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Mar 17, 2023

La streptozotocine induit une lésion tubulaire proximale rénale par l'activation de la signalisation p53

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 8705 (2023) Citer cet article

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La streptozotocine (STZ), un médicament anticancéreux principalement utilisé pour traiter les tumeurs neuroendocrines (TNE) en milieu clinique, est incorporée dans les cellules β pancréatiques ou les cellules épithéliales tubulaires proximales via le transporteur de glucose, GLUT2. Cependant, ses effets cytotoxiques sur les cellules rénales ont été sous-estimés et les mécanismes sous-jacents restent flous. Nous avons démontré ici que les dommages à l'ADN et la signalisation ultérieure de p53 étaient responsables du développement de lésions épithéliales tubulaires induites par la STZ. Nous avons détecté des lésions de l'ADN épithélial tubulaire chez des patients TNE traités par STZ. La transcriptomique impartiale des cellules épithéliales tubulaires traitées au STZ in vitro a montré l'activation de la voie de signalisation p53. La STZ a induit des dommages à l'ADN et activé la signalisation p53 in vivo de manière dose-dépendante, entraînant une réduction des transporteurs membranaires. L'inhibition pharmacologique de p53 et du transporteur sodium-glucose 2 (SGLT2) a atténué les lésions épithéliales induites par la STZ. Cependant, les effets cytotoxiques de la STZ sur les cellules β pancréatiques ont été préservés chez les souris traitées avec l'inhibiteur du SGLT2. Les présents résultats démontrent la cytotoxicité spécifique des tubules proximaux de la STZ et les mécanismes sous-jacents in vivo. Étant donné que les effets cytotoxiques de la STZ contre les cellules β n'ont pas été altérés par la dapagliflozine, le prétraitement avec un inhibiteur du SGLT2 a un potentiel en tant que remède préventif pour les lésions rénales chez les patients TNE traités avec la STZ.

La streptozocine/streptozotocine (STZ), un analogue du glucose, est classée comme un médicament anticancéreux d'agents alkylants et est l'une des principales classes de médicaments cytotoxiques qui sont principalement utilisés pour traiter les tumeurs neuroendocrines (TNE)1,2. La STZ est incorporée dans les cellules β pancréatiques par le biais du transporteur de glucose de type 2 (GLUT2), favorisant ainsi les dommages à l'ADN, la production d'espèces réactives de l'oxygène (ROS), le dysfonctionnement mitochondrial et l'apoptose subséquente3,4,5. Sur la base des résultats des essais cliniques, la combinaison de STZ et de 5-fluorouracile est couramment utilisée pour traiter les patients atteints de TNE bien différenciées6,7.

En raison de la forte expression de GLUT2 dans le foie et les reins, des effets secondaires courants de la STZ se produisent dans ces organes2,8. Outre un dysfonctionnement rénal, une hypophosphatémie et une glycosurie rénale se développent parfois chez les patients traités par STZ9. La glycosurie non diabétique ou l'hypophosphatémie due à l'hyperphosphaturie est causée par une diminution des transporteurs sodium-glucose ou des co-transporteurs sodium-phosphate, respectivement, qui sont principalement exprimés au niveau de la membrane apicale des cellules épithéliales tubulaires proximales. Étant donné que la perte ou la diminution des transporteurs membranaires de la bordure en brosse est une réponse initiale à une lésion rénale aiguë10,11,12,13, la glycosurie ou l'hypophosphatémie après le traitement par STZ peut refléter la lésion tubulaire proximale latente, qui est sous-estimée ou ignorée en milieu clinique.

Dans les champs expérimentaux, la STZ est couramment utilisée comme agent diabétogène pour détruire les cellules β pancréatiques, entraînant le développement du diabète de type 114,15. Cependant, dans les analyses des phénotypes rénaux chez les souris diabétiques de type 1 induites par STZ, une préoccupation potentielle est la toxicité rénale induite par l'administration de STZ14,15,16. Une autre préoccupation est que la sensibilité aux STZ varie selon les types de rongeurs et les antécédents génétiques15. Par conséquent, l'optimisation de la dose ou du calendrier d'administration de STZ peut prévenir sa néphrotoxicité15 ; cependant, des difficultés sont associées à l'établissement si les phénotypes rénaux chez les souris diabétiques de type 1 induites par STZ sont attribués à une glycémie élevée ou à une cytotoxicité directe par STZ16.

Compte tenu de l'utilisation accrue de la STZ pour traiter les TNE, une compréhension plus détaillée des mécanismes sous-jacents de la toxicité rénale de la STZ est essentielle pour prévenir ses effets indésirables. Bien que des découvertes expérimentales sur la néphrotoxicité induite par la STZ aient déjà été rapportées16,17,18,19, les mécanismes moléculaires sous-jacents restent flous. Dans la présente étude, nous avons effectué une transcriptomique impartiale sur des cellules épithéliales tubulaires traitées par STZ in vitro ainsi que dans des expériences in vivo, en mettant l'accent sur les dommages à l'ADN et la signalisation p53 ultérieure.

Nous avons initialement examiné les phénotypes rénaux de huit patients TNE traités par STZ dans notre établissement. L'âge moyen et les taux de créatine sérique étaient de 62,0 ± 10,9 ans et de 0,87 ± 0,12 mg/dl, respectivement (tableau supplémentaire 1). Un patient a développé un diabète après un traitement STZ en raison de la résection chirurgicale d'une tumeur du pancréas. En comparaison avec la glycémie au moment du prélèvement d'urine, 7 patients sur 8 présentaient une glycémie insuffisamment positive. Cinq patients sur 7 et 6 patients sur 7 présentaient respectivement un faible taux de phosphore sérique et un faible taux d'acide urique (tableau supplémentaire 1). L'histologie rénale a été évaluée chez 2 patients. La coloration au PAS et au trichrome de Masson a montré une fibrose interstitielle modérée et une lésion tubulaire caractérisée par la perte de la bordure en brosse et des cellules épithéliales tubulaires aplaties (Fig. 1). Les dommages à l'ADN étant l'une des principales physiopathologies parmi les effets cytotoxiques induits par la STZ, nous avons effectué une immunocoloration pour γH2AX, un marqueur des dommages à l'ADN. La coloration γH2AX a révélé une coloration nucléaire positive dans les cellules épithéliales tubulaires chez les patients, alors que ce n'était pas le cas chez le témoin non blessé (Fig. 1).

Dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales tubulaires chez les patients atteints de tumeur neuroendocrinienne (NET) traités par STZ. Images microscopiques d'échantillons de biopsie rénale humaine soumis à une immunocoloration pour γH2AX ainsi qu'à une coloration au PAS et au trichrome de Masson. Le nombre d'épithéliums tubulaires γH2AX + a été compté sur les images à fort grossissement de trois patients atteints d'une maladie de la membrane basale mince en tant que témoins sains et de deux patients TNE traités par STZ (n ° 1 et n ° 2). Les données sont des moyennes ± SD. Barre = 50 µm.

Nous avons examiné la réponse cytotoxique à la STZ dans les cellules NRK52E et avons constaté que la STZ réduisait la viabilité cellulaire de manière dose-dépendante (Fig. 2a). La qPCR a révélé que la STZ n'augmentait pas l'expression du marqueur de lésion tubulaire proximale Havcr1 (codant pour Kim-1), mais réduisait légèrement celle de certains marqueurs épithéliaux tubulaires matures Slc34a1 et Lrp2 (codant respectivement pour NaPi2a et la mégaline) (Fig. 2b). Pour identifier la signalisation cellulaire responsable de la cytotoxicité de la STZ, nous avons ensuite étudié les différences de transcriptome entre les cellules NRK52E traitées avec 10 mM de STZ ou de véhicule pendant 24 h par séquence d'ARN. Une analyse non supervisée de l'expression génique a révélé 266 gènes sur 18 930 qui présentaient une expression différentielle entre deux groupes (valeur de p corrigée du taux de détection erronée < 0, 05, changement de facteur absolu> 2) (Fig. 2c).

Régulation à la hausse de la signalisation p53 dans les cellules épithéliales tubulaires traitées à la STZ. ( a ) Le nombre de cellules NRK-52E viables a été réduit 24 h après le traitement STZ de manière dose-dépendante. (b) qPCR de l'ARN pour les marqueurs représentatifs des tubules blessés et sains. ( c ) La séquence d'ARN des cellules NRK-52E traitées par STZ. Les gènes mis en évidence sont des gènes exprimés de manière significativement différentielle inclus dans la voie de signalisation p53. ( d ) Analyse d'enrichissement des voies KEGG pour les gènes exprimés de manière différentielle entre les cellules non traitées et traitées à la STZ. Les 10 voies KEGG les plus significativement enrichies sont présentées. ( e ) Western blot de lysats de protéines de cellules NRK-52E pour γH2AX, phospho-p53, caspase-3 clivée et GAPDH. Images représentatives de n = 3. ( f ) Les densités optiques des bandes γH2AX, phosphore-p53 et caspase-3 clivées ont été normalisées par rapport à celle de GAPDH. Dans tous les groupes, les données sont des moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide d'un test t non apparié en (b) et le test post hoc de Dunnett a été utilisé pour les comparaisons multiples en (f). * p < 0,05.

Nous avons annoté l'expression des gènes à l'aide de la voie de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) et identifié 12 voies significativement enrichies (valeur p seuil <0, 05) (Fig. 2d). La voie de signalisation p53 était la plus fortement régulée dans les cellules traitées par STZ (Fig. 2d, Fig. 1 supplémentaire). Le transfert Western de lysats cellulaires a révélé que la STZ régulait à la hausse l'expression de γH2AX et la phosphorylation de p53 de manière dose-dépendante (Fig. 2e, f).

Pour déterminer si la STZ induit une lésion tubulaire in vivo, nous avons injecté diverses concentrations de STZ à des souris. Vingt-quatre heures après l'injection de STZ, la glycémie a diminué (Fig. 3a) et les taux d'insuline plasmatique ont augmenté chez les souris traitées avec la dose la plus élevée de STZ (Fig. 3b), reflétant la libération d'insuline à la suite de la mort des cellules β pancréatiques. Bien que le BUN sérique ne diffère pas entre les groupes expérimentaux (Fig. 3c), les reins des souris ayant reçu une seule injection de STZ présentaient une lésion tubulaire caractérisée par la perte de la bordure en brosse, qui était plus grave chez les souris traitées avec une dose plus élevée de STZ (Fig. 3d). La qPCR de l'ARN rénal entier a révélé la diminution de l'expression des marqueurs épithéliaux tubulaires matures Slc5a2 (codant pour SGLT2) et l'expression accrue de Havcr1 chez les souris traitées à la STZ (Fig. 3e). Nous avons également confirmé une réduction de l'immunocoloration de la mégaline chez les souris traitées à la STZ (Fig. 3d).

Lésion tubulaire dose-dépendante par STZ in vivo. (a) Diminution de la glycémie chez les souris traitées avec 200 mg/kg de STZ. (b) Les niveaux d'insuline plasmatique étaient plus élevés dans les groupes de traitement à forte dose de STZ. (c) Les niveaux de BUN ne différaient pas entre les groupes expérimentaux. ( d ) Des images microscopiques de tissu rénal avec coloration au PAS et immunocoloration pour la mégaline ont montré une augmentation des tubules avec la perte de la bordure en brosse et une diminution de l'expression de la mégaline chez les souris traitées à la STZ. ( e ) qPCR de l'ARN du tissu rénal pour les marqueurs représentatifs des tubules blessés et sains (transporteurs de sodium de la membrane apicale). Dans tous les groupes, les données sont des moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. N = 5 à 7 souris par groupe. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (c).

Nous avons examiné les dommages à l'ADN épithélial tubulaire et l'activation ultérieure de p53 in vivo. L'immunomarquage pour γH2AX a révélé une coloration nucléaire positive dans le tissu rénal des souris traitées avec la dose la plus élevée de STZ (Fig. 4a). La localisation de la coloration positive était limitée au cortex rénal, et non à la médulla rénale (Fig. 4a, b, Fig. 2 supplémentaire). La coloration par immunofluorescence avec Lotus Tetragonolobus Lectin (LTL), un marqueur de tubule proximal, a montré que la plupart des cellules positives γH2AX étaient co-colorées avec LTL, tandis que l'immunofluorescence pour Dolichos Biflorus Agglutinin (DBA), un marqueur du canal collecteur, a montré que les cellules positives γH2AX étaient rarement co-colorées avec DBA (Fig. 4c). Cela indique que les dommages à l'ADN induits par la STZ se produisent principalement dans les tubules proximaux corticaux. Pour confirmer les dommages à l'ADN induits par la STZ et élucider le type de dommages à l'ADN dans les reins, nous avons effectué un test de comète sur le tissu rénal entier. Le moment de la queue de la comète dans des conditions alcalines (une comète alcaline) reflète les cassures double brin (DSB) et les cassures simple brin (SSB) de l'ADN, tandis que celui dans des conditions neutres (une comète neutre) ne reflète que l'ADN DSB20. Les moments alcalins de la queue de la comète ont augmenté dans les cellules rénales des souris traitées à la STZ de manière dose-dépendante (Fig. 4a, d). Les moments de queue de comète neutre ont également augmenté dans les cellules rénales des souris traitées à la STZ de manière dose-dépendante ; cependant, la différence entre ces groupes était moindre pour les moments de queue de comète neutres (Fig. 4d). Ce résultat suggère que l'ADN DSB et SSB se sont produits dans les reins après l'administration de STZ de manière dose-dépendante. Nous avons également confirmé la régulation à la hausse de l'expression de γH2AX et de la phosphorylation de p53 dans les lysats de rein entier de souris traitées à la STZ de manière dose-dépendante (Fig. 4e, f).

Dommages à l'ADN dose-dépendants par STZ in vivo. ( a ) Images microscopiques de reins immunocolorés pour γH2AX et images représentatives du test de comète de cellules rénales isolées de souris 24 h après le traitement STZ. ( b ) Quantification séparée des cellules nucléaires γH2AX-positives dans le cortex rénal et la moelle épinière. ( c ) Images d'immunofluorescence de γH2AX et du marqueur épithélial tubulaire proximal (LTL) ou du marqueur du canal collecteur (DBA) chez les souris traitées à la STZ. (d) Une analyse quantitative (comète alcaline : n = 100 chacune, comète neutre : n = 50 chacune). ( e ) Western blot de lysats de tissus rénaux pour γH2AX, phospho-p53 et GAPDH. Images représentatives de n = 3. ( f ) Les densités optiques des bandes γH2AX et phospho-p53 ont été normalisées par rapport à celle de GAPDH. N = 5 à 7 souris par groupe. Dans tous les groupes, les données sont des moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (a) et 25 μm en (c).

Pour évaluer les lésions tubulaires induites par la STZ dans la phase subaiguë in vivo, nous avons prolongé la période d'observation à 7 jours après l'injection de STZ (Fig. 5a). Pour distinguer les lésions tubulaires induites par une glycémie élevée, nous avons administré de l'insuline glargine pour réduire la glycémie chez les souris injectées par STZ (Fig. 5a, b). Les taux plasmatiques d'insuline ont légèrement diminué chez les souris traitées à la STZ, mais il n'y avait pas de signification statistique (Fig. 5c). Le BUN sérique ne différait pas entre les groupes expérimentaux (Fig. 5d). Sept jours après l'injection d'une dose unique de STZ (150 mg/kg), les reins des souris présentaient une lésion tubulaire avec perte de la bordure en brosse ; cependant, aucune différence significative n'a été observée entre l'injection de STZ avec ou sans insuline (Fig. 5e). L'immunomarquage pour γH2AX a révélé une coloration nucléaire positive dans STZ avec ou sans insuline (Fig. 5e, f). La qPCR de l'ARN rénal entier a révélé l'expression légèrement diminuée des marqueurs épithéliaux tubulaires matures (Slc5a2, Slc34a1 et Lrp2), et aucun changement significatif dans l'expression de Havcr1 chez les souris traitées à la STZ (Fig. 5g). Ce résultat indique que la lésion tubulaire induite par la STZ s'est produite indépendamment des niveaux de glucose sanguin dans la phase subaiguë.

Glycémie indépendante des lésions tubulaires par STZ. (a) Schéma expérimental. Deux jours après le traitement à la STZ (150 mg/kg), de l'insuline glargine a été administrée à environ 200 mg/dl pour contrôler la glycémie, et les souris ont été sacrifiées au jour 7. (b) La glycémie a augmenté chez les souris traitées à la STZ, mais a été diminuée par l'administration d'insuline glargine. (c, d) Les taux plasmatiques d'insuline (c) et les taux d'urée (d) ne différaient pas entre les groupes expérimentaux. ( e ) Des images microscopiques de tissus rénaux colorés au PAS et immunocolorés pour γH2AX ont montré une augmentation des tubules avec la perte de la bordure en brosse et des cellules nucléaires positives pour γH2AX chez les souris traitées à la STZ avec ou sans insuline glargine. ( f ) Quantification séparée des cellules nucléaires γH2AX-positives dans le cortex rénal et la moelle épinière. ( g ) qPCR de l'ARN du tissu rénal pour les marqueurs représentatifs des tubules blessés et sains. Dans tous les groupes, les données sont des moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. N = 4 à 5 souris par groupe. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (e).

Sur la base de la régulation à la hausse de la signalisation de p53 dans les lésions tubulaires induites par STZ, nous avons examiné les effets préventifs de l'inhibition pharmacologique de p53 par la pifithrine-α (Fig. 6a). Des études antérieures ont démontré que la phlorizine, un inhibiteur du SGLT2, prévenait les lésions tubulaires induites par la STZ19. Par conséquent, nous avons également recherché si la pré-administration de dapagliflozine, un inhibiteur sélectif du SGLT2, inhibait les dommages à l'ADN induits par la STZ et les lésions tubulaires ultérieures (Fig. 6a). Les taux de glycémie et les taux de BUN ne différaient pas significativement entre les groupes expérimentaux (Fig. 6b, d). Les taux plasmatiques d'insuline ont augmenté chez les souris traitées avec STZ (Fig. 6c). Nous avons également évalué les dommages à l'ADN dans les reins. L'immunomarquage pour γH2AX a révélé que la coloration nucléaire positive induite par la STZ était améliorée par la dapagliflozine, mais pas par la pifithrine-α (Fig. 6e, f). Le test des comètes a montré que les augmentations des moments de queue de comète alcalins et neutres étaient légèrement atténuées par la dapagliflozine (Fig. 6g, h). Nous avons également confirmé que la régulation à la hausse induite par la STZ de l'expression de γH2AX était améliorée par la dapagliflozine, mais pas par la pifithrine-α. En revanche, la phosphorylation de p53 induite par la STZ a été améliorée par la pifithrine-α et la dapagliflozine (Fig. 6i, j).

L'inhibition pharmacologique de la signalisation p53 et le SGLT2 ont amélioré les dommages à l'ADN induits par la STZ in vivo. (a) Schéma expérimental. La pifithrine-α a été administrée en même temps que la STZ (150 mg/kg). La dapagliflozine a été administrée 2 h avant la STZ. Les souris ont été sacrifiées 24 h après l'administration de STZ. N = 5 à 11 souris par groupe. (b) Les taux de glycémie étaient similaires dans tous les groupes expérimentaux. (c) Les niveaux d'insuline plasmatique étaient plus élevés dans les groupes de traitement STZ. (d) Les niveaux de BUN ne différaient pas entre les groupes expérimentaux. ( e ) Images microscopiques de tissus rénaux immunocolorés avec γH2AX. ( f ) Quantification séparée des cellules nucléaires γH2AX-positives dans le cortex rénal et la moelle épinière. ( g ) Images représentatives du test de comète de cellules rénales isolées de souris et ( h ) une analyse quantitative (comète alcaline : n = 100 chacune, comète neutre : n = 50 chacune). (i) Western blots de lysats de tissus rénaux pour γH2AX, phospho-p53 et GAPDH. Images représentatives de n = 3. ( j ) Les densités optiques des bandes γH2AX et phosphore-p53 ont été normalisées par rapport à celle de GAPDH. Dans tous les groupes, les données sont les moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (e).

Dans une analyse histologique, la coloration PAS des reins a démontré que la lésion tubulaire induite par la STZ était améliorée par la pifithrine-α et la dapagliflozine (Fig. 7a). L'immunomarquage de la mégaline a montré que la pifithrine-α et la dapagliflozine préservaient l'expression de la mégaline chez les souris traitées à la STZ (Fig. 7a). La qPCR a révélé des diminutions de l'expression des marqueurs épithéliaux tubulaires matures (Slc5a2, Slc34a1 et Lrp2) qui n'ont pas changé chez les souris traitées avec la pifithrine-α ou la dapagliflozine (Fig. 7b). Cependant, l'expression accrue de Havcr1 par STZ était légèrement atténuée chez les souris traitées avec de la pifithrine-α ou de la dapagliflozine (Fig. 7b).

L'inhibition pharmacologique de la signalisation p53 et la lésion tubulaire induite par la STZ améliorée par le SGLT2 in vivo. ( a ) Images microscopiques de tissus rénaux colorés au PAS et immunocolorés pour la mégaline. ( b ) qPCR de l'ARN du tissu rénal pour les marqueurs représentatifs des tubules blessés et sains (transporteurs de sodium de la membrane apicale). Dans tous les groupes, les données sont les moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. N = 5 à 11 souris par groupe. * p < 0,05, barre = 50 μm dans les images de coloration PAS et 100 μm dans les images d'immunomarquage pour la mégaline en (c).

En ce qui concerne l'application clinique future de ces médicaments rénoprotecteurs contre les lésions rénales induites par la STZ, nous avons évalué les effets de la co-administration de STZ et de pifithrine-α ou de dapagliflozine sur les cellules des îlots pancréatiques. L'immunomarquage pour γH2AX a révélé une coloration nucléaire positive dans les îlots dans tous les groupes expérimentaux traités avec STZ (Fig. 8a). Le pourcentage de cellules γH2AX + était similaire parmi les groupes traités à la STZ (Fig. 8b). Ce résultat indique que les effets préventifs de la dapagliflozine sur les dommages à l'ADN ont été observés dans les reins, mais pas dans le pancréas, qui n'exprime pas SGLT2.

La STZ a induit des dommages à l'ADN des îlots pancréatiques. ( a ) Images microscopiques du pancréas immunocolorées pour γH2AX. Les pointes de flèches indiquent les noyaux γH2AX +. ( b ) Quantification séparée des cellules nucléaires γH2AX-positives dans les îlots pancréatiques. Dans tous les groupes, les données sont les moyennes ± SEM. Des analyses statistiques ont été effectuées à l'aide du test post hoc de Dunnett qui a été utilisé pour les comparaisons multiples. N = 5 à 11 souris par groupe. * p < 0,05, Bar = 50 μm en (a).

La présente étude a examiné les mécanismes sous-jacents aux lésions tubulaires induites par la STZ in vitro et in vivo. Une analyse transcriptomique a montré que la signalisation p53 était activée dans les cellules épithéliales tubulaires traitées à la STZ. La STZ a induit des dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales tubulaires de manière dose-dépendante, et sa localisation était limitée à l'intérieur du cortex rénal. L'inhibition pharmacologique de p53, ainsi que de SGLT2, a réduit les lésions tubulaires induites par la STZ, tandis que les effets cytotoxiques de la STZ sur les cellules des îlots pancréatiques ont été préservés. De plus, des dommages à l'ADN tubulaire étaient évidents dans les échantillons de biopsie rénale de patients TNE traités par STZ. Collectivement, ces résultats indiquent que les mécanismes sous-jacents à l'entrée de la STZ dans les cellules différaient entre les cellules épithéliales tubulaires proximales et les cellules β pancréatiques, ce qui a contribué à la différence de réponse à la STZ avec la co-administration d'un inhibiteur de SGLT2 ou de p53.

Nos résultats in vivo ont révélé une lésion tubulaire induite par la STZ, y compris la perte de transporteurs transmembranaires, qui était indépendante de la glycémie. Les phénotypes initiaux de lésion tubulaire proximale sont la perte de polarité cellulaire, l'arrêt du cycle cellulaire et la diminution des transporteurs membranaires, tels que NaPi2a et SGLT210,13. En général, lorsque la glycémie devient suffisamment élevée pour dépasser la capacité de réabsorption des tubules proximaux, une glycosurie commence à apparaître, généralement 250 à 300 mg/dl de glycémie chez des témoins sains non diabétiques21. Chez nos patients TNE, rien n'indiquait que la glycémie était suffisamment élevée pour provoquer l'apparition d'une glycosurie, suggérant une anomalie de la capacité de réabsorption tubulaire. De plus, bien que les résultats antérieurs sur la néphropathie diabétique aient été obtenus à l'aide d'un modèle de diabète de type 1 induit par la STZ14,15, les lésions tubulaires proximales latentes ont été sous-estimées16. Des études antérieures ont montré que l'arrêt du cycle cellulaire ainsi que la diminution de l'expression de SGLT2 se produisaient après l'administration de STZ22,23,24. Sur la base de la régulation à la hausse compensatoire de SGLT2 pour augmenter la réabsorption du glucose dans d'autres modèles de souris diabétiques23, la régulation à la baisse de SGLT2 après l'administration de STZ indique une lésion tubulaire proximale latente.

Notre transcriptomique impartiale a révélé que la signalisation p53 était régulée positivement dans les lignées cellulaires épithéliales tubulaires traitées à la STZ. Nous avons également constaté que la STZ induisait la phosphorylation de p53 de manière dose-dépendante in vivo et in vitro. Il convient de noter que, contrairement aux rapports précédents démontrant la régulation à la hausse de p53 dans les tissus rénaux et hépatiques dans la phase chronique après le traitement à la STZ, il a été constaté que la p53 était régulée à la hausse dans l'épithélium tubulaire dans la phase aiguë après l'administration de STZ. p53, une protéine suppresseur de tumeur, est un élément clé de la réponse cellulaire au stress, y compris les dommages à l'ADN, l'expression d'oncogènes, l'hypoxie, les ROS et la privation de nutriments27. Après sa phosphorylation, p53 se transloque vers le noyau et active de manière transcriptionnelle un large éventail de gènes liés au cycle cellulaire, à l'apoptose, à l'autophagie et au métabolisme27. Nous avons détecté des dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales tubulaires d'une manière dépendante de la dose de STZ et avons montré qu'ils persistaient pendant 1 semaine après l'injection de STZ, quel que soit le taux de glucose sanguin. Des études antérieures ont identifié p53 activé dans les cellules épithéliales tubulaires comme un phénotype du diabète de type 1 induit par la STZ28, cependant, les dommages à l'ADN induits par la STZ, et non une glycémie élevée, peuvent avoir contribué à ces phénotypes.

Dans les comparaisons des dommages à l'ADN induits in vivo par le cisplatine et la STZ, la différence la plus importante était la distribution histologique des régions lésées dans le tissu rénal. La région tubulaire lésée par le cisplatine est principalement localisée sur la bande externe de la moelle externe, au niveau de laquelle se trouve le segment S3 des tubules proximaux29. En revanche, les présents résultats ont démontré que les lésions tubulaires induites par la STZ étaient rarement détectées dans cette région, alors qu'elles étaient notamment présentes dans le cortex externe au niveau duquel existent les segments S1 et S2 des tubules proximaux. Cela confirme notre théorie selon laquelle STZ pénètre dans les cellules via GLUT2 et SGLT2, qui sont principalement exprimés dans le segment S1/2 des tubules proximaux.

Sur la base de la régulation à la hausse de la signalisation p53 dans les lésions tubulaires induites par STZ, l'inhibition pharmacologique de p53 est une stratégie préventive possible. Des études antérieures ont démontré que la signalisation p53 activée joue un rôle crucial dans les lésions rénales dans divers modèles de maladies, notamment la néphrotoxicité du cisplatine et les lésions d'ischémie-reperfusion30,31,32,33,34,35,36. Cependant, les effets de l'inhibition pharmacologique ou de la délétion génétique de p53 sur les lésions rénales sont complexes36,37. Des études antérieures ont démontré que l'inhibition de p53 n'était pas toujours bénéfique, elle exacerbait en fait les lésions tissulaires ou la fibrose37,38. Le type de modèle de blessure et les espèces animales peuvent contribuer aux différences observées dans la réponse de l'inhibition de p53 contre les lésions rénales37. Dans les lésions rénales induites par la STZ, nous avons constaté que la pifithrine-α n'atténuait pas les dommages à l'ADN ; cependant, il a légèrement amélioré l'expression du marqueur de lésion rénale. Par conséquent, la pifithrine-α ne semble pas empêcher l'absorption de STZ par les cellules épithéliales tubulaires, alors que les lésions tubulaires consécutives à l'activation de p53 sont atténuées dans une certaine mesure.

L'un des principaux facteurs limitants associés à l'utilisation des médicaments anticancéreux est leur cytotoxicité dans les tissus normaux, et les reins sont l'organe cible le plus courant8. Bien que les taux de créatinine sérique n'aient pas augmenté chez la majorité des patients traités par STZ, une excrétion urinaire insuffisante de glucose indique une lésion tubulaire proximale latente. Collectivement, les résultats actuels et les découvertes précédentes ont démontré des réductions marquées de l'expression de SGLT2 chez les souris traitées à la STZ19,23, ce qui peut contribuer à l'excrétion urinaire de glucose, alors que les taux de glucose sanguin n'ont pas suffisamment augmenté. Pour minimiser la néphrotoxicité des médicaments anticancéreux, une approche possible consiste à réduire l'absorption du médicament dans les cellules rénales, le blocage spécifique des tubules rénaux étant idéal. Conformément aux découvertes précédentes, les présents résultats ont montré que l'inhibition pharmacologique de SGLT2 inhibait partiellement la néphrotoxicité de STZ19, tandis que ses effets cytotoxiques sur les cellules β pancréatiques qui n'expriment pas SGLT2 étaient préservés. Par conséquent, un prétraitement avec des inhibiteurs du SGLT2 a un potentiel en tant qu'approche prophylactique spécifique pour les lésions rénales.

Il y a plusieurs limites à cette étude. Premièrement, il y avait des divergences entre les résultats expérimentaux de qPCR in vivo et in vitro, en particulier dans l'expression des transporteurs transmembranaires dans l'épithélium tubulaire. Une explication est que la perte de polarité cellulaire et la perte concomitante d'expression des transporteurs membranaires, y compris SGLT2, sont parfois observées dans les épithéliums tubulaires dans des conditions de culture39,40. Ainsi, l'expression in vitro de ces molécules peut être sous-estimée. Deuxièmement, bien que l'activation de p53 soit une signalisation en aval courante des dommages à l'ADN après diverses insultes, nous n'avons pas pu montrer l'activation de p53 dans le tissu rénal humain chez les patients TNE. Enfin, bien que nous ayons démontré que la dapagliflozine améliorait les dommages à l'ADN induits par la STZ dans les épithéliums tubulaires in vivo, ses mécanismes précis, en particulier si la STZ pénètre réellement dans les cellules via SGLT2, ne sont pas directement élucidés. De plus, alors que la STZ pénètre dans les cellules β pancréatiques via GLUT2, un transporteur de glucose bidirectionnel, la direction du transport de la STZ médiée par GLUT2 dans les épithéliums tubulaires proximaux n'est pas claire dans nos expériences et nécessite d'autres investigations à l'avenir.

En conclusion, la présente étude a révélé la néphrotoxicité de la STZ in vitro, in vivo et dans des échantillons de biopsie rénale de patients TNE. Les dommages à l'ADN et l'activation ultérieure de p53 dans les cellules épithéliales tubulaires sont responsables de la néphrotoxicité induite par la STZ. Les inhibiteurs de SGLT2 ont empêché les dommages à l'ADN dans les cellules épithéliales tubulaires in vivo, tandis que la toxicité cellulaire contre les cellules β pancréatiques a été préservée. Cela suggère qu'un prétraitement avec un inhibiteur du SGLT2 est une option préventive intéressante pour les événements indésirables de STZ sur le tissu rénal chez les patients TNE. De plus, étant donné que la néphrotoxicité induite par la STZ a été sous-estimée dans les milieux expérimentaux, les lésions rénales dans le diabète de type 1 induit par la STZ doivent être soigneusement évaluées.

Nous avons recruté rétrospectivement 8 patients TNE traités par STZ à l'Université de médecine de la préfecture de Kyoto. Toutes les caractéristiques cliniques ont été recueillies à partir des dossiers médicaux, y compris l'âge, le sexe, les complications et les résultats de laboratoire, et ont été répertoriées dans le tableau supplémentaire 1. Des échantillons de rein humain ont été obtenus de 2 patients par biopsie rénale. À titre de contrôle, nous avons analysé le tissu rénal d'un patient atteint d'une maladie de la membrane basale mince qui impliquait principalement le glomérule, et non le tissu tubulaire. Les informations sur les patients ont été anonymisées et anonymisées avant les analyses. L'ensemble du protocole de la présente étude a été conçu conformément à la Déclaration d'Helsinki. En raison de sa conception rétrospective et du faible risque pour les patients, le comité d'éthique a approuvé l'utilisation de la méthodologie d'opt-out suivante. L'exigence d'un consentement éclairé verbal a été levée et le consentement éclairé a été obtenu grâce à des informations généralement accessibles ainsi qu'à des modes de retrait faciles. La présente étude a été approuvée par le comité d'éthique médicale de l'hôpital universitaire de l'université de médecine de la préfecture de Kyoto (numéro d'approbation : ERB-C-2169, ERB-C-2210).

Des souris mâles C57BL/6 de type sauvage ont été achetées auprès de Shimizu, Inc. (Kyoto, Japon). Le modèle de lésion STZ a été induit par une injection intrapéritonéale de STZ (Cayman Chemical, MI, USA) dans un tampon de citrate de sodium 0, 05 M, pH 4, 5 à une concentration de 100, 150 ou 200 mg / kg de poids corporel chez des souris mâles à l'âge de 8 à 10 semaines. Les souris ont été euthanasiées 1 ou 7 jours après l'injection de STZ. Des souris témoins de même portée ont été utilisées pour les comparaisons entre les groupes. Tous les groupes traités à l'insuline ont reçu une injection sous-cutanée d'insuline glargine (Wako, Osaka, Japon), puis ont été ajustés à la quantité qui maintenait leur glycémie à jeun au même niveau (± insuline glargine 2–6 unités/kg).

Pour inhiber p53 in vivo, 2,2 mg/kg de pifithrine-α (ab120478, Abcam plc., Cambridge, Royaume-Uni) ont été injectés par voie intrapéritonéale juste avant l'injection de STZ comme décrit précédemment41. Pour inhiber SGLT2 in vivo, 1,0 mg/kg de dapagliflozine (Selleck Biotech Co., Houston USA) a été dissous et dilué avec une solution saline normale à 75 % (0,9 % p/v NaCl) et administré par gavage 1 h avant le traitement STZ. Le poids corporel et la glycémie ont été mesurés à 17h00 après 8h de jeûne. Les taux de glucose sanguin ont été mesurés à l'aide d'un glucomètre (Glutest Every, Sanwa Kagaku Kenkyusho Co., Ltd., Aichi, Japon). Les souris ont été anesthésiées avec de l'isoflurane, euthanasiées aux moments indiqués, et des échantillons de sang ont ensuite été prélevés de la veine cave inférieure. Les reins et le pancréas ont été découpés en échantillons pour des analyses ultérieures.

Toutes les expériences ont été approuvées par le Comité des animaux expérimentaux de l'Université de médecine de la préfecture de Kyoto et ont été réalisées conformément aux directives institutionnelles et aux directives pour la bonne conduite des expériences animales par le Conseil scientifique du Japon et aux directives ARRIVE.

Des cellules épithéliales de rein de rat normales (cellules NRK 52E) ont été obtenues auprès de la JCRB Cell Bank. Les cellules ont été cultivées dans du DMEM (Wako, Osaka, Japon) contenant 1 % de pénicilline et de streptomycine (Invitrogen, Carlsbad, CA) et 5 % de FBS (Invitrogen) à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 et à 95 % d'air. Les cellules ont été traitées avec 1, 5, 10 ou 30 mM de STZ dissous dans du diméthylsulfoxyde pendant 24 h avant le comptage des cellules. Le nombre de cellules a été compté à l'aide d'un compteur de cellules automatique ADAM-MC (Digital Bio, Japon) qui fonctionne en utilisant la méthode de coloration à l'iodure de propidium de coloration des cellules mortes.

L'azote uréique du sang sérique (BUN) a été mesuré en utilisant les méthodes enzymatiques appropriées (A667-00, Serotec, Hokkaido, Japon). Les concentrations d'insuline dans le plasma collecté ont été mesurées à l'aide d'un kit ELISA Ultra Sensitive Mouse Insulin (Morinaga Institute of Biological Science, Inc., Kanazawa, Japon) conformément aux instructions du fabricant.

Les souris ont été anesthésiées et sacrifiées, et le pancréas et les reins ont été retirés aux moments indiqués. Pour préparer les coupes de paraffine, le pancréas et les reins ont été fixés avec du paraformaldéhyde à 4 % et inclus dans de la paraffine par le laboratoire de recherche médicale appliquée (Osaka, Japon). Des tissus de souris et humains inclus en paraffine ont été coupés en sections de 4 μm d'épaisseur. La coloration à l'acide périodique de Schiff (PAS) a été réalisée selon les procédures standard.

Après déparaffinage, des coupes de paraffine de souris et humaines ont été placées dans une solution tamponnée au citrate (pH 6,0) et bouillies pendant 5 min pour récupérer les antigènes. La peroxydase endogène a été désactivée avec du peroxyde d'hydrogène à 3,0 % dans du méthanol pendant 20 minutes. Les échantillons ont été bloqués avec 3% de BSA dans du PBS pendant 30 min à température ambiante et incubés avec des anticorps primaires (tableau supplémentaire 2). Les coupes ont été marquées avec un anticorps secondaire de chèvre anti-lapin conjugué à la HRP (ab236469, Abcam). Un substrat chromogénique de diaminobenzidine (K3468, Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA) a été utilisé pour la réaction colorée, suivie d'une contre-coloration avec de l'hématoxyline. Toutes les sections ont été observées à l'aide d'un microscope Eclipse E600 (Nikon, Tokyo, Japon) et d'un microscope BZ-X700/BZ-X710 (Keyence Corporation, Osaka, Japon). Les cellules positives pour γH2AX ont été quantifiées à partir de trois champs corticaux et médullaires consécutifs non superposés sur 10 dans chaque rein sous un grossissement élevé (n = 3). Ces trois champs ont été sélectionnés au hasard en aveugle.

Pour la coloration par immunofluorescence, les coupes congelées ont été réhydratées et perméabilisées avec du Triton X-100 à 0,5 % dans du PBS pendant 5 min. Les échantillons ont été bloqués avec 3 % de BSA dans du PBS et séquentiellement incubés avec les anticorps primaires présentés dans le tableau supplémentaire 2 pendant une nuit à 4 °C, suivis d'une incubation avec des anticorps secondaires conjugués à Alexa Fluor 594 (tableau supplémentaire 2) pendant 1 h. La contre-coloration nucléaire a été réalisée à l'aide de DAPI ou DRAQ5 (DR50050; BioStatus, Leicestershire, Royaume-Uni; 1: 2000), suivie d'un montage dans Prolong-Gold (Thermo Fisher Scientific). Les images ont été obtenues par microscopie confocale (FV1000; Olympus, Tokyo, Japon).

L'ARN total a été extrait du cortex des reins ou des cellules NRK-52E à l'aide de TRIzol (Life Technologies, Carlsbad, CA) et Direct-zol RNA MiniPrep (Zymo Research, Irvine, CA). Deux cents nanogrammes d'ARN total ont été rétrotranscrits pour synthétiser l'ADNc à l'aide d'un kit de réactifs PrimeScript RT avec gDNA Eraser (Takara Bio). La détection en temps réel des produits de PCR a été réalisée à l'aide du KAPA SYBR FAST qPCR Master Mix (2x) Universal (Kapa Biosystems, Wilmington, MA) et d'un système en temps réel Thermal Cycler Dice (Takara Bio Inc.). L'expression génique a été quantifiée en utilisant la β-actine comme contrôle interne. Les amorces sont présentées dans le tableau supplémentaire 3.

Les cellules NRK52E, une lignée cellulaire épithéliale tubulaire proximale de rat, dans les groupes STZ ont été traitées avec 10 mM de STZ pendant 24 h avant l'extraction de l'ARN. Des échantillons d'ARN ont été fournis à l'installation centrale NGS du Centre de recherche sur l'information sur le génome de l'Institut de recherche sur les maladies microbiennes de l'Université d'Osaka pour la construction et le séquençage de la bibliothèque. La préparation de la bibliothèque a été effectuée à l'aide d'un kit de préparation d'échantillons d'ARNm brin TruSeq (Illumina, San Diego, CA) conformément aux instructions du fabricant. Le séquençage a été réalisé sur une plate-forme Illumina HiSeq 2500 en mode single-end de 100 bp. Les lectures séquencées ont été mappées sur les séquences du génome de référence du rat (Rnor6) à l'aide de STAR v 2.7.10a (https://github.com/alexdobin/STAR/) et les lectures mappées de manière unique ont été comptées par la fonction featureCounts dans le package Subread (https://subread.sourceforge.net).

Les analyses de données ont été effectuées à l'aide du logiciel R version 4.1.2 (https://www.R-project.org/). Le package edgeR a été utilisé pour une analyse d'expression différentielle42. Les gènes avec un FDR < 0, 05 et un facteur log2 absolu> 1 ont été considérés comme des gènes exprimés de manière significativement différentielle. Le package fgsea a été utilisé pour une analyse d'enrichissement de l'ensemble de gènes. L'analyse des voies de l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG) (https://www.genome.jp/kegg/kegg1.html) a été réalisée à l'aide de la version 0.93 d'iDEP (http://bioinformatics.sdstate.edu/idep93/) avec la méthode d'enrichissement de l'ensemble de gènes généralement applicable pour l'analyse des voies (GAGE)43.

Les extraits totaux de cellules ou de tissus ont été obtenus à l'aide du tampon de lyse 17 (R&D Systems, Inc., Minneapolis, MN, USA). Les protéines ont été dénaturées par chauffage à 95°C pendant 5 min et séparées par SDS-PAGE. Ensuite, les protéines ont été transférées sur des membranes de difluorure de polyvinylidène (Immobilon-P IPVH00010 : Millipore, MA, USA). Après blocage dans 5 % de lait écrémé ou 3 % de BSA dans du TBS/0,1 % de Tween20 à température ambiante pendant 1 h, la membrane a été incubée avec l'anticorps primaire (tableau supplémentaire 2) à 4 °C pendant la nuit. Après lavage avec du TBS/0,1 % de Tween20, des anticorps secondaires conjugués à la peroxydase ont été ajoutés (7074S ; Cell Signaling Technology, Boston, MA ; 1:3000 à température ambiante). La chimiluminescence a été détectée à l'aide d'un réactif de détection Western blot ECL select (RPN2235 : GE Healthcare UK Ltd, Amersham Place, Angleterre) ou d'un substrat Western ECL Clarity Max (1 705 062 : Bio-Rad Laboratories, Inc., Hercules, CA, USA). Les intensités des signaux ont été évaluées à l'aide du logiciel ImageJ (National Institutes of Health, Bethesda, MD).

Le test des comètes a été effectué à l'aide du kit de test Comet (Abcam ab238544) comme décrit précédemment41,44. En bref, les reins de souris ont été prélevés et hachés dans une petite quantité de PBS glacé contenant 20 mM d'EDTA. Le surnageant a été passé à travers un tamis cellulaire de 35 μm. Après centrifugation, le culot a été mis en suspension à 1 × 105 cellules/ml dans du PBS glacé. Les échantillons ont été mélangés avec de l'agarose comète à un rapport de 1/10 (v/v) puis transférés sur des lames de verre recouvertes d'une couche de base d'agarose comète. Après incubation avec un tampon de lyse prérefroidi, les lames ont été soumises à une électrophorèse. L'électrophorèse a été réalisée dans une solution d'électrophorèse alcaline pour le test des comètes alcalines et une solution d'électrophorèse TBE pour le test des comètes neutres. Après électrophorèse, les lames ont été incubées avec le colorant ADN Vista Green. Les images ont été obtenues par microscopie à épifluorescence (IX71; Olympus, Tokyo, Japon) en utilisant le filtre FITC. Dix images (5 à 15 cellules par image) ont été prises au hasard et le moment de la queue (longueur de la queue × queue % ADN/100) de 100 cellules par groupe a été calculé à l'aide du logiciel d'analyse Comet Score (TriTek Corp.).

Les résultats sont exprimés en moyenne ± erreur standard (SE). Les analyses statistiques ont été effectuées par le test t non apparié pour les comparaisons de deux variables et une analyse de variance et le test post hoc de Dunnett pour les comparaisons de plusieurs variables. Les valeurs de P < 0,05 ont été considérées comme significatives.

Les données RNA-seq pour tous les échantillons ont été déposées dans Gene Expression Omnibus sous le numéro d'accession GSE215337. Jeton sécurisé pour l'accès des réviseurs : gzanqiemjhyhdyl.

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Département de néphrologie, École supérieure des sciences médicales, Université de médecine préfectorale de Kyoto, 465 Kajii-cho, Kamigyo-ku, Kyoto, 602-8566, Japon

Kunihiro Nakai, Minato Umehara, Atsushi Minamida, Hiroko Yamauchi-Sawada, Yasuto Sunahara, Yayoi Matoba, Natsuko Okuno-Ozeki, Itaru Nakamura, Tomohiro Nakata, Aya Yagi-Tomita, Noriko Uehara-Watanabe, Tomoharu Ida, Noriyuki Yamashita, Michitsugu Kamezaki, Yuhei Kirita, Keiichi Tamaga ki & Tetsuro Kusaba

Département de pathologie chirurgicale, École supérieure des sciences médicales, Université de médecine de la préfecture de Kyoto, Kyoto, Japon

Eiichi Konishi

Département de gastro-entérologie et d'hépatologie, École supérieure des sciences médicales, Université de médecine de la préfecture de Kyoto, Kyoto, Japon

Hiroaki Yasuda

Département de médecine cardiovasculaire, École supérieure des sciences médicales, Université de médecine de la préfecture de Kyoto, Kyoto, Japon

Satoaki Matoba

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NK et TK ont conçu l'étude, réalisé les expériences, analysé les données et rédigé le manuscrit. YK a analysé les données. MU, AM, HY-S., YS, YM, NO-O., IN, TN, AY-T., NU-W., TI, NY, MK, EK, HY, SM et KT ont contribué à la discussion.

Correspondance à Tetsuro Kusaba.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Nakai, K., Umehara, M., Minamida, A. et al. La streptozotocine induit des lésions tubulaires proximales rénales par l'activation de la signalisation p53. Sci Rep 13, 8705 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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Reçu : 24 novembre 2022

Accepté : 24 mai 2023

Publié: 29 mai 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-35850-w

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