Blog

Oct 24, 2023

Immunogénicité d'un sécrété, C

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 296 (2023) Citer cet article

729 accès

1 Altmétrique

Détails des métriques

Les vaccins à virus vivants, atténués et tués actuels contre le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) ont leurs limites. Nous rapportons ici le développement d'un vaccin sous-unitaire du BVDV par (i) l'expression d'une forme sécrétée d'une glycoprotéine E2 recombinante à l'aide de cellules BHK21 et (ii) la détermination des réponses immunitaires chez la souris. La glycoprotéine E2 a été modifiée par suppression du domaine d'ancrage transmembranaire C-terminal et fusion à une étiquette d'épitope V5. Cela a permis la détection en utilisant des anticorps monoclonaux anti-V5 avec une simple purification de la forme exprimée, sécrétée, de E2 à partir du milieu cellulaire. De plus, nous avons génétiquement fusionné la protéine fluorescente verte (GFP) liée à E2 via une séquence de saut de ribosome du virus Thesea asigna 2A (T2A), créant ainsi une polyprotéine d'auto-traitement [GFP-T2A-BVDV-E2trunk-V5], produisant des produits de traduction discrets [GFP-T2A] et [E2trunk-V5]. oculé avec [E2trunk-V5] purifié à partir de milieux cellulaires et des réponses immunitaires humorales et cellulaires ont été observées. Notre système d'expression d'antigène fournit, par conséquent, à la fois (i) un protocole de purification d'antigène simple et (ii) une stratégie réalisable pour une production ultérieure à grande échelle de vaccins.

Le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) est un agent infectieux majeur chez les bovins, les porcs et les autres ruminants ; il provoque une diarrhée virale bovine et une maladie des muqueuses, entraînant divers résultats cliniques allant d'une maladie bénigne à une maladie aiguë et grave mettant la vie en danger1. Les signes cliniques de l'infection par le BVDV comprennent la fièvre, la dépression, l'anorexie, les érosions des muqueuses, les écoulements oculaires et nasaux purulents, la toux, l'atonie du rumen, la diarrhée, l'avortement et la diminution de la production de lait2. L'infection par le BVDV provoque également une immunosuppression, augmentant ainsi la sensibilité à la pneumonie bactérienne ou virale3. Chez les animaux présentant une immunosuppression induite par le BVDV, l'exposition à d'autres agents pathogènes peut augmenter considérablement leur morbidité et leur mortalité, avec un impact économique négatif correspondant sur les industries bovine et laitière4,5.

Le génome du BVDV est un ARN monocaténaire à détection positive d'environ 12,3 kb. Le BVDV appartient au genre Pestivirus de la famille des Flaviviridae, avec le virus de la maladie des frontières (affectant les ovins) et le virus de la peste porcine classique6. Le BVDV comprend deux génotypes principaux : BVDV-1 (Pestivirus A, divisé en 22 sous-types de BVDV-1a à BVDV-1v) et BVDV-2 (Pestivirus B, divisé en quatre sous-types de BVDV-2a à BVDV-2d). Un autre pestivirus atypique connu sous le nom de virus de type HoBi a été provisoirement identifié comme étant le BVDV-3, qui comporte quatre sous-types7. Chaque BVDV a deux biotypes, cytopathe et non cytopathie, selon les effets du virus cultivé sur des cellules cultivées. La souche non cytopathique n'endommage pas les cellules infectées8. Il peut infecter le fœtus en développement si les vaches sont exposées au virus au début de la gestation. De plus, le BVDV se perpétue dans le troupeau par la production de veaux infectés de manière persistante (IP)9, car ils deviennent immunotolérants au virus et excrètent de grandes quantités de virus tout au long de leur vie. Par conséquent, les animaux PI sont considérés comme une source majeure de propagation du BVDV10. Les mesures les plus efficaces dans les programmes de prévention du BVDV comprennent les mesures de biosécurité, l'éradication des bovins IP et la vaccination5,11.

Les vaccins actuels contre le BVDV sont des vaccins à virus vivants modifiés multivalents et des vaccins à virus inactivés11,12,13,14. Les vaccins vivants, atténués et inactivés disponibles dans le commerce ont une innocuité et une efficacité limitées : le vaccin à virus vivant modifié peut redevenir virulent et conduire à des veaux IP, tandis que le vaccin à virus inactivé a une courte durée de protection et ne peut pas stimuler une réponse immunitaire cellulaire15. Par conséquent, un vaccin BVDV sous-unitaire sûr et efficace est nécessaire pour une protection à long terme des bovins contre le BVDV.

La protéine transmembranaire E2 est l'une des protéines structurales du BVDV, ancrée dans la membrane virale via le domaine C-terminal. En tant que glycoprotéine immunogène majeure, E2 est impliquée dans la fusion du virus avec les cellules hôtes et contient des sites antigéniques majeurs qui peuvent déclencher des anticorps neutralisants lors d'une infection par le BVDV16,17. Par conséquent, E2 est un candidat de choix pour la conception de vaccins sous-unitaires. Dans cette étude, nous avons développé un système d'expression eucaryote pour exprimer la glycoprotéine E2 recombinante qui a été clonée avec le domaine d'ancrage transmembranaire supprimé, permettant à cette glycoprotéine tronquée E2 d'être sécrétée dans le milieu de culture tissulaire après la transfection de cellules de mammifères. La glycoprotéine E2 recombinante a été produite dans des cellules de mammifères pour assurer les modifications post-traductionnelles correctes, et les schémas de glycosylation corrects se sont avérés immunogènes chez la souris. Les séquences codant pour la forme délétée du domaine transmembranaire de E2 ont été génétiquement fusionnées à l'étiquette d'épitope V5 pour (i) la détection des protéines par Western blot et (ii) la purification de l'E2 tronquée exprimée à partir du milieu cellulaire. De plus, nous avons utilisé la séquence auto-clivante du virus Thesea asigna 2A (T2A) pour lier le gène E2 tronqué et la protéine fluorescente verte (GFP). Les peptides 2A sont petits et peuvent médier efficacement le clivage pour la co-expression de plusieurs gènes18,19. La GFP a été utilisée comme marqueur de substitution pour l'expression de la protéine E2, ce marqueur étant facilement visualisé par microscopie à fluorescence non invasive à cellules vivantes après transfection de cellules rénales de bébé hamster (BHK)-21. Nous avons également évalué l'immunogénicité des glycoprotéines E2 tronquées C-terminales sécrétées chez la souris à travers une gamme de réponses immunitaires, à savoir le titre d'anticorps spécifiques de l'antigène dans le sérum, la prolifération des lymphocytes, la sous-population dans les splénocytes et la concentration de diverses cytokines.

La forme synthétisée C-terminale tronquée du gène BVDV E2 (Fig. 1A et B) a été initialement clonée dans le système pGEM-T Easy Vector et vérifiée par séquençage automatisé de Sanger avant d'être excisée (en utilisant ApaI et PstI) de ce vecteur et d'être transférée au vecteur d'expression pJC3 (Fig. 1C). Le programme NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0)20 a été utilisé pour prédire les sites de N-glycosylation à partir de la glycoprotéine BVDV E2 pleine longueur. Ce programme prédit que la glycoprotéine BVDV E2 pleine longueur possède 5 sites potentiels de N-glycosylation (N115, N184, N228, N259, 296) (Fig. 1D).

Structure du génome du BVDV et synthèse de la région codant pour la glycoprotéine E2. Organisation du génome du BVDV (pas à l'échelle) et traitement des polyprotéines (A). La stratégie de clonage et la synthèse des gènes codant pour les formes C-terminales tronquées (domaines d'ancrage transmembranaires supprimés) de la glycoprotéine E2 (zones encadrées) sont présentées, ainsi que le peptide signal (zone hachurée horizontale) et l'épitope C-terminal V5 étiquette (zone de barre oblique) (B). Clonage de la forme tronquée de la glycoprotéine E2 dans le vecteur d'expression pJC3. Le plasmide pJC3 code pour une polyprotéine [GFP-T2A-mCherry] codée par un seul cadre de lecture ouvert. La transcription est pilotée par l'activateur/promoteur du cytomégalovirus humain et l'ARNm polyadénylé par le signal de polyadénylation de l'hormone de croissance bovine. Les séquences codant pour la forme tronquée de la glycoprotéine E2 ont été excisées par restriction avec Apal et PstI du vecteur facile pGEM-T, puis insérées dans pJC3, également restreintes, pour éliminer mCherry FP et créer le plasmide [tronc GFP-T2A-BVDV-E2] (C). Le serveur NetNGlyc-1.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetNGlyc-1.0) a été utilisé pour prédire les sites N-glycosylés à partir des glycoprotéines E2 pleine longueur. Un potentiel de N-glycosylation > 0,5 était la valeur seuil pour les séquences (D).

Pour déterminer si la forme C-terminale tronquée de la glycoprotéine BVDV E2 a été sécrétée dans le milieu de culture cellulaire, des tests immuno-dot blot ont été utilisés sur le milieu en utilisant un anticorps monoclonal contre l'étiquette d'épitope V5 ou un antisérum anti-BVDV de souris présent à différents moments après la transfection. L'analyse par Western blot d'extraits de cellules BHK-21 transfectées a indiqué une expression maximale de la glycoprotéine E2 tronquée à 48 h. La bande protéique observée à ~ 55 kDa est quelque peu diffuse, ce qui correspond au degré d'hétérogénéité de la masse moléculaire qui résulte de la glycosylation des protéines (Fig. 2A). Les transferts de points immuns ont indiqué que la glycoprotéine E2 tronquée était sécrétée dans le milieu et reconnue par l'étiquette d'épitope V5 et l'antisérum BVDV (figure 2B); cette forme sécrétée était stable dans le milieu cellulaire pendant toute la durée de l'expérience (96 h), conformément aux données du Western blot.

Évaluation de l'expression de la glycoprotéine E2 tronquée. (A) Analyses Western blot d'extraits de cellules transfectées. Des échantillons d'extraits cellulaires ont été préparés et analysés (12 % SDS-PAGE) avant le transfert, comme décrit dans les méthodes. (B) Analyses immuno-dot blot des médias cellulaires. Milieux de culture tissulaire de cellules BHK-21 transfectées avec la glycoprotéine E2 tronquée aux moments indiqués. Les membranes ont été sondées avec l'anticorps monoclonal anti-V5 de souris (1:8000) ou l'antisérum anti-BVDV de souris (1:4000) comme anticorps primaire. Piste M : marqueur protéique précoloré, piste fictive : cellules BHK-21 non transfectées.

Les concentrations sériques d'anticorps spécifiques au BVDV de différents sous-types (IgG, IgG1 et IgG2a) ont été déterminées par ELISA. Après la première vaccination, le titre total d'anticorps IgG dans le groupe à forte dose était significativement (P < 0,05) supérieur à celui du groupe à faible dose jusqu'à la semaine 8 (Fig. 3A). De plus, la glycoprotéine E2 tronquée a stimulé la production simultanée d'anticorps IgG1 (Fig. 3B) et IgG2a (Fig. 3C). Par rapport au groupe témoin, le niveau d'IgG1 a été augmenté d'environ 3,5 fois et le niveau d'IgG2a d'environ 2,5 fois, indiquant une régulation positive des sous-types d'IgG associés à l'immunité dépendante des lymphocytes T.

Analyse ELISA des réponses d'anticorps spécifiques au BVDV induites par la glycoprotéine E2 tronquée : (A) IgG totale, (B) IgG1 et (C) IgG2a. Les réponses anticorps chez les souris ont été évaluées à 0, 2, 4, 6 et 8 semaines après immunisation intrapéritonéale avec 5 ou 35 μg de glycoprotéine E2 tronquée ou de PBS. Les souris ont reçu deux injections aux semaines 0 et 2. Les données sont présentées sous forme de valeurs d'absorbance moyennes ± écarts-types. Différentes lettres (a, b, c) sur la barre indiquent des différences significatives (P < 0,05) entre les groupes au même moment en utilisant le test de Duncan. () Groupe I : 5 µg de glycoprotéine E2 tronquée ; () Groupe II : 35 µg de glycoprotéine E2 tronquée ; () Groupe III : PBS.

Pour évaluer la réponse immunitaire à médiation cellulaire, des splénocytes de souris ont été isolés et restimulés in vitro avec 5 μg de glycoprotéine E2 tronquée. La prolifération des lymphocytes a été évaluée pour représenter l'indice de stimulation (SI). Comme l'illustre la figure 4, l'activité proliférative des lymphocytes T dans le groupe à forte dose était significativement (P < 0,05) supérieure à celle des groupes à faible dose et témoin. Aucun effet sur la prolifération lymphocytaire n'a été noté dans le groupe témoin, ce qui a montré que la glycoprotéine E2 tronquée peut induire une réponse immunitaire à médiation cellulaire in vivo.

Stimulation de la prolifération des lymphocytes de souris par la glycoprotéine E2 tronquée. L'indice de stimulation (SI) a été calculé en divisant la valeur moyenne de la DO des puits stimulés par celle des puits témoins (milieu uniquement). Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écarts-types de trois expériences individuelles. Les traitements avec des lettres différentes (a, b, c) sur la barre indiquent des différences significatives (P < 0,05). () Groupe I : 5 µg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe II : 35 µg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe III : PBS ;() Contrôle positif : ConA.

Pour déterminer le phénotype de la sous-population de lymphocytes T dans les lymphocytes de la rate, une cytométrie en flux a été réalisée, avec un marquage unique pour définir différentes sous-populations. À 4 semaines post-immunisation, le pourcentage d'augmentation des lymphocytes T CD4+ dans la rate était significativement plus élevé dans le groupe à forte dose (24,6 % ± 1,6 %, P < 0,05) que dans les autres groupes, et le pourcentage d'augmentation des lymphocytes T CD8+ dans la rate était significativement plus élevé dans le groupe à forte dose que dans le groupe à faible dose (5 μg) (10,7 % ± 1,0 % vs 7). 7 % ± 1,9 %, P < 0,05 ; figure 5).

Analyse par cytométrie en flux du pourcentage de lymphocytes T CD4+ et CD8+ dans la rate. Les souris ont été immunisées par voie intrapéritonéale deux fois aux semaines 0 et 2 avec la glycoprotéine E2 tronquée, et les souris du groupe témoin ont été immunisées avec du PBS. Des splénocytes de souris ont été isolés 4 semaines après l'immunisation et colorés avec des anticorps monoclonaux anti-CD4+ et CD8+ de souris. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écarts-types des souris dans le même traitement (n = 4). Différentes lettres (a, b, c) sur la barre indiquent des différences significatives (P < 0,05) entre les groupes au même moment.() Groupe I : 5 μg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe II : 35 μg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe III : PBS.

Pour mieux caractériser la polarisation de la réponse immunitaire, les concentrations de cytokines Th1, IL-12 (Fig. 6A) et IFN-γ (Fig. 6B), ou d'une cytokine Th2, IL-4 (Fig. 6C), dans le sérum des souris immunisées ont été mesurées aux semaines 0, 2 et 4. Contrairement aux sérums du groupe témoin, les sérums des souris des deux groupes d'étude contenaient de l'IL-12, de l'IFN-γ et de l'IL-4. Ces résultats démontrent que les glycoprotéines E2 tronquées peuvent efficacement déclencher à la fois des réponses Th1 et Th2 spécifiques.

Concentration des cytokines (A) IL-12, (B) IFN-γ et (C) IL-4 chez des souris immunisées avec 5 ou 35 μg de glycoprotéine E2 tronquée ou PBS. Les données sont présentées sous forme de moyenne ± écarts-types de la concentration sérique de chaque cytokine déterminée à l'aide de kits ELISA commerciaux. Différentes lettres (a, b, c) sur la barre indiquent des différences significatives (P < 0,05) entre les groupes au même moment.() Groupe I : 5 μg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe II : 35 μg de glycoprotéine E2 tronquée ;() Groupe III : PBS.

Le contrôle de l'infection par le BVDV chez les bovins repose sur des mesures de biosécurité, l'identification et l'élimination des bovins IP et la vaccination. Les veaux PI sont les principaux transmetteurs du BVDV car ils deviennent immunotolérants au virus et excrètent de grandes quantités de virus tout au long de leur vie. Par conséquent, les vaccinations aident maintenant à fournir des populations immunisées ; l'immunité est particulièrement vitale pour les femelles reproductrices du troupeau1. Ces dernières années, de nombreuses études ont tenté de développer des vaccins BVDV plus efficaces. Les vaccins vivants atténués ont été largement utilisés contre le BVDV, induisant de fortes réponses immunitaires humorales et à médiation cellulaire avec une forte protection du fœtus21,22. Les vaccins vivants atténués à base de la souche non cytopathique ne sont généralement pas recommandés pour la vaccination des animaux gravides car cette souche peut traverser le placenta et infecter le fœtus. Des études ont tenté de surmonter le problème de sécurité lié au développement d'un virus mutant en supprimant le gène Npro et en inactivant l'activité endoribonucléase de la glycoprotéine structurale Erns22,23, mais le virus vaccinal pourrait encore traverser le placenta24. Les vaccins inactivés sont sans danger pendant la grossesse25,26,27, mais leur efficacité est limitée car ils n'induisent pas de réponse immunitaire cellulaire28,29. Aucune protection croisée significative contre différentes souches virales n'a été signalée30,31. Par conséquent, le développement de vaccins sous-unitaires est une approche efficace. De plus, les antigènes exprimés dans différentes souches virales sont des candidats vaccins potentiels ; ces vaccins pourraient déclencher une protection croisée contre différentes souches de BVDV. Dans la présente étude, nous avons cloné et exprimé une glycoprotéine E2 tronquée. La glycoprotéine E2 est l'antigène le plus divergent parmi les BVDV de types 1 et 2 et les pestivirus de type HoBi, et elle peut déclencher des anticorps neutralisants16,17.

Les principaux objectifs de la présente étude étaient (i) de cloner une forme sécrétée tronquée de la glycoprotéine E2 du BVDV, (ii) d'utiliser la culture de cellules de mammifères comme plate-forme d'expression d'antigène et (iii) d'évaluer les effets immunitaires du vaccin chez la souris. La stratégie de construction que nous avons appliquée dans cette étude consistait à générer une fusion génétique de la glycoprotéine E2 tronquée C-terminale (ancre transmembranaire supprimée) avec la GFP liée via une séquence de saut de ribosome T2A pour créer une polyprotéine à auto-traitement (tronc GFP-T2A-BVDV-E2). Cette stratégie n'affecte pas la fonction de chaque protéine en aval de T2A18,19,32. De plus, les avantages de cette stratégie sont (i) la facilité d'identification et de quantification des intensités de signal de cellules vivantes de fluorescence GFP en utilisant des tests et (ii) le tri cellulaire activé par fluorescence ultérieur des cellules transfectées de manière stable. Les vaccins sous-unitaires dépendent souvent d'une seule protéine pour générer une réponse immunitaire efficace chez l'hôte vacciné ; ainsi, la quantité et l'authenticité antigénique de la protéine recombinante sont cruciales33. Par conséquent, notre glycoprotéine E2 tronquée a été exprimée dans des lignées cellulaires de mammifères pour produire davantage de repliement de protéines authentiques de type viral et de glycosylation complexe qui affecte diverses fonctions protéiques, notamment le repliement, la stabilité, l'activité, l'antigénicité authentique, le transport et la réponse immunitaire. Nos données ont indiqué que la glycoprotéine E2 tronquée a été sécrétée avec succès dans le milieu de culture tissulaire (Fig. 2B) et que l'expression continue est détectée dans la cellule (Fig. 2A), conformément à nos résultats précédemment rapportés32. Les analyses Western blot d'extraits cellulaires après transfection de la glycoprotéine E2 tronquée ont révélé une bande diffuse, plutôt qu'une bande discrète, du poids moléculaire prédit (55 kDa), caractéristique de la glycosylation (Fig. 2A). De plus, la glycoprotéine E2 tronquée présentait une antigénicité, comme démontré dans l'immunotransfert en utilisant un antisérum de souris anti-BVDV (Fig. 2).

Étant donné que la qualité de la réponse immunitaire est cruciale pour l'efficacité du vaccin, nous avons étudié la réponse immunitaire après immunisation avec le vaccin à glycoprotéine E2 tronquée. Lorsque le virus entier du BVDV a été utilisé comme antigène de revêtement ELISA, le titre d'IgG totales était significativement plus élevé dans les groupes de vaccination (glycoprotéine E2 tronquée) par rapport au groupe témoin après immunisation (Fig. 3A). De plus, la glycoprotéine E2 tronquée a médié à la fois les réponses d'anticorps IgG1 (Th2) (Fig. 3B) et IgG2a (Th1) (Fig. 3C) spécifiques au BVDV. De plus, les souris immunisées par le vaccin présentaient une prédominance d'IgG1, qui est liée à la réponse de décalage Th2. En parallèle, les niveaux d'IL-4 dans les groupes de vaccination étaient significativement plus élevés que ceux du groupe témoin (Fig. 6C). L'IL-4 est une cytokine représentative de type Th2 qui est associée à la prolifération, à la différenciation et à la maturité des cellules B et qui régule la production d'anticorps34. Pris ensemble, ces résultats révèlent que la glycoprotéine E2 tronquée est efficace pour induire une réponse immunitaire humorale spécifique.

Les cellules Th1 sont impliquées dans l'immunité cellulaire et sécrètent la cytokine effectrice de type Th1. Ainsi, le niveau de cytokine Th1 et l'activité proliférative des lymphocytes T peuvent refléter l'état de base de l'immunité cellulaire35. Nos données ont indiqué que les niveaux de cytokines de type Th1 (IL-12 et IFN-γ) dans les groupes de vaccination après immunisation étaient significativement plus élevés que dans le groupe témoin (Fig. 6A et B). Cependant, aucune différence significative n'a été observée entre les groupes à faible dose et à forte dose. Notamment, nous avons observé un SI nettement amélioré dans les lymphocytes T de la rate restimulés de souris immunisées avec la glycoprotéine E2 tronquée (Fig. 4). De plus, les pourcentages de cellules T CD4 + et CD8 + dans la rate des souris immunisées ont augmenté de manière significative, bien que CD4 + soit légèrement supérieur à CD8 + (Fig. 5), indiquant une forte activation des cellules T. Les cellules T CD4 + sécrètent un spectre de cytokines et sont essentielles à l'activation de l'immunité humorale et cellulaire, tandis que les cellules T CD8 + sont associées à l'activité cytokine des lymphocytes T pour éliminer les agents pathogènes intracellulaires 36. Ces résultats suggèrent que la glycoprotéine E2 tronquée peut induire une réponse immunitaire cellulaire chez la souris.

Dans cette étude, notre stratégie d'expression d'antigène a produit une protéine recombinante authentique de type viral sécrétoire et fournit une stratégie réalisable pour la production à grande échelle de vaccins ; une purification plus simple est possible avec une étiquette d'épitope V5. De plus, les glycoprotéines E2 tronquées induisent des réponses immunitaires humorales et cellulaires. Notamment, nous n'avons pas appliqué d'adjuvant supplémentaire dans la formulation du vaccin, soulignant l'immunogénicité favorable de la glycoprotéine E2 tronquée. Notre stratégie de construction nous a permis d'obtenir une expression antigénique de haute qualité et notre évaluation a confirmé l'efficacité du vaccin. Ces résultats prometteurs peuvent servir de base à d'autres recherches. À l'avenir, nous effectuerons des essais sur le terrain chez les bovins pour avoir une enquête plus détaillée sur l'efficacité et évaluer de manière exhaustive le potentiel de ce vaccin sous-unitaire contre le BVDV.

Le domaine transmembranaire de la glycoprotéine BVDV E2 a été prédit à l'aide du programme TMHMM-2.0 (https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?DeepTMHMM). À notre connaissance, seule la souche BVDV de type 2 a été signalée dans des troupeaux de bovins à Taïwan. Par conséquent, la forme C-terminale tronquée du gène BVDV E2 (acide nucléique en position 2462–3481) a été synthétisée à l'aide d'une séquence isolée de bovins en Chine (souche XJ-04, numéro d'accès de la séquence nucléotidique GenBank FJ527854) qui code également (i) un site de clivage de la protéase du virus de la morsure du tabac (-ENLYFQG-) qui peut être utilisé pour éliminer à la fois (ii) une courte séquence de liaison (-GSD QTENSG-) et (iii) l'étiquette d'épitope V5 (-GKPIPNPLLGLDST-COOH) (Fig. 1A et B). Le gène BVDV E2 synthétisé (Eurofins Genomics, Ebersberg, Allemagne) a été cloné dans le pGEM-T Easy Vector (Promega, Madison, WI, USA), conformément aux instructions du fabricant. Tous les clones ont été vérifiés par séquençage Sanger automatisé (GATC Biotech, Cambridge, Royaume-Uni).

La séquence codée du gène BVDV E2 a été digérée avec Apal et PstI (New England Biolabs, Hitchin, Royaume-Uni) et clonée dans le vecteur d'expression pJC3, restreint de manière similaire (Fig. 1C). Le vecteur d'expression pJC3 était basé sur pcDNA3.1, avec T2A liant la GFP et les gènes de la protéine fluorescente monomère de cerise (mCherry FP)37,38. Ceci a donné un clone codant pour la forme tronquée de la glycoprotéine E2 (tronc GFP-T2A-BVDV-E2).

Les cellules BHK-21 (BCRC n ° 60041) et les cellules de rein bovine de Bovine (MDBK) de Madin - Darby ont été obtenues auprès du centre de collecte et de recherche BioResource, et propagé dans le milieu essentiel minimum d'Eagle (Invitrogen, NY, CABE; CABE; CABE; CABE, CABADE, CAO, CAO INVACTIVE INVACTIVE FETAL , USA) dans 5% de CO2 à 37 ° C.

Dans cette étude, nous avons utilisé la souche BVDV de type 2 BVDV/TW 2014 obtenue du Large Animal Hospital, National Pingtung University of Science and Technology (NPUST), Taiwan39. Le virus a été cultivé dans des cellules MDBK. Les titres de BVDV ont été déterminés à l'aide de la méthode de Reed et Muench40 et exprimés en tant que dose infectieuse d'anticorps fluorescent FAID50/mL39,41. En bref, un échantillon de virus (100 μL) et des cellules MDBK (100 μL de 1 × 105 cellules/mL) ont été co-cultivés dans des plaques à 96 puits pendant 6 jours à 37 °C dans une atmosphère à 5 % de CO2. Une solution tamponnée Formalde-Fresh (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) a été utilisée pour fixer les cellules, et une dilution 1: 5 d'antisérum polyclonal conjugué à la fluorescence anti-BVDV (VMRD, Pullman, WA, USA) a été utilisée pour la détection du virus. Les puits fluorescents ont été observés à l'aide d'un microscope à fluorescence (Olympus CKX41, Olympus Co. Ltd., Tokyo, Japon).

Pour détecter la protéine sécrétée, l'ADN plasmidique a été transfecté dans des monocouches de cellules BHK-21 (1 × 107 cellules par flacon T-175, 70 % à 80 % de confluence) en utilisant le réactif de transfection d'ADN in vitro PolyJet (Laboratoires SignaGen, Ijamsville, MD, États-Unis) conformément aux instructions du fabricant. Le milieu et l'extrait cellulaire ont été recueillis à 24, 48, 72 et 96 h après la transfection dans les cellules BHK-21. Les milieux de culture cellulaire ont été collectés et clarifiés par centrifugation (2000 × g à 4 ° C pendant 15 min), et le surnageant a été décanté dans un nouveau tube avant d'être stocké à - 20 ° C. Les surnageants ont été décongelés sur de la glace avant d'être déposés sur une membrane de nitrocellulose (0,2 µm ; Bio-Rad, Hercules, CA, États-Unis), où ils ont été analysés par dot blot avec un anticorps monoclonal dirigé contre l'épitope V5 (1:8000 ; MBL International, Nagoya, Japon) ou un antisérum de souris anti-BVDV (1:4000)39 comme anticorps primaire et un anti-virus de chèvre marqué à la peroxydase de raifort (HRP). IgG de souris comme anticorps secondaire (1:8000; KPL, Gaithersburg, MD, USA). Le signal a été développé à l'aide du substrat Clarity Western ECL (Bio-Rad).

À 24, 48, 72 et 96 h après la transfection, les cellules BHK-21 ont été lavées et les cellules lysées à l'aide d'un tampon de lyse et d'extraction RIPA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, États-Unis) contenant un cocktail d'inhibiteurs de protéase sans EDTA (cOmplete; Roche Diagnostics, Burgess Hill, Royaume-Uni), conformément aux instructions du fabricant. Le lysat cellulaire a ensuite été analysé par SDS – PAGE et électrotransféré sur des membranes de transfert de difluorure de polyvinylidène (Immobilon-P; Merck Millipore, Tullagreen, Irlande). Après blocage avec du lait écrémé Difco à 5 % (p/v, BD, Le Pont de Claix, France), les membranes ont été sondées pendant une nuit à 4 °C avec un anticorps primaire qui reconnaissait l'épitope V5 (1:8000 ; MBL International) ou un antisérum de souris anti-BVDV (1:4000)39. Après avoir été lavées trois fois dans une solution saline tamponnée au Tris contenant du Tween 20, les membranes ont été incubées pendant 1 h à température ambiante avec de l'IgG-HRP de chèvre anti-souris comme anticorps secondaire (1:8000; KPL) et imagées à l'aide du système d'imagerie G: BOX et du logiciel d'analyse (Syngene, Frederick, MD, USA).

Pour quantifier la glycoprotéine E2 tronquée, les milieux ont été collectés 48h après transfection des cellules BHK-21. Le surnageant clarifié a été appliqué au kit de purification de protéines étiqueté V5 version 2 (MBL International) conformément au protocole du fabricant. Les fractions protéiques éluées contenant la glycoprotéine E2 tronquée ont été regroupées et concentrées à l'aide d'un filtre ultracentrifuge Amicon avec une taille de pores de 30 kDa (Merck Millipore, Burlington, MA, USA). L'estimation des protéines a été réalisée à l'aide du kit d'analyse de protéines Pierce BCA (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, États-Unis).

Le vaccin utilisé dans cette étude était un vaccin sans adjuvant, contenant une forme tronquée purifiée de la glycoprotéine E2 divisée en concentrations faible (5 µg) et élevée (35 µg) par dose. La concentration en antigène du vaccin était basée sur une précédente expérience dose-dépendante32. Les vaccins ne contenaient aucun micro-organisme viable, selon les résultats du test de stérilité.

Les expériences sur la souris ont été approuvées par le comité de protection et d'utilisation des animaux du NPUST et menées conformément aux règles d'éthique et aux lois de l'université (IACUC Approval No. 110-046). Les souris utilisées dans cette étude ont été élevées et hébergées dans un environnement aseptique pour les protéger des infections opportunistes. Les souris ont été maintenues sous un cycle lumière-obscurité de 12 h 12 à une température constante (22 ± 1 °C) et une humidité relative de 50 % ± 10 % ; tous les animaux avaient un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Tous les efforts ont été faits pour minimiser la souffrance des animaux, et les animaux ont été euthanasiés sans cruauté à la fin de la période d'étude. L'étude a été réalisée conformément aux directives ARRIVE.

Vingt-sept souris BALB/c âgées de 4 semaines (LASCO, Taipei, Taiwan) ont été réparties en trois groupes comme suit : groupe I (vaccination, n = 9), recevant 5 µg de glycoprotéine E2 tronquée ; groupe II (vaccination, n = 9), recevant 35 µg de glycoprotéine E2 tronquée ; et le groupe III (témoin, n = 9), recevant une solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les souris immunisées avec 5 et 35 ug de glycoprotéine E2 tronquée ont respectivement servi de groupes à faible dose et à forte dose. Les souris ont reçu deux injections intrapéritonéales aux semaines 0 et 2 avec 200 μL du vaccin. Des sérums ont été obtenus de chaque souris pour une détermination plus approfondie aux semaines 0, 2, 4, 6 et 8.

Les titres sériques spécifiques d'anticorps dirigés contre le BVDV ont été détectés par ELISA indirect. Des plaques de microtitration à fond plat en polystyrène (ExtraGENE, Taichung, Taïwan) ont été recouvertes de 1,25 μg/mL d'antigène viral entier (BVDV/TW 2014) dans un tampon de revêtement (15 mM Na2CO3, 35 mM NaHCO3 et 3 mM NaN3 ; pH 9,6) et laissées pendant la nuit à 4 °C. La concentration optimale du revêtement et la dilution du sérum ont été déterminées par titrage en damier. Les plaques ont été lavées trois fois avec du PBS contenant du Tween 20 (PBST), bloquées avec 1% de BSA (KPL) dans du PBST à 37 ° C pendant 1 h et lavées trois fois avec du PBST. Par la suite, 50 μL d'antisérum de souris dilué de manière adéquate ont été ajoutés aux puits en tant qu'anticorps primaire, et les plaques ont été incubées à 37 ° C pendant 1,5 h. Par la suite, les plaques ont été lavées quatre fois avec du PBST et 100 μL d'IgG anti-souris de chèvre (KPL) suffisamment diluées, d'IgG1 anti-souris (polyclone, Bethyl Laboratories, Montgomery, TX, USA) ou d'IgG2a anti-souris (polyclone, Bethyl Laboratories) ont été ajoutés comme anticorps secondaire. Les plaques ont ensuite été incubées à 37 ° C pendant 1 h et lavées quatre fois avec du PBST. Ensuite, 100 μL de substrat de peroxydase de micropuits à 2 composants TMB (KPL) ont été ajoutés et la réaction colorée a été effectuée pendant 10 minutes avant l'ajout de la solution d'arrêt TMB (KPL) pour arrêter la réaction. L'absorbance a été mesurée à 450 nm à l'aide d'un lecteur de microplaques (Anthos 2020 ; Anthos, Cambridge, Royaume-Uni).

Quatre semaines après l'immunisation, le test de prolifération des lymphocytes a été effectué à l'aide du test de prolifération cellulaire Cell Titer 96 AQueous One Solution (MTS; Promega). Les splénocytes de quatre souris sélectionnées au hasard par groupe ont été ensemencés dans une plaque à fond plat à 96 puits (1 × 106 cellules par puits) et co-cultivés avec de la glycoprotéine E2 tronquée (5 μg/mL) dans du RPMI-1640 additionné de 10 % de FBS et maintenus à 37 °C dans une atmosphère humidifiée à 5 % de CO2 pendant 72 h. De plus, des milieux sans cellules contenant du RPMI-1640 complet ont été analysés en parallèle au test. Les cellules seules ont servi de contrôle négatif et le puissant mitogène concanavaline A (ConA; Sigma-Aldrich, MO, USA) a été utilisé comme contrôle positif pour une concentration finale de 2 μg/mL. Chaque échantillon de splénocytes a été évalué en triple. Du MTS (3-(4,5-diméthylthiazol-2yl)-5-(3-carboxyméthoxyphényl)-2-(4-sulfophényl)-2H-tétrazolium) a été ajouté à chaque puits puis incubé pendant 4 h à 37 °C sous 5 % de CO2. L'absorbance à 490 nm a été mesurée. L'indice de stimulation a été déterminé comme suit : (diffraction optique [DO] du traitement - DO du fond)/(DO du contrôle négatif - DO du fond).

Quatre souris ont été utilisées pour déterminer la fréquence des lymphocytes T CD4+ et CD8+ pour chaque groupe test à 4 semaines après l'immunisation. En bref, les splénocytes des souris de chaque groupe ont été isolés en perturbant la rate à l'aide d'un corps de seringue de 3 ml dans du RPMI-1640 (Gibco, Grand Island, NY, USA). Après que les homogénats de rate ont été passés à travers un tamis cellulaire de 100 μm et traités dans un tampon de lyse ACK (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) pour lyser les érythrocytes, les cellules ont été lavées deux fois et remises en suspension dans du PBS contenant 1 % d'albumine de sérum bovin (1 × 107 cellules/mL). Des splénocytes isolés (106 cellules) ont été incubés avec du CD4+ anti-souris de rat conjugué au FITC et du CD8+ anti-souris de rat conjugué au PE (BD Pharmingen, San Jose, CA) à 4 ° C pendant 30 min dans l'obscurité. Par la suite, les cellules ont été lavées trois fois avec du PBS, et 50 000 cellules, selon la proportion de lymphocytes T CD4+ et CD8+, ont été caractérisées par cytométrie en flux à l'aide d'un instrument FACScalibur (BD Biosciences).

Les niveaux de cytokines dans le sérum prélevé sur des souris immunisées aux semaines 0, 2 et 4, respectivement, ont été détectés à l'aide d'interleukine commerciale (IL)-12 p70 (ab119531), d'interféron gamma (IFN-γ; ab100689) et IL-4 (ab100710) kits ELISA (Abcam, Cambridge, MA, États-Unis), conformément au protocole du fabricant. La concentration de chaque cytokine a été calculée en utilisant la courbe standard tracée.

Toutes les données ont été analysées à l'aide du logiciel statistique SAS (v. 9.0, Cary, NC, USA). Pour les expériences sur les souris, les différences entre les traitements à chaque instant ont été analysées à l'aide d'une analyse de variance et de comparaisons multiples de Duncan. Différentes lettres (a, b, c) sur la barre indiquent des différences significatives (P < 0,05) entre les groupes au même moment.

Les jeux de données générés et/ou analysés au cours de la présente étude sont disponibles dans le référentiel Uniprot, numéro d'accès C4NF75.

Fulton, RW Réponse de l'hôte au virus de la diarrhée virale bovine et interactions avec des agents infectieux dans le parc d'engraissement et le troupeau reproducteur. Produits biologiques 41, 31–38 (2013).

Article Google Scholar

Rebhun, WC et al. Thrombocytopénie associée à une infection aiguë par la diarrhée virale bovine chez les bovins. J. Vétérinaire. Interne. Méd. 3, 42–46 (1989).

Article CAS Google Scholar

Brock, KV La persistance du virus de la diarrhée virale bovine. Produits biologiques 31, 133-135 (2003).

Article Google Scholar

Houe, H. Caractéristiques épidémiologiques et importance économique des infections par le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV). Vétérinaire. Microbiol. 64, 89–107 (1999).

Article CAS Google Scholar

Richter, V. et al. Une revue mondiale systématique des pertes monétaires directes chez les bovins dues à l'infection par le virus de la diarrhée virale bovine. Vétérinaire. J. 220, 80–87 (2017).

Article Google Scholar

Schweizer, M. & Peterhans, E. Pestivirus. Annu. Rév. Anim. Biosci. 2, 141-163 (2014).

Article CAS Google Scholar

Decaro, N. et al. Pestivirus atypique et maladie respiratoire grave chez les veaux. L'Europe . Urgence Infecter. Dis. 17, 1549-1552 (2011).

Article Google Scholar

McClurkin, AW, Bolin, SR & Coria, MF Isolement du virus de la diarrhée virale bovine cytopathique et non cytopathique de la rate de bovins atteints de manière aiguë et chronique de diarrhée virale bovine. Confiture. Vétérinaire. Méd. Assoc. 186, 568-569 (1985).

CAS Google Scholar

Moennig, V. & Liess, B. Pathogenèse des infections intra-utérines par le virus de la diarrhée virale bovine. Vétérinaire. Clin. N. Am. Animation alimentaire. Pratique. 11, 477–487 (1995).

Article CAS Google Scholar

Yeşilbağ, K., Alpay, G. & Becher, P. Variabilité et distribution mondiale des sous-génotypes du virus de la diarrhée virale bovine. Virus 9, 128 (2017).

Article Google Scholar

Moennig, V. & Becher, P. Contrôle de la diarrhée virale bovine. Pathogènes 7, 29 (2018).

Article Google Scholar

Rodning, SP et al. Comparaison de trois vaccins commerciaux pour prévenir l'infection persistante par le virus de la diarrhée virale bovine. Thériogénologie 73, 1154-1163 (2010).

Article CAS Google Scholar

Koethe, S. et al. Un vaccin marqueur chimérique vivant synthétique modifié contre le BVDV-1 et le BVDV-2. Vaccins 8, 577–599 (2020).

Article CAS Google Scholar

Klimowicz-Bodys, MD et al. Réponse d'anticorps à un vaccin à virus vivant modifié contre la diarrhée virale bovine chez les bovins laitiers lors d'un essai sur le terrain. Vaccins 9, 259-266 (2021).

Article CAS Google Scholar

Al-Kubati, AAG, Hussen, J., Kandeel, M., Al-Mubarak, AIA et Hemida, MG Progrès récents sur la pathogenèse moléculaire du virus de la diarrhée virale bovine, la réponse immunitaire et le développement de vaccins. Devant. Vétérinaire. Sci. 8, 1–15 (2021).

Annonces d'article Google Scholar

Donofrio, G., Bottarelli, E., Sandro, C. & Flammini, CF Expression de la glycoprotéine E2 du virus de la diarrhée virale bovine sous forme sécrétée soluble dans une lignée cellulaire de mammifère. Clin. Vaccin Immunol. 13, 698-701 (2006).

Article CAS Google Scholar

Nogarol, C. et al. Infection à pestivirus dans les élevages bovins laitiers : l'ELISA de la glycoprotéine E2 révèle la présence du virus de la diarrhée virale bovine de type 2 dans le nord-ouest de l'Italie. Vétérinaire BMC. Rés. 13, 377–385 (2017).

Article Google Scholar

de Felipe, P. & Ryan, MD Ciblage de protéines dérivées de polyprotéines auto-traitantes contenant plusieurs séquences signal. Trafic 5, 616–626 (2004).

Article Google Scholar

de Felipe, P. et al. De l'une parmi tant d'autres : plusieurs protéines issues d'une polyprotéine auto-transformée. Tendances Biotechnol. 24, 68–75 (2006).

Article Google Scholar

Gupta, R. & Brunak, S. Prédiction de la glycosylation à travers le protéome humain et corrélation avec la fonction protéique. Pac. Symp. Bioinformatique. 7, 310–322 (2002).

Google Scholar

Fulton, RW, Cook, BJ, Payton, ME, Burge, LJ & Step, DL Réponse immunitaire aux vaccins contre le virus de la diarrhée virale bovine (BVDV) détectant les anticorps contre les sous-types de BVDV 1a, 1b, 2a et 2c. Vaccin 38, 4032–4037 (2020).

Article CAS Google Scholar

Platt, R., Kesl, L., Guidarini, C., Wang, C. et Roth, JA Comparaison des réponses immunitaires humorales et médiées par les lymphocytes T à une dose unique de vaccin Bovela® vivant à double délétion BVDV ou à une souche de BVDV de terrain. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 187, 20-27 (2017).

Article CAS Google Scholar

Meyers, G. et al. Virus de la diarrhée virale bovine : prévention de l'infection fœtale persistante par une combinaison de deux mutations affectant l'Erns RNase et la Npro protéase. J. Virol. 81, 3327–3338 (2007).

Article CAS Google Scholar

Wernike, K. et al. La présence d'une souche commerciale de vaccin vivant BVDV-1 double mutant Npro et Erns chez les veaux nouveau-nés. Virus 10, 274–281 (2018).

Article Google Scholar

Bolin, SR, Matthews, PJ & Ridpath, JF Méthodes de détection et de fréquence de contamination du sérum de veau fœtal par le virus de la diarrhée virale bovine et des anticorps contre le virus de la diarrhée virale bovine. J. Vétérinaire. Diag. Investir. 3, 199-203 (1991).

Article CAS Google Scholar

Makoschey, B., van Gelder, PT, Keijsers, V. & Goovaerts, D. Antigène du virus de la diarrhée virale bovine dans les lots de sérum de veau fœtal et conséquences d'une telle contamination pour la production de vaccins. Produits biologiques 31, 203-208 (2003).

Article CAS Google Scholar

Newcomer, BW, Walz, PH, Givens, MD & Wilson, AE Efficacité de la vaccination contre le virus de la diarrhée virale bovine pour prévenir les maladies reproductives : une méta-analyse. Thériogénologie 83, 360–365 (2015).

Article Google Scholar

Platt, R., Coutu, C., Meinert, T. & Roth, JA Réponses immunitaires humorales et à médiation cellulaire T au vaccin bivalent tué contre le virus de la diarrhée virale bovine chez les bovins de boucherie. Vétérinaire. Immunol. Immunopathol. 122, 8-15 (2008).

Article CAS Google Scholar

Stevens, ET et al. L'induction d'une réponse immunitaire à médiation cellulaire au virus de la diarrhée virale bovine avec un vaccin inactivé avec adjuvant. Vétérinaire. Là. 10, E1–E8 (2009).

CAS Google Scholar

Sozzi, E. et al. Réponse anticorps à réactivité croisée après vaccination avec des vaccins vivants et tués modifiés contre le virus de la diarrhée virale bovine (BVD). Vaccins 8, 374–383 (2020).

Article CAS Google Scholar

Walz, PH et al. Comparaison de la protection reproductive contre le virus de la diarrhée virale bovine fournie par des vaccins viraux multivalents contenant des fractions inactivées du virus de la diarrhée virale bovine 1 et 2. Vaccine 36, 3853–3860 (2018).

Article CAS Google Scholar

Lo, YT et al. Expression et immunogénicité des formes sécrétées des glycoprotéines du virus de la fièvre éphémère bovine appliquées au développement de vaccins sous-unitaires. J. Appl. Microbiol. 131, 1123-1135 (2021).

Article CAS Google Scholar

O'Flaherty, R. et al. Culture de cellules de mammifères pour la production de protéines recombinantes : un examen des étapes critiques de leur biofabrication. Biotechnol. Adv. 43, 107552–107568 (2020).

Article CAS Google Scholar

Chen, Q., He, F., Kwang, J., Chan, JK & Chen, J. GM-CSF et IL-4 stimulent les réponses anticorps chez les souris humanisées en favorisant la maturation des cellules T, B et dendritiques. J. Immunol. 189, 5223–5229 (2012).

Article CAS Google Scholar

Balenović, M., Savić, V., Ekert Kabalin, A., Jurinović, L. & Ragland, WL Abondance de transcrits de gènes IFN-α et IFN-γ et absence de transcrits d'IL-2 dans le sang de poulets vaccinés avec du NDV vivant ou inactivé. Vétérinaire Acta. Suspendu. 59, 141-148 (2011).

Article Google Scholar

Doherty, PC et al. Mécanismes des lymphocytes T CD4+ et CD8+ effecteurs dans le contrôle des infections virales respiratoires. Immunol. Rév. 159, 105–117 (1997).

Article CAS Google Scholar

Luke, GA & Ryan, MD Le problème de la coexpression des protéines en biotechnologie et en biomédecine : les séquences de type virus 2A et 2A fournissent une solution. Futur Virole. 8, 1–13 (2013).

Article Google Scholar

Minskaia, E., Nicholson, J. & Ryan, MD Optimisation du système de coexpression du virus 2A de la fièvre aphteuse pour des applications biomédicales. BMC Biotechnol. 13, 67-77 (2013).

Article CAS Google Scholar

Chung, YC et al. La protéine E2 recombinante améliore l'efficacité protectrice du vaccin inactivé contre le virus de la diarrhée virale bovine 2 dans un modèle caprin. Vétérinaire BMC. Rés. 14, 194-202 (2018).

Article Google Scholar

Reed, LJ & Muench, H. Une méthode simple d'estimation des paramètres à cinquante pour cent. Suis. J. Épidémiol. 27, 493–497 (1938).

Article Google Scholar

Kosinova, E., Psikal, I., Robesova, B. & Kovarcik, K. PCR en temps réel pour la quantification de l'ARN du virus de la diarrhée virale bovine à l'aide de la fluorimétrie SYBR green I. Vétérinaire. Méd. 52, 253–261 (2007).

Article CAS Google Scholar

Télécharger les références

Les auteurs tiennent à remercier le professeur Chun Yen Chu (NPUST, Taïwan) qui a acquis un financement et fourni des conseils scientifiques et le professeur RE Randall (Université de St. Andrews, Royaume-Uni) pour les anticorps anti-V5.

Ce travail a été soutenu par le ministère de la Science et de la Technologie de Taïwan [MOST-106-2911-I-020-501 ; MOST-107-2313-B-020-011-MY3] et le Conseil de recherche britannique sur la biotechnologie et les sciences biologiques [BB/P025080/1].

Programme de diplôme international en technologie des vaccins animaux, Collège international, Université nationale des sciences et technologies de Pingtung, n ° 1, Shuefu Rd., Neipu, Pingtung, 91201, Taïwan

Yi Ting Lo, Wan Chen Chang et Hsing Chieh Wu

Complexe de recherche en sciences biomédicales, École de biologie, Université de St Andrews, St Andrews, Écosse, Royaume-Uni

Martin D. Ryan et Garry A. Luke

Institut universitaire de technologie des vaccins animaux, Collège de médecine vétérinaire, Université nationale des sciences et technologies de Pingtung, Neipu, Pingtung, Taïwan

Hsing Chieh Wu

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

Vous pouvez également rechercher cet auteur dans PubMed Google Scholar

YTL a réalisé des travaux expérimentaux et rédigé le manuscrit. Le MDR a acquis un financement et a conçu le formulaire tronqué. GAL a effectué un clonage de construction. WCC a fourni une assistance technique pour les tests d'immunité. HCW a effectué le clonage de construction, l'analyse des données et rédigé le manuscrit. Tous les auteurs ont révisé et édité le manuscrit.

Correspondance avec Hsing Chieh Wu.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Libre accès Cet article est sous licence Creative Commons Attribution 4.0 International, qui permet l'utilisation, le partage, l'adaptation, la distribution et la reproduction sur tout support ou format, à condition que vous accordiez le crédit approprié à l'auteur ou aux auteurs originaux et à la source, fournissez un lien vers la licence Creative Commons et indiquez si des modifications ont été apportées. Les images ou tout autre matériel de tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans une ligne de crédit au matériel. Si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons de l'article et que votre utilisation prévue n'est pas autorisée par la réglementation légale ou dépasse l'utilisation autorisée, vous devrez obtenir l'autorisation directement du détenteur des droits d'auteur. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/.

Réimpressions et autorisations

Lo, YT, Ryan, MD, Luke, GA et al. Immunogénicité d'une forme sécrétée, tronquée en C-terminal, de la glycoprotéine E2 du virus de la diarrhée virale bovine en tant que candidat potentiel dans le développement de vaccins sous-unitaires. Sci Rep 13, 296 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

Télécharger la citation

Reçu : 09 août 2022

Accepté : 20 décembre 2022

Publié: 06 janvier 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-022-26766-y

Toute personne avec qui vous partagez le lien suivant pourra lire ce contenu :

Désolé, aucun lien partageable n'est actuellement disponible pour cet article.

Fourni par l'initiative de partage de contenu Springer Nature SharedIt

En soumettant un commentaire, vous acceptez de respecter nos conditions d'utilisation et nos directives communautaires. Si vous trouvez quelque chose d'abusif ou qui ne respecte pas nos conditions ou directives, veuillez le signaler comme inapproprié.