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Aug 19, 2023

Appareils de test moléculaire pour

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 4245 (2023) Citer cet article

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Détails des métriques

Les cellules d'Escherichia coli (E. coli) sont présentes dans les matières fécales qui peuvent être la principale source d'agents pathogènes dans l'eau. Par conséquent, E. coli est recommandé comme indicateur de la qualité de l'eau. Nous avons développé une plateforme innovante pour détecter E. coli pour surveiller la qualité de l'eau sur site en intégrant la préparation d'échantillons sur papier avec l'amplification isotherme des acides nucléiques. La plate-forme effectue la lyse bactérienne et l'enrichissement de l'ADN sur un bloc de papier via des vannes à bille pour le contrôle des fluides, sans avoir besoin d'équipement de laboratoire, suivi d'une amplification isotherme à médiation par boucle (LAMP) dans une tasse à café à piles et d'une détection colorimétrique. Nous avons utilisé la plateforme pour détecter E. coli dans des échantillons d'eau environnementale en environ 1 h, avec une limite de quantification de 0,2 UFC/mL et 3 copies par réaction. La plate-forme a été confirmée pour détecter plusieurs souches d'E. coli et pour des échantillons d'eau de différentes concentrations de sel. Nous avons validé les fonctions de la plateforme en analysant des échantillons d'eau récréative collectés près de l'océan Atlantique qui contiennent différentes concentrations de sel et de bactéries.

Les ressources en eau du monde entier sont soumises à une variété de contaminants, biologiques ou non biologiques, et leur présence au-delà de certains niveaux peut être nocive pour les êtres humains1. Une bonne santé publique nécessite une surveillance régulière de la qualité de l'eau pour éviter que les gens ne contractent des maladies. Dans le monde, environ 1,6 million de personnes meurent chaque année à cause de maladies d'origine hydrique causées par des contaminants biologiques1, qui affectent des pays de tous les niveaux économiques2. Les agents pathogènes sont les principaux contaminants biologiques dans l'eau et il est donc important de surveiller leur présence dans les sources d'eau récréative et potable. Certains de ces agents pathogènes comprennent Salmonella, Staphylococcus, Vibrio cholera, Legionella, Shigella, Escherichia coli (E. coli) et d'autres bactéries coliformes3. Ces agents pathogènes peuvent être introduits dans les sources d'eau et pénétrer ensuite dans le corps humain directement en buvant de l'eau ou indirectement pendant la baignade et d'autres activités nautiques récréatives. Pour cette raison, des limites acceptables de certains de ces agents pathogènes ont été définies dans la législation par différentes organisations telles que l'Organisation mondiale de la santé (OMS), l'Agence américaine de protection de l'environnement (EPA) ou l'Union européenne4.

La pollution fécale est la principale source d'agents pathogènes dans l'eau1,4, y compris les bactéries présentes dans les excréta des humains et des animaux à sang chaud. E. coli est un type de bactérie qui vit normalement dans les intestins des animaux à sang chaud, bien que certaines souches toxiques (par exemple, E. coli O157:H7) puissent provoquer des crampes abdominales, des vomissements et de la diarrhée. Même de petites quantités d'eau contaminée par ces souches toxiques peuvent causer des maladies5. Étant donné que les humains et les animaux à sang chaud ont E. coli présent dans leurs intestins et que ces bactéries sont libérées par les matières fécales, E. coli peut donc fonctionner comme un indicateur de contamination fécale dans l'eau douce4,6.

L'EPA a publié une mise à jour des critères en 2012 avec une recommandation pour la qualité de l'eau douce et marine dans les eaux récréatives7. Ils ont rapporté 2 critères, un pour un taux de maladie estimé (maladie NGI ou NEEAR-GI tandis que NEEAR signifie National Epidemiological and Environmental Assessment of Recreational Water et GI signifie gastro-intestinal) de 36 pour 1000 recréateurs de contact primaire, et un pour 32 pour 1000 recréateurs de contact primaire. Le critère recommandé pour E. coli dans l'eau douce pour le NGI de 32 pour 1000 recréateurs de contact primaire dans tout intervalle de 30 jours est une moyenne géométrique de 100 unités formant colonie (UFC) par 100 mL et une valeur seuil statistique (STV) de 320 UFC par 100 mL7. Par conséquent, la limite de quantification (LoQ) de toute méthode développée pour la surveillance de la qualité de l'eau doit être inférieure à 100 UFC/100 mL ou 1 UFC/mL.

Les méthodes conventionnelles de détection des agents pathogènes dans l'eau sont principalement des approches basées sur la culture et des techniques de séparation/filtration en laboratoire8. Bien que ces tests de laboratoire conventionnels soient les méthodes standard en raison de leur précision et de leur sensibilité, ils nécessitent des instruments encombrants et coûteux, un personnel qualifié et de longs délais d'exécution. Un système de test largement utilisé est l'IDEXX Colilert, qui peut quantifier le nombre de coliformes totaux et d'E. coli en un seul test. Bien que le système IDEXX Colilert soit populaire et relativement facile à utiliser, il nécessite un équipement volumineux et coûteux tel qu'un incubateur, avec un délai d'obtention des résultats long (24 h) en raison de la culture bactérienne9. Par conséquent, il existe une tendance croissante à développer de petits dispositifs faciles à utiliser et rentables pour des méthodes sur site pour des résultats plus rapides1, qui permettent des actions immédiates, empêchant potentiellement les personnes de contracter des maladies. Le développement de méthodologies sur site à faible coût peut également profiter aux pays ou aux régions à ressources limitées où les laboratoires ne sont pas disponibles ou facilement accessibles.

Les plates-formes portables sur site incluent des approches basées sur des dosages enzymatiques10,11,12, la microfluidique13,14,15, des bandes à flux latéral16,17 et des dispositifs analytiques sur papier11,18 couplés à la détection par fluorescence19, colorimétrie20 ou électrochimie21 pour une interprétation rapide et facile des résultats. Les limites souvent citées de ces approches comprennent un faible volume d'échantillon traité (par exemple, des dispositifs microfluidiques), une sensibilité relativement faible en raison de l'absence d'amplification (par exemple, des bandes à flux latéral et des techniques d'hybridation d'acide nucléique) et de longs temps d'incubation (par exemple, des dosages enzymatiques). D'autre part, les tests d'amplification d'acide nucléique (NAAT) tels que la réaction en chaîne par polymérase (PCR) offrent une sensibilité plus élevée et un délai d'obtention des résultats plus rapide que les méthodes de culture, et par conséquent, ils sont souvent préférés22,23,24. Néanmoins, les approches PCR nécessitent une préparation d'échantillon, un instrument sophistiqué et un personnel formé, tandis que les techniques d'amplification isotherme telles que l'amplification isotherme médiée par boucle (LAMP) sont plus faciles à mettre en œuvre en raison de l'absence d'exigence de cycle de température25,26,27. Par exemple, Lee et al. ont utilisé des filtres à seringue et des billes magnétiques pour extraire l'ADN, suivis de LAMP dans un instrument portable27.

Dans ce travail, nous rapportons le développement d'une plateforme de test sur site pour la détection d'E. coli dans l'eau. La plate-forme peut (1) traiter de grands volumes d'échantillons (1 à 10 ml) à l'aide d'une méthode de préparation d'échantillons sur papier à valve, (2) amplifier l'ADN à l'aide de LAMP et (3) détecter les amplicons en fonction du changement de couleur. Nous avons utilisé un dispositif imprimé en 3D et des vannes à bille pour la livraison séquentielle des réactifs nécessaires à la lyse cellulaire, à l'enrichissement et à la purification de l'ADN, et l'ADN résultant a été concentré sur un papier de chromatographie. LAMP a ensuite été réalisé par une tasse à café intelligente alimentée par batterie qui fonctionne comme un bain-marie, fournissant une température constante. Le colorant vert SYBR a été utilisé pour la détection colorimétrique. Nous avons démontré la détection d'E. coli dans des échantillons d'eau de l'environnement en environ 1 h (~ 30 min de préparation d'échantillon et ~ 45 min de LAMP) à l'aide de cette plateforme de test.

Comme le montre la figure 1, le dispositif se compose d'une unité tampon, d'une unité de mélange, d'une unité de détection et d'un conteneur de déchets. L'unité de détection était constituée d'une couche de puits en polycarbonate, d'un ruban adhésif double face, de deux couches de films thermoplastiques et d'un papier de chromatographie. Le récipient a été façonné en un carré de 2 cm × 2 cm à partir d'une feuille de polycarbonate de 3 mm d'épaisseur (McMaster-Carr, Elmhurst, IL) à l'aide d'une fraiseuse CNC (Sherline Products, Vista, Californie), et un puits de 4 mm (ou 6 mm) de diamètre a été créé au centre. Un morceau de papier de chromatographie Whatman ™ 1 (Fisher Scientific) et deux films de stratification à liaison thermique en polyester de 75 μm d'épaisseur (Lamination Plus, Kaysville, UT, États-Unis) ont été découpés en cercles de 3, 5 mm ou (5, 5 mm) de diamètre à l'aide d'un traceur de découpe Graphtec Craft Robo-S (Graphtec Corporation, Yokohama, Japon). Le papier a ensuite été pris en sandwich entre les deux films thermoplastiques et passé dans une plastifieuse, GBC® Catena 65 Roll Laminator (GBC, Lake Zurich, IL, USA), réglée à une vitesse de laminage de "1" et à une température de 220°F comme décrit précédemment28,29. Ce bloc de papier laminé a ensuite été fixé à la couche de puits en polycarbonate à l'aide d'un ruban adhésif double face (ruban de liaison blanc 3 M 9087, RS Hughes, Sunnyvale, CA), formant l'unité de détection.

Vue éclatée des composants de l'appareil. L'unité tampon en haut contient quatre réservoirs et une ouverture. Ces 4 réservoirs sont destinés au tampon de lyse, au tampon de liaison et aux 2 tampons de lavage. L'ouverture au fond de chaque puits est obturée par une bille en acier inoxydable pour empêcher les réactifs de s'écouler jusqu'à ce que cela soit souhaité. L'unité de mélange au milieu est en forme d'entonnoir pour améliorer le mélange et faire passer les réactifs et l'échantillon à travers le papier dans l'unité de détection, qui est insérée par la saillie (➇) au bas de l'unité de mélange. L'unité de mélange a une goupille qui pousse la boule vers le haut, ouvrant la vanne et permettant aux réactifs de descendre lorsque l'unité tampon est tournée pour aligner la goupille avec la boule. Enfin, le bac à déchets situé au fond sert à 2 fins, (1) collecter les déchets et (2) si nécessaire, accélérer le processus de filtration en y connectant un aspirateur ou un mécanisme d'aspiration.

Une imprimante 3D commerciale, Ultimaker 3 (Ultimaker, Geldermalsen, Pays-Bas), a été utilisée pour fabriquer l'unité tampon, l'unité de mélange et le conteneur de déchets. Les dispositifs ont été imprimés à l'aide d'acrylonitrile butadiène styrène (ABS), avec la hauteur de la couche d'impression réglée sur 0,1 mm et la densité de remplissage réglée sur 100 %. Les billes utilisées pour la vanne dans chaque puits étaient des billes en acier inoxydable 316 de 4,0 mm de diamètre résistant à la corrosion (McMaster-Carr, Elmhurst, IL). Le concept de valve est illustré à la Fig. 2. Ce mécanisme de valve est comme un stylo à bille, dans lequel l'encre est distribuée sur du papier lorsque la bille métallique à la pointe du stylo est pressée pendant l'écriture.

Mécanisme de soupape à bille. (à gauche) La vanne est fermée lorsque la bille empêche le réactif de s'écouler. (à droite) La vanne est ouverte après la rotation de l'unité tampon et l'axe est aligné avec la bille, soulevant la bille et permettant aux réactifs de s'écouler dans l'unité de mélange.

L'unité tampon a une forme cylindrique avec un diamètre de 7,1 cm, une hauteur de 1 cm, trois réservoirs avec un diamètre supérieur de 2 cm et un de 2,4 cm, tous avec une profondeur de 1 cm et un diamètre inférieur de 0,38 cm. Le plus grand puits (sur la Fig. 1) est destiné à accueillir le plus grand volume d'un échantillon et d'un réactif. Ces réservoirs peuvent contenir des volumes allant jusqu'à 1,28 et 1,78 ml, respectivement. L'ouverture en haut a été conçue à 2 fins : (1) visualiser le moment où les réactifs traversent complètement le papier, passer à l'étape suivante, et (2) permettre, si nécessaire, d'ajouter des échantillons de plus de 1 mL (jusqu'à 10 mL). L'unité de mélange a une hauteur de 4,5 cm, un diamètre supérieur extérieur de 6,5 cm, un diamètre supérieur intérieur de 5,5 cm, un diamètre inférieur extérieur de 8 cm et un diamètre intérieur de 6 cm. L'épaisseur de paroi en haut est de 1 cm et de 2 cm en bas, ce qui permet d'obtenir un vide sur l'appareil sans fuite d'air dans les parois du matériau imprimé en 3D. La saillie au bas de l'unité de mélange (pièce n° 8 sur la figure 1) lui permet de s'adapter parfaitement au puits de l'unité de détection. Le passage liquide de l'unité de mélange vers l'unité de détection a un diamètre de 5 mm pour une intégration avec les unités de détection de diamètre 6 mm, qui est situé à 3 cm du haut du puits de mélange. Le conteneur à déchets a un diamètre extérieur de 10 cm et une hauteur de 3 cm, cependant, ces dimensions et celles du mélangeur pourraient être réduites si aucun aspirateur n'est utilisé, ou si un dispositif est fabriqué en utilisant une technique de fabrication différente. Globalement, lorsque l'appareil est assemblé, la hauteur totale est de 7,5 cm.

Le processus de préparation des échantillons de l'appareil consiste à libérer séquentiellement les solutions tampons pour la lyse, la liaison et le lavage de l'ADN de l'unité tampon dans l'unité de mélange par l'actionnement de vannes à bille. Ces solutions sont ensuite dirigées vers l'unité de détection pour l'enrichissement et la purification de l'ADN sur le papier de chromatographie. Tout d'abord, toutes les solutions tampons sont chargées dans leurs réservoirs respectifs dans l'unité tampon, y compris 200 µL de tampon de lyse AL (QIAGEN), 200 µL d'éthanol, 500 µL d'AW1 (QIAGEN) et 500 µL d'AW2 (QIAGEN). Deuxièmement, 1 ml d'un échantillon d'eau est ajouté au premier réservoir contenant la solution de lyse pour lyser l'échantillon pendant 10 min, puis le mélange est évacué vers l'unité de mélange en faisant tourner l'unité tampon et en actionnant la vanne. Cela a été suivi par une nouvelle rotation immédiate de l'unité de tampon pour décharger le tampon de liaison du réservoir #2 pour le mélanger avec le mélange échantillon/lyse. Une fois que ces solutions ont complètement traversé l'unité de mélange, puis dans le bloc de papier de l'unité de détection, l'unité de tampon est à nouveau tournée pour décharger les tampons de lavage, AW1 du réservoir #3 et AW2 du réservoir #4, un à la fois pour purifier l'ADN collecté sur le papier.

Après purification de l'ADN, l'unité de détection est détachée de l'unité de mélange, prête pour l'étape suivante : l'amplification de l'ADN. Après détachement, le côté inférieur de l'unité de détection est scellé à l'aide d'un morceau de ruban PCR, suivi de l'ajout du mélange LAMP de 50 µL à l'aide d'une pipette jetable. Un autre morceau de ruban PCR est placé sur le dessus de l'unité de détection pour sceller l'unité de détection, empêchant une éventuelle évaporation ou fuite. L'unité de détection est ensuite immergée dans l'eau d'une tasse à café à 62,5 °C pendant 45 min. Après amplification, l'unité de détection est retirée de la tasse et le morceau de ruban adhésif en haut est retiré, suivi de l'ajout de 1 µL de SYBR Green pour la détection colorimétrique. Un schéma du processus global et des étapes de la plate-forme est présenté dans la Fig. S1 supplémentaire. La vidéo supplémentaire S1 montre l'ensemble du processus de l'appareil, de la préparation de l'appareil jusqu'à la détection colorimétrique des amplicons.

Les vannes de contrôle des fluides sont utilisées pour effectuer la préparation des échantillons par libération séquentielle des réactifs de l'unité de tampon dans l'unité de mélange sans avoir besoin d'équipement de laboratoire de base. Chaque vanne est constituée d'une bille en acier inoxydable placée au fond d'un puits de tampon pour empêcher le réactif de s'écouler jusqu'à ce qu'il soit souhaité. La boule dépasse de 1,5 mm du bas de l'unité tampon de sorte que la goupille de l'unité de mélange soulève les boules et permet aux réactifs de s'écouler lorsque la goupille est alignée avec les boules, comme illustré à la Fig. Pour éviter le déplacement de la bille et les fuites pendant le transport, une liaison cassable à base de cire est créée entre la bille et le réservoir. Tout d'abord, un morceau de cire (Akrowax ™ 130, Akron, OH, USA) est fondu à chaud dans un petit bécher, suivi d'un trempage d'une boule dans la cire fondue. La boule contenant une fine couche de cire est immédiatement placée dans le réservoir, permettant à la cire de se solidifier et de créer une liaison cassable pour empêcher tout mouvement indésirable.

Chaque mélange LAMP de 25 μL contient 2,5 μL de tampon d'amplification isotherme 10×, 8 U Bst 2.0 WarmStart® ADN polymérase, 2,5 μL de mélange d'amorces concentrées 10× et une concentration finale de 1,4 mM de dNTP et 6 mM de MgSO4. Le volume de 25 μL a été rempli par de l'eau sans nucléase (non traitée avec du diéthylpyrocarbonate ou DEPC). À l'exception de l'eau sans nucléase et des dNTP de ThermoFisher Scientific (MA, USA), les autres réactifs du mélange LAMP ont été obtenus auprès de New England Biolabs (NEB) (Ipswich, MA, USA). Le mélange d'amorces 10 × contient 16 μM d'amorce interne avant (FIP) et d'amorce interne arrière (BIP), 2 μM d'amorce externe avant (souvent appelée F3) et d'amorce externe arrière (souvent appelée B3) et 8 μM d'amorce de boucle avant (LF) et amorce de boucle arrière (LB); leurs séquences sont présentées dans le tableau supplémentaire S1. Les amorces ont été achetées chez Integrated DNA Technologies (Coralville, Iowa, USA), et leurs séquences ont été choisies en suivant la littérature30. Lorsque le mélange LAMP de 50 μL a été utilisé pour remplacer le mélange de 25 μL, les volumes de tous les réactifs ont été doublés, en gardant la même concentration finale. Pour éviter une amplification non spécifique et d'éventuels résultats faussement positifs, l'uracile ADN glycosylase (UDG) et le dUTP ont été ajoutés aux réactions LAMP pour éliminer la contamination par transfert. L'UDG a été largement utilisé pour prévenir la contamination par transfert sans compromettre la sensibilité dans LAMP et d'autres tests d'amplification d'acide nucléique31,32,33.

Pour obtenir LAMP sans avoir besoin de se connecter à une prise de courant, nous avons choisi une tasse à café à piles disponible dans le commerce (Ember™ Travel Mug, Ember Technologies, Inc., Westlake Village, CA) comme bain-marie comme indiqué précédemment28,29. Avant d'être placés dans la tasse Ember™ contenant de l'eau à 62,5 °C, les unités de détection ont été scellées à l'aide de deux morceaux de ruban adhésif (Fellows®) pour couvrir les parties inférieure et supérieure afin d'éviter les fuites et l'évaporation. Après 45 min d'incubation, les unités de détection ont été retirées pour une détection colorimétrique, qui a été réalisée en ajoutant 1,0 μL de concentré 10 000x SYBR green I dans du diméthylsulfoxyde (ThermoFisher Scientific) à chaque unité de détection. Nous avons utilisé le vert SYBR, un colorant fluorescent, pour la détection colorimétrique des amplicons ; le changement de couleur peut être visualisé à l'œil nu ou enregistré à l'aide d'une caméra de smartphone. Pour faciliter la visualisation, une lampe de poche à DEL bleue ULAKO (diode électroluminescente) (Amazon, WA, États-Unis) alimentée par une pile AA a été utilisée pour observer la fluorescence verte en présence d'E. coli. Les résultats peuvent également être vérifiés par électrophorèse sur gel si nécessaire. Notez que LAMP produit une gamme d'amplicons de différentes tailles ; par conséquent, il n'a pas de bande de gel spécifique comme avec PCR34. Nous choisissons le vert SYBR car il détecte directement les amplicons, tandis que d'autres colorants tels que la calcéine35, le bleu d'hydroxy naphtol36 (HNB) ou le rouge de phénol37 détectent les sous-produits de l'amplification LAMP. D'autres colorants tels que SYTO-9 sont difficiles à visualiser à l'œil nu lorsqu'ils sont à une faible concentration qui n'inhibe pas la réaction LAMP, mais ils peuvent être utilisés pour une détection en temps réel avec un instrument38.

Pour étudier le temps d'incubation requis pour le test LAMP, des expériences LAMP en temps réel ont été réalisées en ajoutant 0,5 µL de concentré 10X SYBR green I (ThermoFisher Scientific) au mélange réactionnel LAMP de 25 µL. Le signal de fluorescence de la réaction LAMP a été lu via le système de PCR en temps réel QuantStudio 3 (ThermoFisher Scientific). Nous avons testé différentes quantités d'ADN d'E. coli, 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 et 8 × 101 copies, chacune ayant été ajoutée à une solution de réaction de 25 μL. Nous avons testé 3 réplicats de chaque concentration dont 3 témoins sans matrice (NTC).

Pour évaluer la limite de quantification (LoQ) du test LAMP pour la détection d'E. coli, l'ADN a été extrait des cellules E. coli DH5-α à l'aide du kit QIAamp DNA Mini (QIAGEN). La concentration de l'ADN purifié a été déterminée à 160 ng/µL à l'aide d'un spectrophotomètre ultraviolet-visible. Les copies/µL de l'ADN extrait ont été calculées, et ont été déterminées comme étant d'environ 3 × 107 copies/µL en utilisant le poids moléculaire du génome d'E. coli. Des dilutions en série de cette solution mère ont été réalisées en utilisant de l'eau exempte de nuclease (Fisher Scientific). 1 µL d'ADN purifié des différentes concentrations a été ajouté dans des réactions LAMP de 25 µL, avec un NTC.

Le nombre de copies a été calculé sur la base du nombre de paires de bases dans la séquence, qui a été déterminé à partir de NCBI GenBank (CP026085.1), contenant 4 833 062 paires de bases. Ensuite, en utilisant l'Eq. (1) ci-dessous39, nous avons calculé le nombre de copies de l'ADN purifié.

Des échantillons d'eau environnementale ont été prélevés dans la région nord-est de la Floride, à Pellicer Creek (emplacement de la carte : 29,66260 N 81,26837 W), Mouth of Pellicer Creek (29,66431 N 81,22892 W) et Whitney Lab Docks (29,669249 N 81,216506 W). Pellicer Creek est lié à des zones résidentielles et son écoulement d'eau vers ou depuis (selon la marée) Whitney Lab Docks qui se trouve à côté de l'océan Atlantique. L'échantillon n° 1 a été prélevé sur les quais du Whitney Lab le 30 août 2019, tandis que l'échantillon n° 2 a été prélevé à l'embouchure du ruisseau Pellicer le 6 septembre 2019. Notez que l'échantillon n° 1 a été prélevé avant que l'ouragan Dorian ne frappe la région, tandis que l'échantillon n° 2 a été prélevé après l'ouragan. Les deux ont été filtrés à l'aide d'un filtre en fibre de verre Whatman et d'une pompe péristaltique. Les échantillons n° 3 et n° 4 (trois répétitions pour chaque échantillon) ont été prélevés au Pellicer Creek et au Whitney Lab Docks, respectivement, le 26 mai 2021. Un résumé des informations sur les échantillons environnementaux est présenté dans le tableau supplémentaire S2. Les échantillons #3 et #4 ont été reçus non filtrés et en aveugle par le chercheur qui a réalisé les expériences pour valider la plateforme. Certains des échantillons n° 3 et n° 4 ont été filtrés à l'aide d'un filtre en fibre de verre Whatman (0,7 µm) et d'une seringue de 50 ml, et les performances du test ont été comparées entre les échantillons filtrés et non filtrés. Tous les échantillons d'eau ont été traités à l'aide de l'appareil de la Fig. 1.

Pour étudier les effets possibles du sel dans l'eau de mer sur la préparation des échantillons et le dosage LAMP et pour démontrer la capacité de traiter une grande variété d'échantillons d'eau, nous avons testé la plate-forme à l'aide d'échantillons préparés en dopant des cellules E. coli DH5-α dans de l'eau déminéralisée (DI), contenant 3,5 %, 2,0 %, 0,5 % et 0,0 % (pourcentage en poids) de chlorure de sodium (NaCl). Ces concentrations ont été choisies pour simuler la concentration de sel dans l'eau des océans (3,5 %) à l'eau douce (~ 0 %). Toute concentration entre eux peut être trouvée dans l'eau à différents points des estuaires. Cinq répliques ont été testées pour chaque concentration de sel. Pour préparer ces échantillons, des cellules E. coli DH5-α dans un milieu de suspension ont été ajoutées à un tube de 2 ml, centrifugées pour former un culot cellulaire. Après avoir retiré le milieu surnageant, le culot cellulaire a été remis en suspension dans 0,4 ml d'eau DI et mélangé par vortex pulsé. L'échantillon a ensuite été divisé en quatre tubes de 2 ml. Chaque tube a été centrifugé à nouveau, et l'eau DI a été jetée, suivie de l'ajout de 1 ml d'eau contenant un type de concentration de sel.

La figure 1 montre la conception du dispositif pour l'extraction, l'enrichissement, la purification et la détection d'ADN d'E. coli dans des échantillons d'eau environnementaux. L'appareil se compose d'une unité tampon en haut, d'une unité de mélange au milieu, d'une unité de détection insérée sur le côté inférieur de l'unité de mélange et d'un conteneur à déchets. L'unité de tampon contient les réactifs nécessaires à la préparation des échantillons ; chaque solution est évacuée en faisant tourner l'unité tampon sur l'unité de mélange pour actionner les vannes à bille. Ces vannes de contrôle des fluides empêchent les réactifs de descendre jusqu'à ce que les billes soient soulevées par la goupille dans l'unité de mélange. Ces réactifs se mélangent ensuite et passent par l'unité de détection pour la collecte de l'ADN purifié sur le papier de chromatographie, suivi d'une amplification de l'ADN via LAMP. Les réactifs peuvent être préemballés dans l'unité tampon pour le stockage et le transport pendant que les puits sont scellés, et les vannes à bille n'ont montré aucune fuite lorsque de la cire est utilisée pour fixer les billes comme indiqué précédemment28.

Notre dispositif intègre toutes les étapes nécessaires pour un dosage d'acide nucléique, y compris la lyse, l'enrichissement et la purification de l'ADN, l'amplification et la détection. En conséquence, notre plate-forme élimine le besoin de transporter des échantillons du site d'échantillonnage à un laboratoire. Il a également un temps de test beaucoup plus court que les approches basées sur la culture. Par rapport aux méthodes traditionnelles de préparation d'échantillons basées sur des colonnes d'extraction solides, l'enrichissement de l'ADN sur un bloc de papier réduit encore les étapes telles que le transfert d'ADN entre les tubes, en évitant d'éventuels problèmes de contamination et de dégradation et en éliminant toute étape d'élution pour extraire l'ADN de la colonne solide. L'ADN dans le bloc de papier de notre appareil peut être directement utilisé pour LAMP, offrant des avantages significatifs par rapport à la méthode de la colonne d'extraction car tout l'ADN ne peut pas être élué de la colonne et il n'y a pas de dilution lorsque l'étape d'élution est éliminée. Un papier de chromatographie en cellulose non traité a été choisi pour l'enrichissement de l'ADN après sa comparaison avec la carte FTA et le papier en microfibre de verre disponibles dans le commerce, montrant un enrichissement légèrement meilleur en acides nucléiques des virus de la grippe40.

Pour optimiser la taille du papier dans l'unité de détection, nous avons effectué l'analyse suivante. Nous avons calculé le temps de préparation de l'échantillon à l'aide de l'équation. (2). Le volume de l'échantillon est de 1 mL, tandis que le volume total des réactifs des tampons de lyse/liaison/lavage est de 1,4 mL. La vitesse d'écoulement est de 4,33 mm/min selon le fabricant du papier de chromatographie. Il est compréhensible que plus la surface du cercle de papier est grande, plus le temps de préparation de l'échantillon est court. Le temps calculé en fonction du diamètre du papier est illustré à la Fig. S2a supplémentaire. Les résultats montrent que le temps de préparation théorique est réduit de 44 à 19 min lorsque le diamètre du papier est augmenté de 4 à 6 mm. On observe également qu'à partir d'un certain format de papier (> 7 mm), la diminution du temps de préparation des échantillons n'est pas significative. Dans le même temps, lorsque le diamètre du cercle de papier augmente, le volume de mélange LAMP nécessaire pour couvrir toute la surface augmente proportionnellement à la surface (ou au carré de diamètre). Étant donné que le volume du mélange LAMP est de 25 µL dans un puits de 4 mm, comme nous l'avons précédemment signalé28,29, le volume de mélange LAMP requis pour une autre taille de cercle de papier peut être calculé à l'aide de l'équation. (3). Les résultats sont tracés dans la Fig. S2b supplémentaire, et ils indiquent que le volume, et par conséquent le coût du mélange LAMP, augmente considérablement. En conséquence, nous avons choisi une taille de papier de 6 mm de diamètre et un volume de mélange LAMP de 50 µL pour une comparaison expérimentale.

Nous avons utilisé les échantillons d'eau #1 et #2 (tous deux filtrés lorsque les échantillons étaient fournis) pour comparer le temps de préparation des échantillons entre les blocs de papier de 4 mm et de 6 mm de diamètre. Nous avons constaté une grande différence, comme résumé dans le tableau supplémentaire S3. Les échantillons ont pris plus de 131 min. à traiter avec les papiers de 4 mm de diamètre, alors qu'ils prenaient 23 min. pour les papiers de 6 mm de diamètre. Ces résultats ont confirmé la bien meilleure performance du format de papier plus grand de notre appareil. L'un des inconvénients de l'utilisation d'un papier de 6 mm de diamètre est son augmentation du volume de mélange LAMP comme mentionné ci-dessus, ainsi que le coût des réactifs qui en résulte. Nous avons également comparé le temps de préparation des échantillons de deux types d'échantillons supplémentaires à l'aide de papiers de 6 mm de diamètre : des échantillons d'eau non filtrée et des échantillons d'eau distillée additionnés de sels pour les expériences de salinité. Nous avons observé que le temps diminuait d'environ 8 min. des échantillons non filtrés (31 min.) aux échantillons filtrés (23 min.), et il a encore été réduit environ 4 min des échantillons filtrés aux échantillons dopés (19 min.), respectivement. Les résultats sont également résumés dans le tableau supplémentaire S3.

Nous avons utilisé une machine PCR en temps réel pour identifier le temps minimum requis pour le test LAMP. La figure 3a montre les courbes d'amplification de fluorescence moyenne pour 4 concentrations d'ADN différentes, en utilisant 3 répétitions pour chaque courbe. Tous les échantillons ont franchi la ligne de seuil (définie comme 10 fois l'écart type du bruit de fond au-dessus de la ligne de base) en 35 min et ont atteint un plateau en 45 min. En conséquence, nous avons choisi 45 min comme temps de réaction LAMP. Toutes les réactions de la Fig. 3 ont été incubées pendant 60 min et aucune amplification non spécifique n'a été observée dans toutes les répliques de NTC. Étant donné que LAMP implique de nombreuses étapes complexes, le signal de fluorescence n'est pas corrélé avec la quantité de bactéries de départ. Cependant, le temps seuil peut être utilisé pour établir une corrélation avec la quantité initiale de bactéries, comme dans PCR41. La figure 3b montre la courbe d'étalonnage entre le temps de seuil (qui a été fourni par l'instrument) et la quantité bactérienne, indiquant que la détection semi-quantitative d'E. coli est réalisable.

Amplification LAMP en temps réel à l'aide d'ADN purifié d'E. coli DH5-alpha. ( a ) Signal fluorescent de 8 × 104, 8 × 103, 8 × 102 et 8 × 101 copies bactériennes par réaction en fonction du temps. NTC, contrôle sans modèle. ( b ) Courbe d'étalonnage montrant le temps de seuil (Ct) en fonction des copies dans chaque réaction (en échelle logarithmique). Les résultats ont été générés à partir de 3 répétitions de chaque concentration d'échantillons d'ADN. Les barres d'erreur indiquent un écart type.

Nous avons étudié la limite de quantification du test LAMP en utilisant 300, 30, 3 et 1 copies d'ADN d'E. coli DH5-α et avons observé les signaux positifs dans les 5 réplicats de 300, 30 et 3 copies, comme illustré à la Fig. de 10 copies par réaction30. Les résultats ont été confirmés par électrophorèse sur gel. Les résultats de ces expériences répétitives non contenues dans la figure 4 sont présentés dans la figure supplémentaire S3.

( a ) Photos des tubes de réaction prises sous la lumière de la pièce après essai LAMP à 62, 5 ° C pendant 45 min. La quantité d'ADN d'E. coli est de 300 copies pour le contrôle positif (P), et les autres sont marqués sur les tubes, 30, 3 copies et 1 copie, ainsi qu'un contrôle négatif (N). (b) Mêmes tubes de (a) sous la lampe de poche LED bleue. ( c ) Électrophorèse sur gel de ces échantillons en ( a ).

Nous avons d'abord testé les échantillons d'eau filtrée #1 et #2, dont les coliformes totaux ont été mesurés à 517,2 UFC/100 mL et 270 UFC/100 mL à l'aide du système IDEXX Colilert. Notez que les coliformes totaux sont une collection de différents types de bactéries, y compris E. coli et bien d'autres. Après avoir testé chaque échantillon cinq fois, nous avons obtenu des résultats positifs pour les cinq tests de l'échantillon #1, et quatre tests sur cinq pour l'échantillon #2. La figure supplémentaire S4 montre les résultats de 3 répétitions pour chaque échantillon.

Étant donné que la quantité d'E. coli dans ces deux échantillons (#1 et #2) n'est pas disponible (seuls les coliformes totaux ont été mesurés à ce moment-là), nous avons collecté plus d'échantillons : trois échantillons répétés du Pellicer Creek (échantillon #3) et trois échantillons des Whitney Lab Docks (échantillon #4). Après avoir mesuré les coliformes totaux et E. coli à l'aide du système IDEXX Colilert, ces répliques ont été données en aveugle aux chercheurs qui ont réalisé les expériences ci-dessous à l'aide du dispositif décrit dans ce travail. Tout d'abord, chaque réplique d'échantillon a été testée 2 fois, et nous avons obtenu des résultats positifs pour les 6 tests pour trois répliques de l'échantillon #4, mais seulement 2 tests sur 6 pour trois répliques de l'échantillon #3, 1/2 pour les répliques #1 et #2, et 0/2 pour la réplique #3. Pour confirmer les résultats, nous avons testé l'échantillon n° 3 une fois de plus et avons obtenu des résultats positifs pour les réplicats n° 1 et n° 2, et négatifs pour le réplicat n° 3.

Ces résultats de test ont été partagés avec ceux qui ont fourni des échantillons en aveugle, puis comparés aux coliformes totaux et E. coli mesurés par le système IDEXX Colilert. Deux ensembles de données ne correspondaient pas exactement l'un à l'autre, comme le montre le tableau 1 ; l'échantillon #3 avait une concentration d'E. coli plus élevée que l'échantillon #4 basé sur le système IDEXX Colilert alors que notre appareil a détecté l'échantillon #4 avec plus de succès que l'échantillon #3. Au cours de ces expériences, il a été noté que tous les réplicats de l'échantillon n°3, en particulier le réplicat n°3, laissaient de nombreuses particules sombres sur le papier des unités de détection. Ainsi, nous soupçonnions que certains contaminants dans l'échantillon #3 auraient pu inhiber les réactions LAMP. Pour vérifier, nous avons filtré les échantillons n° 3 et n° 4 à l'aide de filtres en fibre de verre Whatman de 0,7 µm pour éliminer les matières particulaires, tout comme les échantillons n° 1 et n° 2 qui ont été traités (c'est-à-dire préalablement filtrés). Ensuite, nous avons testé les échantillons filtrés, ainsi que ceux non filtrés à des fins de comparaison ; ces résultats sont combinés dans le tableau 1 et quelques images d'unités de détection sont présentées à la figure 5.

Photos des unités de détection pour l'échantillon n ° 3 (a, b) collecté à Pellicer Creek (P1, P2, P3 pour trois répétitions d'échantillons) et l'échantillon n ° 4 (c et d) collecté à Whitney Lab Docks (W1, W2, W3), et comparaison entre les échantillons non filtrés (rangée du haut) et filtrés (étiquetés avec f, rangée du bas), ainsi qu'un contrôle positif (à gauche, dans un tube) et un contrôle sans modèle (à droite). Les photos en (a) et (c) ont été prises sous la lumière ambiante tandis que les photos en (b) et (d) ont été prises sous une lampe de poche à LED bleue avec un filtre en plastique jaune.

Pour l'échantillon n° 3, nous avons obtenu un taux de réussite de 100 % pour les échantillons filtrés contre un taux de réussite de 50 % pour les échantillons non filtrés. Ces résultats ont confirmé que les particules filtrées de l'échantillon #3 inhibaient les réactions LAMP. Pour l'échantillon #4, le taux de réussite entre les échantillons filtrés et non filtrés est similaire. La différence possible entre l'échantillon n ° 3 et l'échantillon n ° 4 est que l'échantillon n ° 3 a été prélevé à Pellicer Creek, qui est lié à des zones résidentielles, tandis que l'échantillon n ° 4 a été prélevé à Whitney Lab Docks, à côté de l'océan Atlantique. Par conséquent, la filtration pendant l'échantillonnage, comme pour les échantillons n° 1 et n° 2, doit être utilisée pour notre protocole de test de dispositif afin d'éliminer ce problème. Il convient également de noter que la filtration n'a pas affecté la détection, comme illustré par l'échantillon n° 4, à la fois filtré et non filtré, avec un taux de réussite des tests similaire.

Pour répondre à la préoccupation des effets possibles de l'eau de mer sur le test LAMP, nous avons effectué des expériences en utilisant des échantillons d'eau additionnés de diverses concentrations de sel et de la même quantité de cellules E. coli. La concentration en sel variait de 0 à 3,5 %, correspondant à l'eau douce et à l'eau de mer. Pour chaque concentration de sel, nous avons effectué 5 expériences répétées. Pour toutes les concentrations de sel, nous avons obtenu des résultats positifs dans 4 ou 5 tests sur 5, comme résumé dans le tableau 2. La figure supplémentaire S5 montre les images d'un résultat de test représentatif. Ces résultats suggèrent que la concentration de sel au niveau ou en dessous du niveau de l'eau de mer n'a pas d'effet significatif sur la préparation de l'échantillon ou sur les réactions LAMP. Notez que trois résultats négatifs dans le tableau 2 ont eu lieu dans les deux premières expériences lorsque le mélange n'était pas assez complet avant de diviser et d'introduire des cellules d'E. coli dans de l'eau salée. Après avoir résolu le problème, toutes les répliques ont été détectées avec succès.

Notre plate-forme avec préparation d'échantillons et LAMP est sensible, comme l'indique la détection constante d'E. coli dans l'échantillon n° 4 (réplique n° 3), qui contient 20 UFC/100 ml mesuré par le système IDEXX Colilert. Cela suggère que la limite de quantification (LoQ) de notre plateforme est d'au moins 0,2 UFC/mL, car nous avons utilisé des échantillons de 1 mL. Par conséquent, la LoQ de notre plateforme est au moins cinq fois inférieure au seuil limite suggéré par l'EPA, qui est de 100 UFC/100 mL7. Notez que la LoQ de notre test LAMP lui-même était de 3 copies en utilisant des échantillons d'eau additionnés d'E. coli, comme le montre la Fig. 4.

Nous avons développé une plateforme de test sur site pour la détection d'E. coli dans des échantillons d'eau environnementale. Par rapport à la plupart des appareils de la littérature, une caractéristique unique de notre plate-forme est sa préparation d'échantillon, qui consiste en trois étapes simples : (1) faire pivoter l'unité tampon, (2) attendre que les réactifs se mélangent et passent à travers le tampon en papier, et (3) retirer l'unité de détection à base de papier pour l'étape d'amplification suivante. L'amplification de l'ADN enrichi est obtenue en immergeant l'unité de détection dans une tasse à café alimentée par batterie maintenue à une température constante. Les résultats des tests sont indiqués par des changements de couleur, qui peuvent être observés à l'œil nu ou enregistrés par une caméra de smartphone. Notre plate-forme est facile à utiliser, portable pour les tests sur site, avec une faible limite de détection. De plus, cette plate-forme peut être facilement adaptée pour détecter d'autres agents pathogènes en modifiant simplement les séquences d'amorces dans le test LAMP.

La plate-forme dans ce travail suit des concepts de vannes similaires à ceux du VLEAD28 ou du 2-plex VLEAD29 précédemment développés, mais avec des modifications importantes pour l'application actuelle, comme résumé dans le tableau 3. Les principales différences incluent (1) le mécanisme de fonctionnement qui a été changé du glissement à la rotation, (2) le volume et le type d'échantillon traité, (3) les agents pathogènes cibles et (4) les kits et volumes de réactifs utilisés pour le processus de préparation des échantillons en raison de différents agents pathogènes/échantillons ciblés. Alors que VLEAD cible les virus à ARN et capture leur ARN, le dispositif de ce travail cible les bactéries à ADN et capture leur ADN. En raison de la nature des échantillons, l'appareil utilisé dans ce travail nécessite un volume d'échantillon beaucoup plus important puisque l'E. coli présent dans les eaux récréatives est beaucoup moins concentré que les virus dans les échantillons humains. C'est également une des raisons pour lesquelles nous avons ajouté un vide en option dans cet appareil pour permettre un résultat plus rapide si un mécanisme d'aspiration (par exemple, des seringues) est disponible au point de test. Il est prévisible d'adapter cette plate-forme pour des études basées sur les eaux usées telles que celles visant à estimer la prévalence et la transmission du coronavirus 2 du syndrome respiratoire aigu sévère (SARS-CoV-2) dans une communauté42.

Notre plate-forme de test portable sur site est capable (1) de détecter E. coli en dessous du seuil limite de 100 UFC/100 ml à l'aide du TAAN, (2) d'intégrer toutes les étapes nécessaires, y compris la préparation des échantillons, l'amplification de l'ADN et la détection dans une seule plate-forme sans avoir besoin d'équipement de laboratoire encombrant ou sophistiqué, et (3) d'obtenir les résultats en environ une heure. Les réactifs de notre plate-forme peuvent être pré-emballés dans l'unité tampon pour le stockage et le transport pour les tests sur site, et les vannes à bille n'ont montré aucune fuite pendant plusieurs semaines lorsque de la cire est utilisée pour fixer la bille au réservoir respectif. Le mélange LAMP peut également être préchargé dans des pipettes jetables et stocké avec des packs de glace. Une alternative au stockage à froid consiste à utiliser des réactifs RT-LAMP lyophilisés qui peuvent être stockés à température ambiante, comme indiqué ailleurs43,44. Par conséquent, notre plateforme peut être utilisée sur le terrain, en surveillant la qualité de l'eau sur place.

Comparée à d'autres plateformes portables pour la détection d'E. coli dans des échantillons d'eau, notre plateforme est l'une des meilleures en termes de délai d'obtention des résultats, de LoQ et de simplicité, qui sont 3 paramètres importants pour les plateformes de test sur site. La comparaison de ce travail avec d'autres plates-formes pour la détection d'E. coli dans l'eau est présentée dans le tableau 4.

L'une des raisons fondamentales de la faible LoQ de cette plate-forme est l'utilisation d'un grand volume d'échantillon d'eau (1 mL). Ce volume d'échantillon se compare favorablement à d'autres plates-formes, en particulier celles basées sur la microfluidique qui ne peuvent traiter que quelques microlitres45,46. Même si un appareil peut détecter une seule cellule, il ne suffit toujours pas de détecter des concentrations inférieures à 100 UFC/100 mL (car il n'y a aucune cellule dans 1 µL d'eau, à moins qu'une procédure de concentration ne soit effectuée au préalable). De plus, notre plateforme offre une sensibilité plus élevée que les immunoessais sur papier, qui ne sont pas suffisants pour détecter des concentrations inférieures à 100 UFC/100 mL, le seuil limite recommandé par l'US EPA. La limite de détection des dosages immunologiques sur papier est généralement supérieure à 50 UFC/mL47,48.

D'autres approches telles que celles basées sur des substrats enzymatiques offrent une sensibilité élevée et sont capables de traiter un grand volume d'échantillon. Cependant, ils ont des délais d'exécution longs, entre 4 et 12 h d'incubation, selon la concentration des échantillons10,11,12. Les tests d'amplification d'acide nucléique offrent à la fois une analyse rapide et une sensibilité élevée. Lin et al. a développé une membrane asymétrique pour traiter jusqu'à 10 ml d'échantillons d'eau, en la combinant avec une LAMP numérique dans les micropores de la membrane capable de détecter E. coli aussi bas que 0,3 cellules/ml en 1 h25. Néanmoins, elle nécessite du matériel de laboratoire pour l'amplification et la détection, dont un microscope à fluorescence25.

Les données utilisées au cours de l'étude en cours seront mises à disposition par l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

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Ce travail a été soutenu par l'Université de Floride par le biais de l'Initiative Moonshot et en partie par les National Institutes of Health des États-Unis (R01AI155735). Nous apprécions David Kaplan, Thomas Bianchi, Peter Ifju et le reste du groupe iCoast pour leur collaboration et leur aide.

Groupe interdisciplinaire des microsystèmes, Département de génie mécanique et aérospatial, Université de Floride, PO Box 116250, Gainesville, FL, 32611, États-Unis

Charles Apples, Mortise Alipanah, George Adedokun et Z. Hugh Fan

Département des sciences de l'ingénierie environnementale, Université de Floride, PO Box 116580, Gainesville, FL, 32611, États-Unis

Élise Morrison

Département de génétique moléculaire et de microbiologie, Université de Floride, PO Box 100266, Gainesville, FL, 32610, États-Unis

Jeune S. Kim et Shouguang Jin

Whitney Laboratory of Marine Bioscience, Université de Floride, PO Box 116580, St. Augustine, FL, 32080, États-Unis

Todd Z.Osborne

Département des sciences du sol, de l'eau et des écosystèmes, Université de Floride, PO Box 110290, Gainesville, FL, 32611, États-Unis

Todd Z.Osborne

J. Crayton Pruitt Family Department of Biomedical Engineering, Université de Floride, PO Box 116131, Gainesville, FL, 32611, États-Unis

Z.Hugh Fan

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CM a effectué la recherche, développé les méthodes, organisé les données, créé les figures et rédigé le document. MA et GA ont aidé à effectuer la recherche. YSK et SJ ont préparé des échantillons de bactéries et mesuré la concentration d'ADN. EM a fourni les échantillons, développé les méthodes et fourni les ressources. TZO a acquis des fonds, fourni les échantillons, fourni les ressources et supervisé les travaux. ZHF a développé le concept, acquis des fonds, développé les méthodes, fourni les ressources, supervisé le travail et rédigé le document. Tous les auteurs ont examiné et approuvé le manuscrit final pour publication.

Correspondance à Elise Morrison, Todd Z. Osborne ou Z. Hugh Fan.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Manzanas, C., Morrison, E., Kim, YS et al. Dispositifs de test moléculaire pour la détection sur site d'E. coli dans des échantillons d'eau. Sci Rep 13, 4245 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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Reçu : 09 décembre 2022

Accepté : 08 mars 2023

Publié: 14 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-31208-4

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