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Apr 30, 2023

Les protocoles de dissociation de la muqueuse intestinale influencent les proportions de types de cellules et les

Rapports scientifiques volume 12,

Rapports scientifiques volume 12, Numéro d'article : 9897 (2022) Citer cet article

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Le séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) a révolutionné l'étude du paysage cellulaire des organes. La plupart des protocoles à cellule unique nécessitent du matériel frais, ce qui limite la taille de l'échantillon par expérience et, par conséquent, introduit des effets de lot. Cela est particulièrement vrai pour les échantillons acquis par des procédures médicales complexes, telles que les biopsies de la muqueuse intestinale. De plus, la procédure de dissociation tissulaire nécessaire à l'obtention de cellules individuelles est une source majeure de bruit ; différentes procédures de dissociation appliquées à différents compartiments du tissu induisent des différences artificielles d'expression de gènes entre les sous-ensembles cellulaires. Pour surmonter ces défis, nous avons développé un protocole de dissociation en une étape et démontré son utilisation sur des biopsies de muqueuse intestinale cryoconservées. À l'aide de la cytométrie en flux et de l'analyse scRNA-seq, nous avons comparé ce protocole de dissociation en une étape avec l'étalon-or actuel, la digestion de la collagénase en deux étapes et une adaptation d'une alternative récemment publiée, la digestion de la protéase de Bacillus licheniformus à froid en trois étapes. La viabilité cellulaire et la composition du type cellulaire étaient comparables entre la dissociation en une étape et en deux étapes de la collagénase, la première étant plus efficace dans le temps. La digestion par protéase froide a entraîné une viabilité cellulaire égale, mais préserve mieux les types de cellules épithéliales. Par conséquent, pour analyser les types de cellules plus rares, telles que les cellules gliales, un plus grand nombre total de cellules de biopsie est nécessaire comme matériau d'entrée. Les protocoles en plusieurs étapes ont affecté différemment les types de cellules couvrant plusieurs compartiments. En résumé, nous montrons que les biopsies de la muqueuse intestinale cryoconservées peuvent être utilisées pour surmonter les défis logistiques et les effets de lot dans les grandes études scRNA-seq. En outre, nous démontrons que l'utilisation de biopsies cryoconservées digérées à l'aide d'un protocole de collagénase en une étape permet à grande échelle scRNA-seq, FACS, génération d'organoïdes et expansion lymphocytaire intraépithéliale.

Même si cela fait plus de 30 ans que le premier ADNc a été extrait d'une seule cellule1, ce n'est que très récemment que les développements technologiques dans le domaine du séquençage d'ARN unicellulaire (scRNA-seq) permettent le profilage de l'expression génique unicellulaire à haut débit2. Ce développement permet l'étude impartiale des populations de cellules hétérogènes dans les tissus sans avoir besoin d'isoler les types de cellules séparément. Au-delà de la cartographie de l'expression cellulaire, cela permet d'étudier les interactions potentielles cellule-cellule dans le contexte d'un tissu3.

Plusieurs efforts mondiaux sont en cours pour cartographier le corps humain à une résolution unicellulaire à la fois dans le domaine de la santé (Human Cell Atlas4) et de la maladie (consortium LifeTime5). L'un des domaines dans lesquels de grands efforts sont déjà entrepris est le domaine de la gastro-entérologie ; Des atlas intestinaux fœtaux, pédiatriques et adultes « sains » sont (en cours de création)6,7. Cela a abouti à l'identification de nouveaux types de cellules et de leurs fonctions spécifiques, telles que les cellules épithéliales BEST4 impliquées dans la détection du pH8, et a fourni les premiers indices sur les raisons pour lesquelles certains patients atteints de la maladie de Crohn ne répondent pas à des médicaments spécifiques9.

La muqueuse intestinale est un organe complexe qui peut être divisé en plusieurs compartiments : la couche épithéliale, située dans la partie luminale ; et la couche de lamina propria, située sous l'épithélium. Chaque compartiment est composé d'un mélange de types de cellules, qui peuvent avoir des fonctions spécialisées et locales, et qui sont réparties différemment dans le tractus gastro-intestinal10,11. Du côté luminal, la muqueuse intestinale est composée d'une couche de mucus acellulaire, séparant les bactéries intestinales de l'épithélium. Cette couche fonctionne comme une seconde barrière entre le monde extérieur et le compartiment intestinal interne. Directement en dessous se trouve la couche épithéliale, dans laquelle les cellules immunitaires s'infiltrent et remplissent des fonctions spécifiques de défense antimicrobienne et de signalisation antigénique. L'une de ces populations de cellules immunitaires qui ne réside qu'ici est la population de lymphocytes intraépithéliaux (IEL), qui est fonctionnellement différente des lymphocytes de la lamina propria (LPL), la couche sous-jacente. Cette dernière couche contient également d'autres cellules immunitaires, le système vasculaire, les nerfs et les cellules mésenchymateuses12,11,14.

Pour profiler efficacement les cellules individuelles d'un organe aussi complexe et solide, le tissu doit être dissocié, ce qui est une première étape essentielle dans chaque protocole scRNA-seq. Cependant, plusieurs obstacles majeurs entravent la mise à l'échelle des atlas intestinaux unicellulaires. Premièrement, la durée de la dissociation et la procédure elle-même peuvent introduire des artefacts indésirables dans la lecture de l'expression génique en aval15,16. Chaque étape de la procédure de dissociation peut influencer l'expression des gènes, par conséquent le traitement doit être limité à ce qui est strictement nécessaire. Deuxièmement, la procédure de dissociation doit être suffisamment approfondie, séparant toutes les cellules sans endommager les types de cellules plus fragiles. Cela est particulièrement vrai si le chercheur souhaite étudier un reflet précis du tissu d'origine, comme pour l'utilisation d'atlas cellulaires. Cet équilibre entre l'obtention d'un groupe représentatif de cellules simples viables et la minimisation des artefacts nécessite un réglage fin.

Pour obtenir ce reflet précis du tissu d'origine, les procédures actuelles de dissociation des biopsies intestinales peuvent être améliorées de deux manières. Premièrement, en évitant les différences entre les cellules du même tissu induites par la digestion en plusieurs étapes : idéalement, on traiterait l'ensemble du tissu en utilisant une procédure de dissociation en une étape. L'étalon-or actuel pour isoler des cellules individuelles de l'intestin, cependant, est une procédure de dissociation en deux étapes : la couche épithéliale est d'abord dissociée, en utilisant de l'EDTA, suivie de la couche de lamina propria, en utilisant un traitement à la collagénase à 37 °C (ci-après appelé le protocole de collagénase en deux étapes)17,16,19. Deuxièmement, les protocoles actuels de scRNA-seq sur les tissus intestinaux étaient auparavant limités au matériel intestinal frais, soit collecté par biopsie pendant la coloscopie, soit en tant que matériel de résection d'une intervention chirurgicale. En conséquence, seul un nombre très limité d'échantillons peut être traité à la fois, ce qui peut introduire des effets de lot entre les échantillons sans possibilité de corriger cela. Pour répondre à ces préoccupations, une procédure de cryoconservation récemment développée du tissu de la muqueuse intestinale permet désormais de mener des expériences multi-échantillons intestinaux avec des cellules vivantes20,21.

Pour surmonter ces limitations, nous avons développé un nouveau protocole de dissociation intestinale (dissociation de la collagénase en une étape) adapté aux protocoles scRNA-seq qui traite toutes les cellules de la même manière, visant à prévenir les effets de lot entre différents types de cellules qui sont autrement isolés séquentiellement. Nous montrons d'abord que la cryoconservation n'affecte pas les paramètres de qualité de séquençage ni la viabilité cellulaire des cellules dissociées par la collagénase en une étape, mais a vraisemblablement un impact sur la composition du type cellulaire et les niveaux d'expression génique. Nous comparons ensuite les paramètres de séquençage, la viabilité cellulaire, le rendement cellulaire et l'expression génique de scRNA-seq et FACS en utilisant cette dissociation en une étape de la collagénase sur des biopsies cryoconservées avec la méthode de dissociation du tissu intestinal de référence (protocole en deux étapes de la collagénase) et une autre alternative utilisant une digestion en trois étapes avec une protéase isolée de Bacillus licheniformis active à 4 ° C (protéase en trois étapes) [adapté de 22 et 23]. Ce dernier protocole vise à minimiser les artefacts d'expression génique généralement associés à la dissociation, en gardant les cellules métaboliquement inactives à 4 oC. De plus, il a été conçu pour prévenir la mort des cellules épithéliales intestinales sujettes à l'anoikis dans l'intestin sain pour les études scRNA-seq. Dans la première étape de cette procédure, les biopsies sont incubées sur de la glace avec une faible concentration d'EDTA pour libérer des cellules immunitaires faiblement liées (fraction 1), après quoi la couche épithéliale, contenant des cellules immunitaires infiltrantes, est dissociée à l'aide d'une protéase active à froid (fraction 2) et les deux fractions sont traitées brièvement avec de la collagénase IV pour assurer une digestion complète. En comparant les effets sur la viabilité cellulaire, la composition du type cellulaire et les niveaux d'expression génique unicellulaire, nous avons déterminé les meilleurs scénarios d'utilisation et les limites de chaque protocole. Nous avons ensuite résumé cela dans un outil de décision de protocole qui peut aider les scientifiques à décider quel protocole convient le mieux à leurs questions biologiques.

Pour évaluer l'effet de différents protocoles de dissociation dans différents types de cellules simultanément et avec une haute résolution, une comparaison côte à côte a été effectuée en utilisant à la fois la cytométrie en flux (FACS) et les données scRNA-seq (Fig. 1A). Deux ensembles de données distincts ont été utilisés pour déterminer l'effet de la cryoconservation ou du protocole de dissociation cellulaire (Fig. 1B). Pour scRNA-seq, l'effet de la cryoconservation a été comparé sur deux échantillons appariés à l'aide du protocole de collagénase en une étape, tandis que l'effet de la dissociation sur la viabilité cellulaire, la composition du type cellulaire et l'expression génique a été comparé sur (un plus grand ensemble d') échantillons provenant de différents individus. Pour le FACS, la cryoconservation a été évaluée sur la collagénase en une étape et la fraction 2 des protocoles de protéase en trois étapes, tandis que l'impact de la dissociation cellulaire a été évalué sur un ensemble de données plus large. Chaque protocole a donné lieu à différents compartiments (Fig. 1A) :

Les données dérivées du protocole de collagénase en une étape ont été analysées pour la composition du type de cellule dans son ensemble, à partir d'ici appelée compartiment de biopsie entière (WB).

La collagénase en deux étapes a été analysée en deux parties : les fractions de la couche épithéliale (EL) et de la lamina propria (LP), respectivement.

Le protocole de protéase en trois étapes a été analysé en utilisant scRNA-seq à la fois comme un mélange 50/50 de fraction 1 (F1) et 2 (F2), et comme fraction 2 uniquement, et en utilisant FACS comme fraction 1 et 2 séparément.

Aperçu de l'étude et ensembles de données. (A) Représentation schématique de la mise en place de l'étude. Des biopsies ont été prélevées, utilisées fraîches ou cryoconservées, et dissociées à l'aide du protocole de collagénase en une étape avec de la collagénase à 37 °C ; la collagénase en deux étapes avec l'EDTA à l'étape 1 et la collagénase à 37 °C à l'étape 2 ; ou le protocole de protéase en trois étapes, en commençant par une incubation d'EDTA à 4 oC à l'étape 1, une digestion de protéase à l'étape 2 et une courte digestion de collagénase à température ambiante à l'étape 3. (B) Deux ensembles de données ont été générés pour étudier : 1. l'effet de la cryoconservation et 2. l'effet de différents protocoles de dissociation sur la viabilité, la composition, le transcriptome et la fonctionnalité du type cellulaire. IEL, cellule intraépithéliale ; CE, cellule épithéliale. Le pictogramme de coloscopie a été dessiné par Gan Khoon Lay, https://thenounproject.com/term/colonoscopy/1250282/.

Pour évaluer l'impact de la cryoconservation sur les échantillons, nous avons comparé les viabilités cellulaires obtenues après dissociation à l'aide des protocoles de collagénase en une étape et de protéase en trois étapes par un colorant de viabilité cellulaire pour la cytométrie en flux. Nous avons constaté que la viabilité cellulaire des échantillons des deux protocoles présentait des viabilités similaires (médiane 81,5 %, SD 12,8 Fig. 2A, Suppl. Tableau 1). Bien que la moyenne des échantillons cryoconservés de la collagénase en une étape soit supérieure à celle des échantillons frais, les différences n'étaient pas significatives (p > 0,05, test t non apparié).

Impact de la cryoconservation sur les cellules dissociées à l'aide du protocole de collagénase en une étape dans FACS et scRNA-seq. (A) Boîtes à moustaches montrant la viabilité des cellules FACS (%) dans les cellules dissociées d'échantillons frais ou cryoconservés pour la biopsie entière (protocole de collagénase en une étape) et la fraction 2 (protocole de protéase en trois étapes) (valeur p> 0,05; test t non apparié). La taille de l'échantillon est représentée dans la partie inférieure du graphique. UMAP de données scRNA-seq obtenues à partir d'échantillons frais et cryoconservés à deux paires dissociés avec une collagénase en une étape colorée par les types de cellules (B) et les conditions de stockage (C). (D) Diagramme à barres des fréquences relatives des types de cellules récupérées à partir des données scRNA-seq colorées par type de cellule.

Pour étudier l'effet de la cryoconservation sur le scRNA-seq après le protocole de collagénase en une étape, nous avons utilisé des échantillons appariés frais et cryoconservés de deux individus. Premièrement, les paramètres de base pour le contrôle de la qualité du séquençage ont montré que l'intégrité de l'ARN, telle que mesurée par la qualité des lectures séquencées, la mappabilité des lectures sur le génome et les paramètres de QC cellulaire, n'était pas affectée par la procédure de cryoconservation (Suppl. Tableau 2). Ensuite, nous avons regroupé les cellules en fonction de leur transcriptome et déterminé l'identité du type de cellule comme décrit dans Méthodes (Fig. 2B). La fraction de gènes mitochondriaux a été évaluée par catégorie cellulaire (épithélium, stroma, immunitaire), puisqu'il existe une différence dépendante du type de cellule dans le nombre de gènes mitochondriaux. Les cellules stromales et épithéliales montrent une tendance à une expression génique mitochondriale plus élevée après la cryoconservation, tandis que les cellules immunitaires apparaissent plus faibles dans le nombre de gènes mitochondriaux (Suppl. Figure 1A – D). Lors de la comparaison de la fraction de gènes mitochondriaux à une résolution de type cellulaire plus élevée, nous observons que les cellules T montrent une distribution bimodale claire dans des échantillons frais, ce qui pourrait indiquer la récupération de cellules de faible qualité (Suppl. Figure 1E).

En utilisant un UMAP comme visualisation, nous avons observé que les cellules fraîches et cryoconservées sont relativement bien réparties entre les types de cellules (Fig. 2C). Pour révéler comment la composition cellulaire est affectée par le mode de stockage, nous avons utilisé à la fois les données scRNA-seq (Fig. 2D) et la cytométrie en flux (Suppl. Figure 2). Dans les données scRNA-seq, nous avons noté des preuves suggérant une diminution des proportions de cellules myéloïdes (5–1%) et de fibroblastes (11–4%), et une augmentation des cellules épithéliales (47–67%) (Fig. 2D). De même, après cryoconservation, nous avons observé une diminution significative des proportions cellulaires de cellules myéloïdes (~ 5–2%) ainsi que des cellules B (~ 13–6%, non observées dans les données scRNA-seq), alors que la proportion de cellules épithéliales a augmenté (~ 38–55%) (Suppl. Figure 2).

En résumé, nous avons observé pour les deux protocoles, la collagénase en une étape et la protéase en trois étapes, que la cryoconservation (vérifiée jusqu'à 14 mois) n'avait pas d'impact significatif sur la viabilité cellulaire. Nous avons trouvé des preuves suggérant que la composition globale du type de cellule était légèrement affectée par la cryoconservation, à l'exception des cellules myéloïdes, des fibroblastes et des cellules B, qui ont vraisemblablement été réduites après la cryoconservation (Fig. 2D, Suppl. Figure 2), conformément aux rapports précédents20. En conclusion, la cryoconservation des biopsies intestinales permet un stockage à long terme et des configurations expérimentales à haut débit. Par conséquent, combinée à l'absence d'effets néfastes majeurs sur la viabilité cellulaire, la composition du type cellulaire ou les niveaux d'expression génique, il s'agit de la méthode de traitement de l'échantillon de choix.

Ensuite, nous avons exploré l'impact du protocole de dissociation cellulaire sur la viabilité des cellules. Dans les échantillons frais, la viabilité cellulaire la plus élevée a été obtenue dans la fraction 2 du protocole de protéase en trois étapes, qui est principalement composée de cellules épithéliales et immunitaires, mais elle n'a atteint une différence significative que par rapport à la fraction EL du protocole de collagénase en deux étapes (Fig. 3A, p <0, 05). La deuxième viabilité la plus élevée a été obtenue par le protocole de collagénase en une étape (WB, biopsie entière) et le LP (lamina propria, principalement des cellules immunitaires) obtenu par le protocole de collagénase en deux étapes (Fig. 3A, Suppl. Tableau 1). Nous avons observé que les cellules épithéliales traitées uniquement à l'EDTA dans le protocole de collagénase en deux étapes présentaient la viabilité la plus faible (Fig. 3A, Suppl. Tableau 1). Cependant, ces comparaisons n'étaient pas significatives (p < 0,05).

Effet des protocoles de dissociation sur la viabilité cellulaire évaluée par FACS et hémocytométrie. Boîtes à moustaches comparant la viabilité cellulaire (%) dans (A) des échantillons frais mesurés par FACS ; et échantillons cryoconservés mesurés par (B) FACS et (C) exclusion du bleu trypan. Les compartiments et les protocoles de dissociation sont indiqués en abscisse. La viabilité cellulaire moyenne a été comparée entre les compartiments (test t non apparié). Seules les comparaisons significatives (valeur p < 0,05) sont affichées sous forme de barre, et la valeur p respective, au-dessus du compartiment comparé. La taille de l'échantillon est représentée dans la partie inférieure de chaque graphique. WB, biopsie entière ; EL, couche épithéliale ; LP, lamina propria ; F1, fraction 1 ; F2, fraction 2.

Dans les échantillons cryoconservés, nous avons comparé le WB du protocole de collagénase en une étape et les deux fractions du protocole de protéase en trois étapes. Nos résultats suggèrent une viabilité cellulaire compromise (~ 60–66%) sur la fraction 1 du protocole de protéase en trois étapes (p <0, 05 par FACS, Fig. 3B; non concluant par le test d'exclusion au bleu trypan, Fig. 3C).

Enfin, nous avons étudié la fraction des gènes mitochondriaux sur l'expression totale des gènes dans tous les protocoles. Nous avons constaté que le protocole de collagénase en une étape a une fraction élevée d'expression de gènes mitochondriaux par rapport aux autres protocoles, étant un indicateur de niveaux élevés de mort cellulaire24 (Suppl. Figure 3A–H).

La dissociation de la collagénase en une étape a entraîné une récupération équilibrée des cellules épithéliales et immunitaires qui comprenaient également d'autres types de cellules telles que les fibroblastes, les cellules endothéliales et les cellules gliales (Fig. 4, Suppl. Figure 4). En revanche, les deux protocoles en plusieurs étapes ont pris en charge l'isolement de types de cellules spécifiques dans l'un ou l'autre des deux compartiments isolés (Fig. 4, Suppl. Figure 4). Le protocole de protéase en trois étapes prend en charge la viabilité des cellules épithéliales, qui constituent une grande partie des types de cellules intestinales, et donc des types de cellules plus rares tels que les NKs ILC (un mélange de tueurs naturels et de cellules lymphoïdes innées), les cellules endothéliales et fibroblastes apparaissent sous-représentées par comparaison dans les données scRNA-seq. Par exemple, par FACS, les ILC NKs sont mieux capturés dans la fraction 1 du protocole de protéase en trois étapes (Suppl. Figure 4 ; ~ 5 % contre < 1 % pour les protocoles de collagénase) mais semblent manquants dans l'ensemble de données scRNA-seq (Fig. 4).

Différences dans les proportions de types de cellules récupérées dans chaque protocole à l'aide de scRNA-seq. Boîtes à moustaches de proportions de type cellulaire caractérisées par scRNA-seq. La composition de type cellulaire résultante des échantillons a été testée dans les protocoles et les compartiments (test de somme des rangs de Wilcoxon avec correction de Holm pour les tests multiples, Suppl. Tableau 6). Les compartiments et les protocoles de dissociation sont indiqués en abscisse. La taille de l'échantillon est représentée dans la légende du graphique. WB, biopsie entière ; EL, couche épithéliale ; LP, lamina propria ; F1, fraction 1 ; F2, fraction 2.

Comme des questions de recherche spécifiques peuvent nécessiter l'isolement de types de cellules spécifiques, nous avons évalué quel protocole supportait le mieux l'isolement de chacun des principaux types de cellules avec la viabilité cellulaire la plus élevée. La couche épithéliale du protocole de collagénase en deux étapes et la fraction 2 du protocole de protéase supportent mieux l'isolement des cellules épithéliales que le protocole de collagénase en une étape (valeur p <0,05, Fig. 4, confirmée par cytométrie en flux, Suppl. Figure 4). D'autre part, la fraction 1 du protocole de protéase en trois étapes fournit la population immunitaire la plus purifiée (Fig. 4), mais avec une viabilité cellulaire compromise suggestive lors de l'utilisation de biopsies cryoconservées (Fig. 3B – C) et une réduction des cellules immunitaires spécifiques à la couche telles que les cellules T CD8 + LPL (Suppl. Figure 6). Cependant, pour la meilleure séparation des cellules immunitaires spécifiques à la couche, le protocole de collagénase en deux étapes est le protocole de choix. Malgré cela, la séparation variable des compartiments reste un problème avec tous les protocoles de dissociation en plusieurs étapes et est une source potentielle de biais. Cette variabilité peut être causée par plusieurs facteurs, tels que le temps d'incubation, la vitesse de centrifugation, la concentration d'enzymes et de produits chimiques, la température, la surface du tissu et la variabilité intrinsèque du donneur25. Par conséquent, l'application combinatoire de scRNA-seq et de séquençage des protéines de surface (CITE-seq)26 aux biopsies dissociées par la collagénase en une étape peut être une bonne alternative qui permet d'étudier les populations immunitaires spécifiques à la couche, telles que les cellules CD103 + IEL, sans introduire d'effets de lot spécifiques à la couche. De plus, d'autres stratégies d'enrichissement, telles que l'enrichissement en billes et le FACS, peuvent fournir cet enrichissement de type cellulaire sans se limiter à un protocole de dissociation spécifique, bien que nécessitant des étapes de laboratoire supplémentaires.

En résumé, le protocole de collagénase en une étape capture la composition intestinale avec une viabilité cellulaire équilibrée, tandis que les protocoles de collagénase et de protéase en plusieurs étapes sont préférables lorsqu'ils se concentrent sur des compartiments ou des types de cellules spécifiques.

Différents types de cellules peuvent réagir différemment aux traitements chimiques, abritant ainsi des effets de lots potentiels. Pour déterminer si les différents protocoles de dissociation induisent de tels effets de lot, nous avons effectué une analyse différentielle de l'expression génique (DE) et de la voie sur des échantillons appariés de scRNA-seq frais versus cryoconservés dissociés avec le protocole de collagénase en une étape (Suppl. Tableau 2 et 3a + b).

Des études antérieures indiquent que 10 à 50 % du transcriptome est affecté par la dissociation27. Par conséquent, des traitements de dissociation similaires pour tous les types de cellules, comme dans le protocole de collagénase en une étape, réduiront le DE entre les cellules induit par les traitements de dissociation différentielle. Pour quantifier l'effet du traitement différentiel, nous avons effectué une analyse DE sur les cellules épithéliales capturées dans la fraction EL vs LP de Smillie et al. jeu de données17. L'étude de ces cellules épithéliales présentes dans les deux fractions du protocole en deux étapes permet de quantifier l'effet du traitement différentiel entre la fraction EL (EDTA uniquement) et LP (EDTA, suivie de collagénase). Cette analyse DE a révélé 222 gènes DE, dont 34 ont été précédemment décrits comme étant induits par la collagénase dans les cellules souches musculaires dissociées par la collagénase de souris15. Notamment, chacun de ces 34 gènes induits par la collagénase a été trouvé régulé positivement dans la fraction LP (c'est-à-dire la fraction traitée avec la collagénase). Ensemble, cette analyse révèle un effet de lot clair entre les fractions EL et LP qui a été induit par le traitement différentiel et indique un enrichissement pour les gènes induits par la collagénase précédemment décrits (34/222 gènes induits par la collagénase dans la liste des gènes DE par opposition à 104/3947 qui étaient dans les gènes non-DE, Fisher Exact p <0,00001). C'est cet effet batch du traitement différentiel qui est contourné par le protocole collagénase en une étape.

Nous avons comparé les cellules épithéliales traitées à la collagénase du protocole en une étape d'une part avec les cellules traitées à l'EDTA de la collagénase en deux étapes d'autre part avec les cellules traitées à l'EDTA + protéase + collagénase du protocole de protéase. Nous avons constaté que les cellules épithéliales du protocole de collagénase en une étape montrent une régulation à la hausse de 95 (10 % du total des gènes DE) et de 60 (7 % du total des gènes DE) gènes connus induits par la collagénase16 (Suppl. Tableau 3a), respectivement, y compris des gènes tels que FOS et JUN (Suppl. Tableau 3a + b, Suppl. Figure 5). Parmi ces 95 et 60 gènes DE, seuls 13 gènes induits par la collagénase se chevauchent, ce qui indique que la collagénase n'est peut-être pas le seul facteur contribuant aux différences d'expression génique ici.

Les cellules immunitaires (cellules myéloïdes, lymphocytes B et T) ont révélé des nombres de gènes DE majoritairement similaires entre le protocole de collagénase en une étape et les protocoles en plusieurs étapes, à l'exception des cellules B. Dans ces cellules, nous avons observé une grande différence dans le nombre de gènes régulés à la hausse par rapport aux gènes régulés à la baisse dans les protocoles de collagénase en une étape par rapport à plusieurs étapes ; 976 gènes sont régulés négativement dans le protocole en deux étapes par rapport au protocole de collagénase en une étape, tandis que 90 gènes sont régulés positivement (Suppl. Tableau 3a).

Remarquablement, les cellules myéloïdes et B présentent la plus forte proportion de gènes induits par la collagénase régulés positivement dans la collagénase en une étape par rapport au protocole de protéase en trois étapes (27 % et 25 %, respectivement) (Suppl. Tableau 3a)16. Cela indique que ces types de cellules peuvent être les plus sensibles au temps de digestion de la collagénase, influençant éventuellement la composition du sous-type cellulaire du type cellulaire, par exemple principalement des cellules plasmatiques par rapport à la plupart des cellules B (Suppl. Figure 4). Il existe une tendance à une proportion plus élevée de lymphocytes B et à une proportion plus faible de plasmocytes dans la protéase par rapport aux cellules digérées par la collagénase en une étape dans le FACS, ce qui appuie cette théorie (Suppl. Figure 4). De plus, cela implique que de nombreux gènes sont affectés par d'autres facteurs que l'enzyme utilisée pour la digestion, tels que la durée de la digestion et les différences de température.

Dans l'ensemble, la couche de lamina propria du protocole de collagénase en deux étapes, qui est traitée avec de la libérase contenant de la collagénase I + II, contient la plupart des cellules myéloïdes (Fig. 4, Suppl. Tableau 6). Cependant, nous nous attendions à des proportions similaires de cellules myéloïdes dans les biopsies dissociées à la collagénase en une étape traitées à la collagénase IV, car la digestion enzymatique et sa durée sont par ailleurs comparables. Il a été démontré que les enzymes de dissociation influencent l'efficacité de la dissociation des sous-types cellulaires28. Le nombre de cellules myéloïdes inférieur dans le protocole de collagénase en une étape par rapport au protocole de collagénase en deux étapes peut être le résultat de la cryoconservation des échantillons dissociés de la collagénase en une étape20 (Fig. 4, Suppl. Tableau 6).

Parmi les voies régulées à la hausse dans les lymphocytes T après digestion par la collagénase en une étape par rapport à la digestion par la protéase en trois étapes, la « signalisation par les interleukines » et les « réponses cellulaires aux stimuli externes » apparaissent, suggérant que le protocole de la collagénase chaude peut activer indirectement les cellules T, ou que la digestion par la protéase froide peut empêcher l'activation des cellules immunitaires pendant l'isolement (Suppl. Tableau 3b).

Les fibroblastes ont montré le plus de gènes DE dans les deux comparaisons avec le protocole en une étape : 2 184 gènes étaient DE avec le protocole de collagénase en deux étapes et 1 833 avec le protocole de protéase en trois étapes. Cependant, il est intéressant de noter que parmi ces gènes DE, il n'y avait qu'une petite fraction de gènes induits par la collagénase (8% et 10%, respectivement) (Suppl. Tableau 3a). Cela implique que les fibroblastes ne sont pas nécessairement sensibles au traitement à la collagénase, mais probablement que d'autres produits chimiques utilisés pour la dissociation ont un impact plus important (c'est-à-dire l'EDTA).

Pour démontrer la faisabilité de la collecte de cellules individuelles viables et fonctionnelles après la digestion en une étape par la collagénase sur des biopsies cryoconservées, nous avons démontré que les organoïdes intestinaux (Suppl. Figure 8A) et les IEL (Suppl. Figure 8B–C) peuvent être propagés avec succès à partir des cellules restantes après scRNA-seq. Pour la propagation IEL, les cellules restantes ont été triées par FACS et cultivées pendant 10 jours. De cette manière, les IEL pourraient être expansés jusqu'à 30 fois à partir du matériel de départ tout en conservant leur phénotype (Suppl. Figure 6). Ces résultats soulignent la possibilité d'étudier à la fois la fonctionnalité et l'expression génique des cellules des mêmes échantillons à l'aide de biopsies cryoconservées. Au total, ces résultats ouvrent la possibilité de concevoir des expériences d'omiques unicellulaires suivies d'une validation expérimentale à partir du même matériel biologique, réduisant ainsi les effets de lot et facilitant la récupération de plusieurs couches d'informations à partir d'échantillons ayant le même contexte génétique et environnemental.

Dans cette étude, nous présentons un protocole de digestion par biopsie intestinale à la collagénase en une étape comme alternative bien fondée à la dissociation actuelle de la collagénase en deux étapes17,19,29 et à la dissociation de la protéase en trois étapes [adapté de22 et23]. Les principaux avantages de ce protocole en une étape sont la réduction du temps, du coût et de la procédure, la prévention des effets de lot associés à la dissociation séquentielle des différents compartiments dans les protocoles en plusieurs étapes, combinés à un haut niveau de reproductibilité et de flexibilité expérimentale (Fig. 5). En outre, nous montrons que ce protocole génère des cellules individuelles viables, également après cryoconservation, qui conviennent aux études fonctionnelles utilisant des organoïdes ou à l'analyse en aval à l'aide de scRNA-seq ou FACS.

Arbre de décision pour la dissociation unicellulaire du tissu intestinal pour le scRNA-seq. (A) Organigramme conçu pour aider les chercheurs à choisir un protocole de dissociation pour le tissu intestinal en fonction de leurs besoins spécifiques. (B) Aperçu des principales différences entre les protocoles. IEL, cellule intraépithéliale ; CE, cellule épithéliale ; EL, couche épithéliale ; LP, lamina propria ; F1, fraction 1 ; F2, fraction 2.

La cryoconservation des biopsies permet un traitement plus efficace et, par conséquent, un nombre réduit de lots expérimentaux. Comme le matériel de biopsie frais est rarement prélevé sur plusieurs donneurs en même temps, le matériel frais est généralement traité un échantillon à la fois. En revanche, la cryoconservation augmente considérablement le nombre d'échantillons pouvant être traités simultanément, ainsi que le mélange d'échantillons provenant de différents moments et patients ; avec le protocole de collagénase en une étape, on peut traiter 8 échantillons par personne en 1 h. En outre, la cryoconservation permet d'attendre les rapports de pathologie du tissu (adjacent), ainsi que d'enquêter sur l'état d'inflammation ou de malignité des échantillons avant le traitement des échantillons. Cela peut être très avantageux lors de l'étude longitudinale des mêmes patients et en essayant de capturer des échantillons autour d'un événement clinique associé spécifique. Cette sélection ciblée d'échantillons peut limiter le traitement d'échantillons inappropriés, limitant ainsi davantage les coûts. Auparavant, la cryoconservation s'est avérée aboutir à des cellules viables adaptées au scRNA-seq dans divers tissus, tels que les tissus rénaux30, pancréas31 et synoviaux32. A notre connaissance, pour la muqueuse intestinale, une telle étude n'a pas encore été menée. De plus, Konnikova et al. ont montré que la cryoconservation de la muqueuse intestinale préserve une viabilité et une fonctionnalité cellulaires élevées, ce qui implique l'adéquation du tissu de muqueuse intestinale cryoconservé pour le scRNA-seq20. Dans le nombre limité de deux échantillons appariés, nous voyons qu'au-delà de la bonne viabilité et fonctionnalité des cellules, la cryoconservation n'a que des effets mineurs sur la composition du type cellulaire et l'expression des gènes et convient à une utilisation dans l'analyse scRNA-seq.

Malgré les avantages évidents de la cryoconservation des échantillons et de l'utilisation des protocoles en une étape par rapport aux protocoles en plusieurs étapes, il existe des cas spécifiques dans lesquels d'autres configurations expérimentales sont plus optimales. Par exemple, un protocole de dissociation en plusieurs étapes peut être préférable pour optimiser le rendement des types de cellules spécifiques à la couche, ou lorsque les protéines de surface pour marquer ces types de cellules uniquement présentes dans une certaine couche ne sont pas disponibles. De plus, alors que la cryoconservation apporte de nombreux avantages, la perte de cellules myéloïdes dicte l'utilisation de matériel frais lorsqu'il s'agit du principal type de cellule d'intérêt.

En résumé, lors du choix d'un protocole de dissociation, il faut peser de nombreux facteurs, y compris la composition cellulaire, la viabilité cellulaire et les effets de lot. Selon les questions de recherche posées, l'importance de ces facteurs pourrait être modifiée. Par conséquent, la meilleure approche de dissociation pour toutes les situations possibles n'existe pas. Sur la base des comparaisons de cette étude, nous avons développé un outil de décision de protocole, qui peut guider les scientifiques à travers plusieurs questions dans un arbre de décision pour aider à décider de la stratégie de dissociation optimale pour leur configuration expérimentale et leurs questions (Fig. 5).

En propageant des cellules épithéliales et immunitaires à l'aide de cellules cryoconservées et dissociées, nous avons montré la polyvalence du protocole en une étape pour une utilisation dans d'autres expériences que scRNA-seq. Nous pensons que plusieurs couches de données peuvent être obtenues à partir du même matériel biologique, permettant l'application à la fois de validations fonctionnelles et de techniques à haut débit. Par exemple, sur la base de nos résultats montrant la présence de marqueurs de surface après la dissociation des cellules à l'aide de protéase ou de collagénase, les cellules peuvent être utilisées dans une méthode étudiant à la fois le marqueur de surface et la transcription d'une seule cellule, comme CITE-seq. Une autre méthode qui peut être appliquée est CyTOF, qui permet l'exploration d'environ 40 marqueurs de surface cellulaire en même temps dans des millions de cellules, permettant l'identification de marqueurs de surface de types cellulaires (rares)33. Comme démontré, si elles sont manipulées correctement, les cellules peuvent être isolées et propagées, permettant ainsi une analyse fonctionnelle plus poussée. Dans l'ensemble, le protocole de dissociation de la collagénase en une étape présenté ici à l'aide de biopsies cryoconservées peut avoir des répercussions positives en médecine personnalisée. Premièrement, des tissus spécifiques dans un contexte pathologique peuvent être profondément caractérisés pour identifier les types de cellules pathogènes. Deuxièmement, ces cellules pathogènes permettraient de découvrir de nouvelles cibles médicamenteuses pour des thérapies et pourraient même être utilisées pour évaluer l'efficacité de tels médicaments34.

L'une des limites de tous les protocoles de dissociation cellulaire est que la configuration spatiale des cellules est perdue. Comme mentionné ci-dessus, l'intestin est un tissu complexe où l'emplacement joue un rôle majeur dans la détermination du comportement de cellules spécifiques. Actuellement, il existe de nouveaux développements tels que la cytométrie de masse par imagerie35 et la transcriptomique spatiale36,37, qui peuvent aider à étudier la localisation des cellules dans le tissu. En conjonction avec des techniques multi-omiques unicellulaires profondes, la caractérisation de l'interactome de l'intestin dans des maladies complexes peut ouvrir les portes à de nouvelles avancées en médecine.

En plus des méthodes de dissociation unicellulaire comparées dans ce manuscrit, les méthodes d'isolement à un seul noyau pourraient devenir une alternative appropriée pour éviter les effets de lot associés à la méthode de dissociation ou dans le cas où seul le tissu congelé est disponible38,39. Lorsque l'on compare le transcriptome nucléaire avec le transcriptome cytoplasmique de cellules individuelles, les corrélations sont élevées, mais le nombre d'UMI capturés dans les noyaux restera toujours une fraction de ce qui peut être capturé dans une seule cellule40,41. En plus de cela, il n'existe actuellement aucun protocole capable d'isoler efficacement les noyaux de scRNA-seq à partir de la grande variété de types de cellules résidant dans le tissu hautement hétérogène de l'intestin. Néanmoins, lorsque de tels protocoles seront disponibles, ils pourraient devenir une alternative intéressante aux méthodes de dissociation unicellulaire cryoconservées.

Nous présentons un nouveau protocole de dissociation des tissus de la muqueuse intestinale qui permettra aux futurs scientifiques de mener des recherches planifiables à grande échelle (multicentriques) avec des effets de lot limités. Il y a eu peu d'études comparant les protocoles de dissociation pour la dissociation des tissus de la muqueuse intestinale, sans parler des scRNA-seq ultérieurs, ce qui souligne l'importance des résultats présentés ici. Compte tenu de la composition de la muqueuse intestinale, nous pensons que la méthodologie décrite dans cet article pourrait être un bon point de départ pour la dissociation et la cryoconservation d'autres tissus muqueux, tels que les poumons ou la muqueuse buccale, aux fins d'études de séquençage unicellulaire. De plus, les résultats peuvent inspirer des chercheurs d'autres domaines à s'interroger sur les facteurs influençant leurs données scRNA-seq.

Les biopsies ont été recueillies dans du RPMI1640 additionné de GlutaMax (Gibco) et de 5 % de FCS inactivé par la chaleur. Après collecte, ils ont été conservés sur glace pendant 30 min maximum. Les biopsies ont été soit utilisées directement pour la dissociation (fraîches), soit cryoconservées dans un milieu de congélation à froid (90 % de FCS inactivé par la chaleur avec 10 % de DMSO). La cryoconservation des biopsies et les procédures de décongélation ont été effectuées comme décrit précédemment20. En bref, les biopsies ont été rapidement (< 60 s) décongelées dans un bain-marie à 37 ° C et lavées deux fois avec une solution de décongélation froide (PBS sans MgCl2 et CaCl2, complété par 5% de FCS inactivé par la chaleur). Nous avons généré deux ensembles de données : un « ensemble de données de cryoconservation », utilisant des échantillons appariés de cryoconservation fraîche de 2 individus dissociés uniquement avec le protocole de collagénase en une étape, et un ensemble de données non apparié de « dissociation cellulaire », utilisant des biopsies intestinales de différents individus isolés à l'aide de tous les protocoles de dissociation décrits ci-dessous. Pour l'ensemble de données de «dissociation cellulaire», nous avons utilisé des cellules digérées par la collagénase en deux étapes de Smillie et al. jeu de données17.

Les biopsies ont été dissociées selon l'un de ces trois protocoles :

Protocole de collagénase en deux étapes, utilisant des biopsies fraîches et de la libérase contenant de la collagénase I + II et séparant la couche IEL et LPL, comme décrit précédemment17

Protocole de protéase en trois étapes, utilisant des biopsies fraîches et une protéase froide comme décrit précédemment, séparant F1 et F2 [adapté de22 et 23]

Protocole de collagénase en une étape, utilisant des biopsies cryoconservées et de la collagénase IV pour isoler les biopsies dans leur ensemble (WB) en une seule étape de digestion.

En bref, le protocole de collagénase en deux étapes incube des biopsies fraîches pendant 15 min dans du RPMI1640 avec de l'EDTA sur une grille de rôtisserie à 37 oC, après quoi une agitation complète élimine les couches épithéliales de la lamina propria. Ensuite, les couches fractionnées sont digérées séparément tout en tournant à 37 ° C pendant 30 min : la couche épithéliale est digérée avec TrypLE Express Enzyme (Gibco) et la couche lamina propria avec une préparation mixte de collagénase (Liberase TM).

Le protocole de protéase en trois étapes coupe d'abord les biopsies en petits morceaux. Par la suite, le mélange à la pipette dans du HBSS froid (4 ° C) additionné d'EDTA sépare la fraction 1, qui est principalement constituée de cellules immunitaires. Ceux-ci sont éliminés dans le surnageant et les cellules épithéliales et lamina propria restent dans des amas de tissus. La couche épithéliale et la lamina propria sont ensuite dissociées à l'aide d'une incubation de 30 min dans du HBSS avec de la protéase froide (4 ° C) et de l'EDTA, puis avec une digestion de collagénase de 10 min à température ambiante pour dissocier les touffes de tissus finaux (fraction 2). Toutes les cellules sont ensuite incubées avec un tampon de lyse ACK pour éliminer les cellules sous-viables avant deux derniers lavages.

Le protocole de collagénase en une étape incube les biopsies pendant 25 min à 37 °C dans un incubateur à agitation dans un milieu de digestion (RPMI1640 additionné de GlutaMax (Gibco), 200 UI/mL de collagénase IV C1889 (ThermoFisher), 10 UI/mL de DNAse II D8764 (ThermoFisher), 35 UI/mL de SUPERaseIn AM2694 (In vitrogène), 2 % de FCS inactivé par la chaleur). De manière optimale, 2 à 4 pincées-biopsies sont dissociées par 2,5 ml de milieu de digestion. Après 10 min d'incubation en milieu de digestion, les biopsies sont remises en suspension avec une pointe de pipette p1000. Si une biopsie ne digère pas bien (le rectum est généralement plus dur que l'iléon, le tissu fibreux peut être plus difficile), on peut le couper avec des ciseaux (nettoyés, stérilisés) et/ou couper la pointe de la pipette pour permettre une plus grande lumière de pipetage. Après 15 min supplémentaires d'incubation, les biopsies sont à nouveau filtrées à la pipette à l'aide d'une pointe p1000, suivie d'une pointe p200. Ensuite, la digestion est arrêtée en ajoutant 5 mM d'EDTA (Sigma) pendant 2 min sur de la glace. Ensuite, > 10 ml de RT PBS-/- est ajouté pour minimiser les effets résiduels des réactifs collagénase-EDTA, après quoi les cellules sont centrifugées pendant 5 min à 300 g à TA. Le culot est remis en suspension dans 100 ul de TrypLE Express Enzyme et incubé pendant 1,5 min dans un bain-marie à 37 °C. La réaction enzymatique est arrêtée en ajoutant du RPMI1640 froid avec 2 % de FCS inactivé par la chaleur et les cellules sont centrifugées pendant 5 min à 300 g à 4 °C. Ensuite, le culot est remis en suspension dans du tampon de lavage froid I (PBS -/- additionné de 0,4 % de BSA et de 10 UI/mL de DNase II) et filtré à travers un tamis cellulaire de 70 um. Pour maximiser la collecte de cellules, le filtre est lavé une fois de plus avec du tampon de lavage froid II (PBS -/- additionné de 0,4 % de BSA) et les cellules sont collectées après centrifugation pendant 5 min à 300 g à 4 °C.

Pour permettre le multiplexage, qui peut empêcher les effets induits par les différences entre les lots de séquences, les cellules dissociées d'échantillons séparés sont marquées avec des anticorps à code-barres ("hachage cellulaire") à l'aide d'anticorps hashtag oligo-conjugués TotalSeq-A (Biologend) conformément au protocole du fabricant [Stoeckius et al. 2018]. En bref, 400 000 cellules sont incubées pendant 30 min sur une plaque basculante sur de la glace avec 0,5 μg d'anticorps hashtag et 100 ul de tampon de coloration. Après cela, les cellules sont lavées deux fois avec du PBS-/- additionné de 0,4 % de BSA pour éliminer les hashtags en excès. Ce faisant, les échantillons cryoconservés, dissociés du protocole de collagénase en une étape, sont hachés séparément et regroupés par 4 échantillons par pool de 10 × voies. Des échantillons frais sont collectés, dissociés et chargés séparément dans une seule voie 10 ×.

La viabilité cellulaire a été déterminée avant le chargement sur un contrôleur de chrome 10X Genomics en colorant les cellules avec un réactif de coloration au bleu trypan (Sigma, T6146) 1: 1, et comptée à l'aide d'un hémocytomètre. Le % de viabilité a été calculé comme [nombre de cellules colorées] divisé par [nombre de toutes les cellules] * 100 %.

Les bibliothèques de hashtag et d'ADNc ont été générées à l'aide des instructions de Biolegend en combinaison avec le protocole accompagnant le kit de bibliothèque 10X Genomics (v2 et v3 pour le protocole de collagénase en une étape, et v3 et v3.1 pour le protocole de protéase en trois étapes, respectivement). Ces procédures de dissociation ont été comparées aux données précédemment publiées qui ont été recueillies à l'aide du protocole de collagénase en deux étapes17, générées à l'aide de la bibliothèque 10X Genomics prep v1 et v2. Les bibliothèques contenant des échantillons du protocole de collagénase en une étape ont été en partie séquencées chez BGI (Hong Kong) sur un Illumina NovaSeq6000 en utilisant un kit PE de 150 bp et sur un BGISEQ500 en utilisant un kit PE de 100 bp en utilisant des programmes personnalisés (28-8-150 bp et 100-8-150 bp, respectivement). Les bibliothèques ont été séquencées à une moyenne de 110 442 (SD 42 975) lectures par cellule pour les bibliothèques d'ADNc et 3 073 (SD 1 768) lectures par cellule pour les bibliothèques de hashtag. Les bibliothèques contenant des échantillons du protocole de protéase en trois étapes ont été séquencées au Sanger Institute (Hinxton, Royaume-Uni), en partie sur un kit HiSeq 4000 75 PE et en partie sur une machine NovaSeq S4 100 PE XP. Les bibliothèques de protéases ont été séquencées à une moyenne de 103 181 (SD 34 489) lectures par cellule pour la bibliothèque d'ADNc.

Les pipelines CellRanger v3.0.2 mkfastq et count ont été utilisés pour créer des fichiers FASTQ, aligner les lectures de séquençage sur le génome de référence hg19 pour les échantillons de collagénase en une étape et sur le génome de référence hg38 pour les échantillons de protéase, le filtrage des codes-barres cellulaires et UMI (identifiant moléculaire unique) et le comptage de l'expression génique par cellule. L'analyse des données en aval a été effectuée à l'aide de Seurat v3.1.4. La matrice de comptage a été filtrée pour les cellules contenant < 200 gènes et > 60 % de lectures mitochondriales. Les données de hashtag ont été normalisées à l'aide d'une transformation de rapport logarithmique centré et HTOdemux a été utilisé pour attribuer un identifiant de hashtag à chaque cellule. Seules des cellules uniques, identifiées par un hashtag, ont été sélectionnées pour une analyse plus approfondie.

Les grappes ont été définies à l'aide de différentes résolutions, visant à s'adapter aux types de cellules présentes dans les données. La classification des types de cellules a été effectuée en utilisant une approche en deux étapes. Tout d'abord, le package scPred42 a été utilisé pour former un modèle de prédiction SVM sur un sous-ensemble de 750 cellules par type de cellule des données sources du protocole de collagénase en deux étapes17, qui a été filtré et préparé en utilisant les mêmes étapes QC que celles décrites ci-dessus. Ce modèle a été utilisé pour prédire les types de cellules grossières pour les échantillons générés avec chacun des deux autres protocoles. Deuxièmement, les ensembles de données des trois protocoles ont été intégrés à l'aide de l'intégration SCTransform43, tout en régressant la proportion de gènes mitochondriaux et ribosomiques. Les 30 premiers composants principaux de cet ensemble de données intégré ont été utilisés pour le regroupement de cellules à l'aide de la fonction FindCluster de Seurat et un UMAP a été utilisé pour visualiser cela. Des marqueurs spécifiques de type cellulaire pour les types cellulaires résultants sont décrits dans Suppl. Figure 9.

L'ensemble de données de cryoconservation a été utilisé pour évaluer l'effet de l'utilisation fraîche par rapport à la cryoconservation sur les paramètres de base de la qualité du séquençage. Tout d'abord, nous avons fait un aperçu des paramètres de séquençage de 1 des échantillons frais de l'ensemble de données de cryoconservation par rapport à 1 échantillon cryoconservé apparié de l'ensemble de données de cryoconservation et 5 échantillons cryoconservés également traités de notre laboratoire.

Ensuite, pour les ensembles de données de cryoconservation et de dissociation, nous avons évalué la qualité des données en interrogeant la relation entre le nombre de gènes exprimés et le nombre d'UMI présents dans chaque ensemble de données. Deuxièmement, nous avons visualisé l'expression des gènes mitochondriaux par rapport au nombre d'UMI présents dans l'ensemble de données.

L'analyse DE a été effectuée à l'aide de MAST via la fonction FindAllMarkers de Seurat44. Pour cela, à l'échelle de la bibliothèque (10 000 transcrits par cellule), les données d'expression d'ARN transformées en log-2 ont été utilisées comme entrée. Seuls les gènes présents dans au moins 10% des cellules appartenant à l'un ou l'autre des clusters étudiés et avec un changement de facteur logarithmique d'au moins 0,25 ont été testés. Seules les comparaisons de > 100 cellules par groupe ont été incluses dans les analyses, et seuls les gènes présents dans tous les groupes comparés ont été inclus dans les analyses de voie ultérieures.

Pour évaluer l'influence du traitement à la collagénase sur l'expression des gènes, les cellules épithéliales de Smillie et al. dataset17 dérivant de la première et de la deuxième étape du protocole, respectivement, ont été comparés. Tout d'abord, les cellules ont été des sous-ensembles de l'ensemble de données principal. Étant donné que les différences de taille entre les deux étapes pourraient fausser l'analyse, les cellules ont été sous-échantillonnées à un nombre correspondant de 2617 cellules par étape de dissociation. L'analyse de l'expression différentielle a été effectuée comme décrit ci-dessous, et les gènes résultants ont été scannés pour un chevauchement avec un ensemble de 140 gènes induits par la collagénase15. Le test exact de Fisher a été effectué pour évaluer si les gènes exprimés de manière différentielle étaient enrichis en gènes induits par la collagénase.

Les voies régulées à la hausse par cluster ont été déterminées à l'aide du package ReactomePA45, avec la base de données des voies Reactome (https://reactome.org/). Tout d'abord, les symboles génétiques des gènes régulés positivement ont été convertis en identifiants Entrez, puis les voies enrichies à la valeur p ajustée < 0,05 ont été calculées.

Des suspensions de cellules individuelles ont été colorées avec l'un des trois panels d'anticorps, comme illustré dans le tableau supplémentaire 4. En bref, les cellules ont été centrifugées à 300 g pendant 5 min, puis remises en suspension dans 100 μL de PBS additionné de 2 % de FCS. Ensuite, les cellules ont été colorées pendant 30 min à 4 ° C, après quoi elles ont été lavées deux fois et remises en suspension dans 400 μL de PBS additionné de 2 % de FCS. Les données FACS ont été générées à l'aide du système BD LSR-II (BD Bioscience) et analysées à l'aide de FlowJo v10 en suivant la stratégie de déclenchement comme indiqué dans Suppl. Figure 9.

Les cellules ont été colorées à l'aide d'un colorant de viabilité comme illustré dans le tableau supplémentaire 4. Les cellules mortes ont été déterminées par une stratégie de déclenchement comme illustré dans Suppl. Figure 9.

Les organoïdes ont été générés à l'aide de cellules dissociées avec le protocole de collagénase en une étape. Les cellules qui restaient après le chargement de la puce 10 × pour scRNA-seq ont été utilisées pour la culture organoïde. Les cellules ont été lavées avec 10 ml de milieu HGF. Les cellules ont été centrifugées pendant 5 minutes à 1000 tr/min à 4°C et le surnageant a été éliminé. 15 ul de matrigel ont été ajoutés au culot, qui a été étalé dans une plaque à 96 puits. La plaque a été incubée 15 min à l'envers dans un incubateur à 37°C. 200 ul de milieu EM avec de la primocine ont été ajoutés (1:500) aux puits. Les organoïdes ont été expansés jusqu'à ce que la densité souhaitée pour la congélation dans l'azote liquide soit atteinte.

Les cellules IEL (CD45 + CD3 + TCRαβ + CD8αβ + CD103 +) ont été isolées du tissu intestinal et développées in vitro selon le protocole46. En bref, les cellules dissociées de l'intestin avec le phénotype IEL ont été triées sur un trieur de cellules Beckman Coulter MoFlo Astrios. Les IEL ont été cultivés dans du RPMI avec 10 % de sérum AB humain (Sigma Aldrich, H4522), 0,1 % d'IL-2 (RD System, AE5916003), 0,1 % de pPHA-L (Sigma, L2769-2MG) et un mélange de cellules nourricières composées de PBMC irradiés et de cellules B transformées par le virus d'Epstein-Barr provenant de 3 donneurs différents. Des mélanges de cellules nourricières ont été préparés dans un rapport de 10 PBMC : 1 EBV : 1 cellule CD8+. Les cellules ont ensuite été propagées pendant 10 jours et analysées par FACS pour confirmer la pureté des cellules.

Le matériel biologique a été obtenu des patients selon des protocoles approuvés par les comités d'éthique régionaux (Comité d'éthique médicale du Centre médical universitaire de Groningen et de l'Est de l'Angleterre, Comité d'éthique de la recherche de Cambridge South), et les personnes faisant don de matériel ont donné leur consentement éclairé écrit. Les protocoles expérimentaux ont été approuvés par le comité d'éthique médicale de l'University Medical Center Groningen (NL58808.042.16, NL24572.018.08) et East of England, Cambridge South Research Ethics Committee (17/EE/0338).

Les ensembles de données générés pendant et/ou analysés pendant l'étude en cours sont disponibles dans le référentiel MOLGENIS47, https://downloads.molgeniscloud.org/downloads/singelcell_methodspaper/. Les fichiers FACS supportant cette étude sont disponibles sur demande auprès des auteurs.

Tout le code est disponible via GitHub : https://github.com/WeersmaLabIBD/SingleCell/tree/master/Method_comparisons.

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Nous remercions Kate Mc Intyre pour l'édition du manuscrit. Nous remercions Tjasso Blokzijl, pour ses efforts dans la génération d'organoïdes, pour le partage de ses protocoles et images des produits organoïdes. Nous remercions Joram Mooiweer et Fulya Doganay pour leurs efforts dans l'isolement et l'expansion des cellules IEL.

Le WTCUV est soutenu par une subvention de recherche sans restriction de Takeda. ADRS est soutenu par la bourse CONACYT-I2T2 (n° 459192). IJ est soutenu par une bourse Rosalind Franklin de l'Université de Groningue et une subvention VIDI de l'Organisation néerlandaise pour la recherche scientifique (NWO) (n° 016.171.047). SW a été soutenu par The Netherlands Organ-on-Chip Initiative, un projet NWO Gravitation (024.003.001) financé par le ministère de l'Éducation, de la Culture et des Sciences du gouvernement des Pays-Bas. RKW est soutenu par des subventions de recherche sans restriction de Takeda, Johnson and Johnson, Tramedico et Ferring 37 Pharmaceutical Company, en outre, il est consultant pour Takeda Pharmaceuticals. LF est soutenu par des subventions de recherche sans restriction de Takeda, une subvention Oncode Investigator et une subvention NWO Vici (n ° 917.14.374). L'EAMF est soutenue par une subvention de recherche sans restriction de Takeda, une bourse de recherche clinique de ZonMW et une subvention Gastrostart de la Société néerlandaise de gastroentérologie. MGPvdW est soutenu par une subvention NWO Veni (n° 192.029).

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Werna TC Uniken Venema et Aarón D. Ramírez-Sánchez.

Département de gastro-entérologie et d'hépatologie, Université de Groningue, Centre médical universitaire de Groningue, Groningue, Pays-Bas

Verna TC Uniken Venema, Emilia Bigaeva, Rinse K. Weersma & Eleonora AM Festen

Département de génétique, Université de Groningen, University Medical Center Groningen, Groningen, Pays-Bas

Werna TC Uniken Venema, Aarón D. Ramírez-Sánchez, Sebo Withoff, Iris Jonkers, Lude Franke & Monique GP van der Wijst

Wellcome Sanger Institute, Hinxton, Cambridgeshire, CB10 1SA, Royaume-Uni

Rebecca E. McIntyre et Mennatallah Ghouraba

Département de gastroentérologie, Addenbrooke's Hospital, Cambridge University Hospitals NHS Foundation Trust, Cambridge, Royaume-Uni

Tim Rain

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WTCUV, ADRS, EVB, REM, MG et MGPvdW ont réalisé des expériences en laboratoire humide. RKW, EAMF et TR ont fourni des échantillons. WTCUV, ADRS, EAMF et MGPvdW ont conçu et rédigé le manuscrit. SW et IHJ ont participé à la rédaction et à la révision du manuscrit. LF, RKW et EAMF ont fourni l'acquisition du soutien financier pour le projet menant à ce manuscrit. WTCUV et ADRS ont effectué les analyses statistiques. Tous les auteurs ont participé à la rédaction du manuscrit.

Correspondance avec Eleonora AM Festen ou Monique GP van der Wijst.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Uniken Venema, WTC, Ramírez-Sánchez, AD, Bigaeva, E. et al. Les protocoles de dissociation de la muqueuse intestinale influencent les proportions de types cellulaires et les niveaux d'expression des gènes unicellulaires. Sci Rep 12, 9897 (2022). https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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Reçu : 19 janvier 2021

Accepté : 27 mai 2022

Publié: 14 juin 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-13812-y

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