'intermédiaire de l'Alberta Diabetes Institute Islet Core avec l'aide du programme Human Organ Procurement and Exchange (HOPE), du Trillium Gift of Life Network (TGLN) et d'autres organisations canadiennes d'approvisionnement en organes, du Integrated Islet Distribution Program (US NIH UC4 DK098085), du National Disease Research Interchange et de l'Institut international pour l'avancement de la médecine. Toutes les familles des donneurs ont donné leur consentement éclairé pour l'utilisation de tissu pancréatique dans la recherche. Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Yingying Ye, Elena Navarro-Guerrero.

Centre d'Oxford pour le diabète, l'endocrinologie et le métabolisme, Radcliffe Department of Medicine, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Antje K. Rottner, Soren K. Thomsen, Sameena Nawaz & Anna L. Gloyn

Département de pédiatrie, Division d'endocrinologie, École de médecine de Stanford, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Yingying Ye, Varsha Rajesh, Alina Pollner, Jing Yang, Han Sun, Daniel Ebner et Anna L. Gloyn

Target Discovery Institute, Nuffield Department of Medicine, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Elena Navarro-Guerrero et Roberta Baronio

Département de biologie du développement, École de médecine de l'Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Romina J. Bevacqua & Seung K. Kim

Centre de recherche sur le diabète de Stanford, École de médecine de Stanford, Université de Stanford, Stanford, Californie, États-Unis

Romina J. Bevacqua, Seung K. Kim et Anna L. Gloyn

Département de pharmacologie et Institut du diabète de l'Alberta, Université de l'Alberta, Edmonton, Alberta, Canada

Aliya F. Spigelman, Austin Baptist, James Lyon, Nancy Smith, Jocelyn E. Manning Fox et Patrick E. MacDonald

Centre de recherche biomédicale du NIHR d'Oxford, Oxford University Hospitals Trust, Oxford, Royaume-Uni

Agatha Wesolowska-Andersen et Anna L. Gloyn

Wellcome Centre for Human Genetics, Nuffield Department of Medicine, Université d'Oxford, Oxford, Royaume-Uni

Anna L. Gloyn

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AKR, YY, SKT et ALG ont conçu l'étude. AKR, EN-G. et SKT ont réalisé des expériences d'optimisation de criblage CRISPR. AKR, EN-G., RB et SN ont réalisé l'écran CRISPR. EN-G. et RB a effectué la préparation de la bibliothèque de séquençage. AKR a analysé les données de dépistage CRISPR. AW-A. ont contribué à l'analyse de dépistage CRISPR. AKR et ALG ont effectué une analyse d'intégration des données. AKR a effectué la validation de CALCOCO2, QSER1 et PLCB3 dans les cellules bêta. AFS, AB, JL, NS, JMF, PEM et ALG ont évalué les allèles à risque CALCOCO2 dans les îlots humains. YY, VR, AP et JY ont effectué des études de suivi CALCOCO2 dans EndoC-βH1. AKR et RJB ont effectué des immunocolorations d'îlots. RJB, AKR et VR ont réalisé des expériences d'inactivation de shRNA d'îlots. HS a analysé les données d'ARN-seq. SKK, JMF, DE, PEM et ALG ont supervisé la recherche. AKR et ALG ont rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont approuvé la version finale du manuscrit.

Correspondance avec Anna L. Gloyn.

Les auteurs déclarent les intérêts concurrents suivants : AKR est maintenant un employé d'AstraZeneca, SKT est maintenant un employé de Vertex Pharmaceuticals et AW-A. est maintenant un employé de Genomics plc. DE et EN-G sont désormais également affiliés à XCellomics. Tous les travaux expérimentaux de AKR, SKT et AW-A. a été réalisée dans le cadre d'un emploi à l'Université d'Oxford. AKR détient des actions dans Astra Zeneca. Le conjoint d'ALG détient des options sur actions de Roche. Les autres auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Genetics remercie Bridget Wagner et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Histogrammes montrant différentes stratégies de coloration FACS dans EndoC-βH1 comparant l'insuline intracellulaire (graphique bleu) et les contrôles isotypiques respectifs (graphique rose) en utilisant (a) différents anticorps primaires monoclonaux comme indiqué (violet, bleu, anticorps rose) en combinaison avec un anticorps secondaire (gris) conjugué à AF488 (vert) ou conjugaison directe au FITC (vert) et (b) en utilisant différents protocoles de coloration avec divers tampons de fixation (rangée du haut) ou de perméabilisation (rangée du bas ) comme indiqué. Trois expériences indépendantes ont été réalisées et des histogrammes représentatifs sont présentés. Le dépistage CRISPR à l'échelle du génome a été réalisé à l'aide de l'anticorps anti-INS de Cell Signaling et des réactifs et protocoles commerciaux de fixation et de perméabilisation Cytofix/Cytoperm de BD Sciences.

Images FACS représentatives et portes de tri pour EndoC-βH1 coloré dans les écrans CRISPR à l'échelle du génome. (a) Portes de tri évaluant la taille, la granularité et la viabilité des cellules pour exclure les débris, définir les singulets et les cellules vivantes. ( b ) Recours à une population de cellules à faible insuline pour évaluer la pureté de l'échantillon. SSC-A, zone de diffusion latérale ; FSC-A, zone de diffusion vers l'avant ; FSC-W, largeur de diffusion vers l'avant.

( a ) Aperçu de l'écran CRISPR du tri FACS initial de l'EndoC-βH1 transduit à l'analyse de séquençage finale. (b, c, e) Nombre de lectures et contrôle de la qualité des sgRNA cartographiés pour l'insuline faible (LOW1, LOW2), l'insuline élevée (HIGH1, HIGH2) et les échantillons de référence (REF1, REF2) des deux réplicats, y compris : (b) le nombre total de lectures et la proportion de lectures cartographiées et (c) le nombre de sgRNA à comptage nul en proportion des sgRNA totaux et (e) les distributions normalisées du nombre de lectures. Les cases montrent l'IQR entre le premier et le troisième quartile, la ligne horizontale montre la médiane et les moustaches montrent Q3 + 1,5 × IQR et Q1 - 1,5 × IQR. ( d ) Analyse des composants principaux sur le nombre de lectures d'ARNg normalisé pour les deux premiers composants de la teneur en insuline faible (gris) et élevée (bleu) et des échantillons de référence (violet) des deux répétitions. ( f - i ) Analyse de corrélation Pearson par paires des changements de pli entre la teneur en insuline faible et élevée pour chaque réplique ( f ), les répliques de référence ( g ), les répliques à faible teneur en insuline ( h ) et les répliques à teneur élevée en insuline ( i ). La ligne violette indique la ligne de régression linéaire. Log2FC, log2 (changement de pli); r, coefficient de corrélation de Pearson. Toutes les données sont des lectures d'ARNsg à partir de deux répliques indépendantes de l'écran CRISPR à l'échelle du génome.

Analyse de la voie STRING montrant les associations protéine-protéine, y compris les interactions physiques et fonctionnelles pour les résultats de dépistage CRISPR. Les grappes ont été identifiées manuellement, annotées et tracées individuellement et les grappes sélectionnées sont affichées. Le niveau de confiance pour déterminer les interactions a été fixé au niveau de confiance le plus élevé (0,9).

( a ) Locus CALCOCO2 avec des signaux d'association GWAS crédibles (en haut) et des gènes voisins (en bas). ( b – g ) Distribution du nombre de sgRNA pour les 8 sgRNA par gène (4 sgRNA par réplicat) dans le criblage CRISPR à l'échelle du génome pour les gènes au locus CALCOCO2. Changements dans le nombre d'ARNsg d'un échantillon à faible teneur en insuline à haute teneur en insuline, chaque couleur représentant le même ARNsg sur les deux répliques d'écran. La ligne pointillée noire représente le nombre médian de sgRNA pour ce gène. ( h ) EndoC-βH1 a été transduit de manière stable avec le virus témoin et l'ARNsi (siNT), le virus témoin et le siCALCOCO2 ou le lentivirus pour exprimer CALCOCO2 hébergeant des mutations silencieuses (mutCALCOCO2) le rendant résistant au siCALCOCO2 (P = 0, 0352). Les données ont été normalisées par rapport à leur contrôle respectif (siNT) et analysées à l'aide d'un test t à un échantillon. Toutes les données sont moyennes ± SEM de six expériences indépendantes ou de deux répliques indépendantes de l'écran CRISPR à l'échelle du génome. Valeur P * < 0,05. Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. NT, sans ciblage.

( a ) Approche de priorisation des gènes combinant des gènes avec des preuves causales en tant que transcrits effecteurs du DT2 (comme indiqué dans l'approche d'intégration) tout en n'étant pas non plus un succès de dépistage, a mis en évidence QSER1 et PLCB3. PLCB3 joue un rôle dans la voie d'amplification dans la cellule bêta mais a également été associé à l'action de l'insuline dans une approche de regroupement physiologique multitrait. QSER1 a récemment été identifié comme un régulateur de méthylation de l'ADN associé à des défauts de différenciation pancréatique. (b) Changements dans le nombre de sgRNA d'un échantillon à faible à haute teneur en insuline, chaque couleur représentant le même sgRNA sur les deux répliques de l'écran. La ligne pointillée noire représente le nombre médian de sgRNA pour ce gène. ( d - n ) Toutes les données proviennent d'EndoC-βH1 traité par siQSER1 ou siPLCB3 par rapport aux cellules témoins non ciblées. ( d ) Expression de l'ARNm de QSER1 et PLCB3 dans leurs cellules silencieuses respectives (bleu) par rapport aux cellules témoins siNT (gris) (P = 0, 0010, 0, 0005). (e) Teneur en insuline en pg pour 20 000 cellules. ( f ) expression d'ARNm de INS. ( g, k ) Sécrétion d'insuline normalisée à siNT ou (i, m) à la teneur en insuline et siNT dans 1 mM, 20 mM, 1 mM + 100 μM de tolbutamide ou 20 mM de glucose + 100 μM de diazoxide. (h, j, l, n) Changement de la sécrétion d'insuline de 1 à 20 mM de glucose. Toutes les données sont moyennes ± SEM de trois (d, f – n) ou 12 (e) expériences indépendantes ou de deux écrans CRISPR indépendants à l'échelle du génome (b, c). Les données ont été analysées à l'aide d'un test t à deux échantillons (d, h, j, l, n) et d'une ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak (e, f, g, i, k, m). Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. Valeurs P *** < 0,001. FC, changement de pli ; LFC, log2 (changement de pli); NT, sans ciblage.

Coloration par immunofluorescence d'EndoC-βH1 traité avec siCALCOCO2 ou siNT (a) et tissu exocrine dans des coupes de pancréas (b). Les sections ont été doublement immunocolorées pour INS et CALCOCO2 (rouge ou vert comme indiqué). Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). La barre d'échelle est de 6 μm (a) ou 10 μm (b). d : cellules canalaires ; a : cellules acineuses ; moi : îlot. NT, sans ciblage. Toutes les images sont représentatives de trois colorations indépendantes par immunofluorescence.

Toutes les données proviennent d'EndoC-βH1 traité par siCALCOCO2 par rapport à des cellules témoins non ciblées. (a–d, g, h, k–m) Expression de l'ARNm des gènes cibles indiqués mesurée en ARN-Seq (a–d, k–m) ou qPCR (g, h) avec leurs cellules silencieuses respectives (bleu) par rapport aux cellules témoins siNT (gris) (P = 1,87 × 10−6). (e, f) Quantification des mitochondries altérées dans les images EM basées sur une forme ou des crêtes anormales, normalisées au nombre total de mitochondries par les évaluateurs en aveugle deux et trois (P <0,0001, 0,0032). (i, j) Quantification des granules d'insuline matures normalisées au nombre total de granules par cellule dans les images EM par les évaluateurs en aveugle deux et trois (P = 0,0002, 0,0002). (n, o) Niveau de protéine de PCSK1 (n), PCSK2 (o) et son contrôle de chargement GAPDH. ( p, q ) Quantification du niveau de protéine Western blot PCSK1 ( p ) et PCSK2 ( q ) normalisé aux cellules témoins GAPDH et siNT. r,s) Teneur en insuline (r) ou proinsuline(s) après traitement avec MG132 à 1 μM (+), 10 μM (++) ou DMSO par rapport aux cellules témoins siNT (ligne pointillée). Toutes les données sont moyennes ± SEM de trois expériences indépendantes ou d'au moins seize cellules mesurées par trois évaluateurs indépendants (e, f, i, j). Le niveau de protéine est affiché en pourcentage de siNT qui est mis en évidence par une ligne pointillée à 100 %. Les données ont été analysées à l'aide du test t à deux échantillons (e–j), du test de Wald dans DESeq2 ajusté à l'aide de la méthode Benjamini et Hochberg (a–d, k–m), du test t à un échantillon (p, q) et de l'ANOVA unidirectionnelle avec le test de comparaison multiple de Sidak (r, s). Aucune représentation graphique de la signification n'indique des résultats non significatifs. Valeurs P ** < 0,01, *** < 0,001, **** < 0,0001. NT, sans ciblage.

Données source

Tableaux supplémentaires 2 et 3, Méthodes et discussion.

Tableau supplémentaire 1—Screen hits. Tableau supplémentaire 2—Gènes causaux prioritaires pour le DT2 sur la base de l'intégration avec les prédictions du gène effecteur du DT2. Tableau supplémentaire 3—Détails du donneur de tissus humains. Tableau supplémentaire 4—Ressources. Tableau supplémentaire 5—ARN-seq. Tableau supplémentaire 6—Donneur d'îlots. Tableau supplémentaire 7—succès d'ARNsg. Tableau supplémentaire 8—Screen_all sgRNA.

Western blots non traités.

Western blots non traités.

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Réimpressions et autorisations

Rottner, AK, Ye, Y., Navarro-Guerrero, E. et al. Un dépistage CRISPR à l'échelle du génome identifie CALCOCO2 comme un régulateur de la fonction des cellules bêta influençant le risque de diabète de type 2. Nat Genet 55, 54–65 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

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Reçu : 21 mai 2021

Accepté : 26 octobre 2022

Publié: 21 décembre 2022

Date d'émission : janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41588-022-01261-2

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