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Oct 22, 2023

Génome

Nature Genetics volume 55,

Nature Genetics volume 55, pages 268–279 (2023)Citer cet article

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Le profilage de l'expression génique a identifié de nombreux processus altérés au cours du vieillissement, mais la manière dont ces changements surviennent est largement inconnue. Ici, nous avons combiné le séquençage de l'ARN naissant et l'immunoprécipitation de la chromatine de l'ARN polymérase II suivie d'un séquençage pour élucider les mécanismes sous-jacents déclenchant les changements d'expression génique chez les souris âgées de type sauvage. Nous avons constaté que dans le foie de 2 ans, 40 % des ARN polymérases allongées sont bloquées, ce qui réduit la transcription productive et fausse la sortie transcriptionnelle d'une manière dépendante de la longueur du gène. Nous démontrons que ce stress transcriptionnel est causé par des dommages endogènes à l'ADN et explique la majorité des changements d'expression génique dans le vieillissement dans la plupart des organes principalement postmitotiques, affectant spécifiquement les voies caractéristiques du vieillissement telles que la détection des nutriments, l'autophagie, la protéostase, le métabolisme énergétique, la fonction immunitaire et la résilience au stress cellulaire. Le stress transcriptionnel lié à l'âge est conservé au cours de l'évolution des nématodes à l'homme. Ainsi, l'accumulation de dommages endogènes stochastiques à l'ADN au cours du vieillissement détériore la transcription basale, qui établit le transcriptome lié à l'âge et provoque un dysfonctionnement des principales voies caractéristiques du vieillissement, révélant comment les dommages à l'ADN sous-tendent fonctionnellement les principaux aspects du vieillissement normal.

Le vieillissement se caractérise par un déclin moléculaire, cellulaire et physiologique progressif entraînant une diminution de la vitalité, des maladies liées à l'âge et une augmentation de la mortalité. Étant donné que de nombreux processus déclinent ou sont modifiés avec l'âge1, on en sait étonnamment peu sur l'état fonctionnel du processus de transcription basale dans le vieillissement. Les cerveaux âgés de rats et de drosophiles produisent moins d'ARN messagers2,3 et la variation de transcription de cellule à cellule est augmentée dans plusieurs tissus4,5,6, tandis que la coordination transcriptionnelle gène à gène diminue avec le vieillissement7. Cependant, la transcription dans le vieillissement est principalement étudiée en relation avec les changements d'expression des gènes. La transcriptomique a contribué de manière significative à l'identification de nombreuses voies et processus cellulaires affectés par le vieillissement8,9,10. Bien qu'une partie des changements d'expression génique liés à l'âge et spécifiques à un organe puissent être expliqués par des facteurs de transcription, des microARN11,12, une modification de la composition des types cellulaires8,13 et des changements épigénétiques14,15, une méta-analyse transcriptomique récente a indiqué que la plupart des similitudes d'expression génique entre les organes de souris âgés ne pouvaient pas être attribuées à ces mécanismes de régulation connus8.

L'accumulation de dommages à l'ADN a été postulée comme une cause sous-jacente du vieillissement normal16,17 et des phénotypes transcriptionnels susmentionnés6,7,18,19, principalement sur la base de similitudes avec des cellules exposées à des agents endommageant l'ADN ou à des troubles de réparation prématurés de l'ADN tels que le syndrome de Cockayne et la trichothiodystrophie. Ces conditions présentent des défauts de réparation couplée à la transcription (TCR), ce qui conduit au blocage des ARN polymérases sur les lésions de l'ADN20, ce qui suggère que les dommages à l'ADN bloquant la transcription pourraient également être impliqués dans le vieillissement normal. Bien que les lésions endogènes de l'ADN bloquant la transcription s'accumulent au cours du vieillissement normal21,22,23,24,25, il n'est actuellement pas clair si elles provoquent des réponses transcriptionnelles significatives. Dans cette étude, nous avons analysé la transcription basale sous-jacente aux changements d'expression génique chez des souris âgées normales de type sauvage (WT) à l'aide d'une méthode de séquençage d'ARN naissant in vivo combinée à l'immunoprécipitation de la chromatine de l'ARN polymérase II (RNAPII) suivie d'un séquençage (ChIP-seq) et d'une imagerie confocale. Nous révélons un fort déclin transcriptionnel lié à l'âge et une distorsion de la sortie transcriptionnelle en accumulant des dommages à l'ADN en tant que phénotype général du vieillissement, provoquant des changements de transcription liés à l'âge en général, affectant en particulier les voies caractéristiques du vieillissement qui déterminent la durée de vie.

Pour étudier le processus de transcription dans le vieillissement normal, des souris mâles WT adultes (15 semaines) et âgées (2 ans) (n = 3 par groupe) ont reçu une seule injection intrapéritonéale d'éthynyl-uridine (EU), un analogue de l'uridine qui est incorporé dans l'ARN nouvellement synthétisé in vivo26. Cinq heures après l'injection, la coloration par fluorescence de l'EU a révélé un signal EU réduit de 1,5 fois dans les vieux foies (Fig. 1a). La diminution concernait l'ensemble du foie, affectant presque tous les hépatocytes et ne se limitait pas à la polyploïdisation liée à l'âge (Fig. 1b). Étant donné que la réduction du signal EU était pannucléaire, à l'exception des nucléoles (Fig. 1a), indiquant une transcription réduite dépendante de RNAPII, nous avons testé si des niveaux inférieurs de RNAPII pouvaient expliquer la transcription réduite. Étonnamment, la coloration par immunofluorescence de RNAPII utilisant les mêmes échantillons de foie a indiqué une augmentation de 1, 4 fois, plutôt qu'une diminution du foie âgé (Fig. 1c et Extended Data Fig. 1a). L'initiation de RNAPII et la pause proximale du promoteur, marquées par la phosphorylation des résidus de sérine 5 (ser5p) dans le domaine C-terminal (CTD) ne différaient pas de manière significative (Fig. 1d et données étendues Fig. 1b), ce qui suggère que l'activité du promoteur RNAPII à l'échelle du génome est largement inchangée dans le vieillissement. Cependant, l'allongement de RNAPII marqué par la phosphorylation de la sérine 2 CTD (ser2p) a démontré une augmentation de 1,5 fois (Fig. 1e et Extended Data Fig. 1c). Ces données indiquent que la transcription basale est altérée dans le foie âgé.

a, ARN naissant marqué par l'UE (vert) dans les noyaux d'hépatocytes (contre-coloration DAPI, bleu) dans le foie de souris adulte (bleu) et vieux (rouge). À droite, intensités de fluorescence quantifiées dans des diagrammes en boîte et moustaches. Les lignes médianes montrent les médianes, les limites de la boîte marquent l'IQR et les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. P = 2,1129 × 10−129 (test t bilatéral non apparié). Noyaux comptés : adulte n = 506 ; ancien n = 500 ; n = 3 souris par groupe. b, diagramme de dispersion XY de l'intensité de fluorescence de l'ARN naissant marqué par l'UE (unités arbitraires (au)) et des tailles nucléaires correspondantes mesurées dans les hépatocytes individuels du foie adulte WT (bleu) et vieux (rouge). c – e, RNAPII total (c), RNAPII phosphorylé à ser5p (d) et RNAPII phosphorylé à ser2p (e) coloration par immunofluorescence (rouge) dans les hépatocytes (contre-coloré par DAPI, bleu) dans le foie adulte et âgé. Graphiques en boîte et moustaches des intensités de fluorescence. Les lignes médianes montrent les médianes, les limites de la boîte marquent l'IQR et les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. Valeurs P par test t non apparié bilatéral, n = 3 souris par groupe. Noyaux comptés et valeurs P : c, adulte : n = 206 ; ancien : n = 155, P = 6,64186 × 10−21 ; j, adulte n = 2 926 ; ancien n = 2 643, P = 0,323195587 ; e, adulte n = 2 697 ; ancien n = 2 708. P = 0. Barre d'échelle, 50 μm. f, organigramme de la procédure expérimentale pour le séquençage de l'ARN naissant marqué par l'UE. g, fraction (%) des lectures EU-seq synthétisées par différentes ARN polymérases. RNAPI-II et mtRNAP (à gauche) et RNAPIII (à droite), avec des lectures de séquences totales d'adultes et de personnes âgées normalisées à 100 %. Les données sont la moyenne ± sem n = 3 souris par groupe. P = 0,012868073 (test t bilatéral non apparié). h, fraction (%) des lectures EU-seq par RNAPII à partir de régions introniques et exoniques. Les données sont la moyenne ± sem n = 3 souris par groupe. P = 0,013520897 (test t bilatéral non apparié).

Données source

Pour examiner ces observations apparemment contradictoires de réduction de la transcription et d'augmentation de l'abondance de RNAPII, nous avons sélectivement isolé et séquencé in vivo l'ARN naissant marqué par l'UE (EU-seq), ce qui a entraîné une proportion significativement plus élevée de lectures introniques par rapport au séquençage de l'ARN total (Fig. 1f et Données étendues Fig. 2a – c). Les expériences de contrôle ont indiqué des densités d'incorporation d'UE identiques dans les foies adultes et âgés (données étendues Fig. 2d – g), excluant une absorption inférieure de l'UE comme explication du signal inférieur de l'UE dans le foie âgé. Ensuite, nous avons déterminé la contribution de chaque ARN polymérase au pool d'ARN naissant cellulaire en attribuant des lectures aux espèces d'ARN transcrites par chacune des différentes polymérases. Comme prévu, la majorité de l'ARN marqué par l'UE provenait de RNAPII (Fig. 1g et Extended Data Fig. 2h), la seule ARN polymérase affichant une réduction significative de la synthèse d'ARN liée à l'âge, comme en témoigne également la diminution d'environ 1,5 fois des lectures de séquences dérivées d'intron (Fig. 1h). Comme les événements d'épissage n'ont pas été modifiés de manière significative (données étendues Fig. 2i, j), la disparité entre la réduction de la synthèse d'ARN de novo et l'augmentation de l'allongement de RNAPII suggère une productivité de RNAPII spécifiquement inférieure au vieillissement.

Pour examiner plus en détail l'écart entre l'abondance de RNAPII et la transcription, nous avons effectué ChIP-seq en utilisant des anticorps contre RNAPII total, ser5p et ser2p des mêmes foies décrits ci-dessus. Nous avons d'abord étudié si le silence du promoteur à l'échelle du génome pouvait expliquer la transcription réduite. En accord avec les résultats d'immunofluorescence (Fig. 1), l'occupation totale et ser5p RNAPII à l'échelle du génome au niveau des sites de début de transcription (TSS) pour tous les gènes ne différait pas significativement en fonction du vieillissement (Fig. 2a, b). De plus, la transition de RNAPII du promoteur à l'allongement productif n'a pas été modifiée (Fig. 2c). Pour évaluer la transcription en cours d'élongation précoce, nous avons mesuré la production d'ARN naissant à l'échelle du génome dans la première kilobase, telle que mesurée dans la première kilobase des régions introniques (Fig. 2d) ou à partir du TSS (Fig. 2e). Nous avons observé une corrélation de presque 1: 1 dans la première kilobase de transcription sur tous les gènes, ce qui indique que l'activité globale du promoteur menant efficacement à la transcription est en grande partie inchangée. Bien que l'activité réduite du promoteur à l'échelle du génome ne puisse pas expliquer le phénotype de transcription réduit, nous nous attendions à une transcription altérée par une activité de promoteur plus élevée ou plus faible. Tous les gènes exprimés (n = 3 970) qui représentent> 90% de la production d'ARN naissant dépendant de RNAPII ont été divisés en 3 bacs égaux de son TSS au site de terminaison de la transcription (TTS) et les lectures correspondantes de l'ARN naissant et du RNAPII ChIP-seq cartographié dans chaque bac ont été comparés entre le foie ancien et adulte. À l'aide d'une analyse de clustering, nous avons identifié des gènes qui étaient régulés à la hausse ou à la baisse de manière transcriptionnelle dans le vieillissement sur tous les bacs à la fois dans l'ARN naissant et RNAPII ChIP-seq (Fig. 2f et Extended Data Fig. 3a – c), qui reflètent la régulation du promoteur. Pour analyser si les gènes identifiés transcriptionnellement régulés positivement (n = 778) ou régulés négativement (n = 394) sont biologiquement pertinents pour le vieillissement, nous avons utilisé l'outil Enrichr pour l'analyse de l'enrichissement de l'ensemble de gènes (GSEA)27,28 pour comparer ces signatures génétiques avec la base de données publiée sur les perturbations du vieillissement contenant 34 profils d'expression d'ARNm de foie de souris et 15 profils d'expression d'ARNm de foie de rat. Les signatures génétiques régulées à la hausse et à la baisse de la transcription ressemblaient étroitement aux profils publiés de vieillissement du foie de rongeur (Fig. 2g, h), indiquant que les programmes de régulation des promoteurs au cours du vieillissement sont conservés dans les études de transcriptomique. En résumé, la synthèse d'ARN naissant environ 1,5 fois plus faible dans le vieux foie n'est pas due à une activité de promoteur réduite ou à une transition RNAPII vers l'allongement.

a, b, Abondance moyenne totale de RNAPII et RNAPII ser5p ChIP – seq autour de TSS (région TSS ± ​​750 pb) de tous les gènes dans les foies adultes (bleu) et vieux (rouge). La ligne grise représente le contrôle d'ADN d'entrée ChIP–seq. c, diagramme de dispersion XY du rapport de déplacement RNAPII de tous les gènes exprimés du foie adulte (axe x) et vieux (axe y) dans les données RNAPII ChIP-seq totales. Chaque point représente un gène. Chaque gène est la moyenne de n = 3 souris par groupe. d, e, diagramme de dispersion XY représentant la synthèse d'ARN naissante du premier kb d'introns du TSS (d) ou du TSS à 1 kb en aval (e) de tous les gènes dans les foies adultes (axe y) et vieux (axe x). Chaque point représente un gène dans lequel le signal représente la moyenne de n = 3 souris. f, carte thermique à trois compartiments des changements de pli log2 (ancien / adulte) de l'ARN naissant (à gauche) et du RNAPII total (à droite) sur les corps de gènes de gènes de clusters régulés à la hausse et à la baisse par le promoteur. Chaque ligne représente un gène. g, h, diagramme à barres montrant le chevauchement entre tous les ensembles de données de vieillissement GSEA de souris (g) ou de rat (h) et les clusters régulés à la hausse et à la baisse de la transcription. La signification et le FDR pour chaque chevauchement ont été calculés par le test exact de Fisher et la correction des tests multiples par la méthode Benjamini-Hochberg. FDR < 0,05 défini comme significatif.

Données source

Une inspection minutieuse de la carte thermique à trois compartiments a révélé un schéma cohérent de déclin progressif de la transcription naissante dans les bacs sur les corps de gènes dans les gènes régulés positivement par la transcription, tandis que les niveaux de RNAPII affichaient la tendance opposée (Fig. 2f). Pour évaluer la généralité de ce phénomène, nous avons étendu la carte thermique à trois cases à tous les gènes exprimés triés en fonction du degré de déclin transcriptionnel. Fait intéressant, presque tous les gènes ont connu une diminution progressive de la transcription dans le foie vieillissant et une augmentation concomitante de l'occupation de RNAPII dans l'ensemble des corps de gènes, révélant cela comme un phénomène à l'échelle du génome (Fig. 3a). Les gènes régulés à la hausse par le promoteur dans le vieillissement ont également présenté ce déclin de la transcription indépendamment de la régulation du promoteur (Fig. 2f et Extended Data Fig. 3b, c). Pour mieux quantifier l'ARN naissant et l'allongement du comportement RNAPII, tous les gènes exprimés ont été divisés en 20 bacs de TSS à TTS. Pour exclure le mappage des lectures sur le TSS et le TTS, nous n'avons analysé que les bacs 2 à 19, qui représentent l'allongement. Comme prévu, nous avons observé un déclin progressif général indépendant de l'âge de l'ARN naissant dans tous les corps de gènes exprimés (Fig. 3b), en raison de la nature directionnelle de la transcription et du séquençage des molécules d'ARN naissantes complètes (en croissance) et pas seulement de l'empreinte RNAPII. Alors que la transcription dans la première kilobase des corps de gènes est similaire (Fig. 2d, e), le déclin sur l'ensemble des gènes était significativement plus fort dans le vieux foie (Fig. 3b). Nous avons appelé cette baisse excessive de la transcription liée à l'âge «perte progressive de la transcription productive» (GLPT). En revanche, les niveaux de RNAPII total et ser2p ont progressivement augmenté dans les corps géniques au cours du vieillissement (Fig. 3c, d), ce qui est cohérent avec la Fig. 1. La perte de transcription pendant l'allongement fournit une explication de la réduction de la transcription, qui, paradoxalement, concorde avec l'augmentation des niveaux de RNAPII allongé.

a, carte thermique à trois compartiments des changements de pli log2 (ancien / adulte) de l'ARN naissant et de la puce-seq du RNAPII total sur les corps de gènes, triés par niveau de déclin transcriptionnel sur tous les gènes exprimés. b – d, densités de séquençage relatives de la phase d'élongation de la transcription entre TSS et TTS. b, Séquençage de l'ARN naissant dans le foie adulte (bleu) et âgé (rouge). c, RNAPII ChIP-seq total dans le foie adulte (bleu) et âgé (rouge). d, RNAPII-ser2p ChIP–seq dans le foie adulte (bleu) et âgé (rouge). Tous les gènes exprimés ; n = 3 souris par groupe. Valeurs P: test t bilatéral non apparié avec 32 df Les données sont présentées sous la forme de la moyenne ± sem e, f, pourcentage de changement de densité de lecture de séquençage dans la phase d'allongement de la transcription dans le vieillissement entre TSS et TTS des catégories de gènes en fonction de la longueur du gène génomique: EU-seq (e) et total RNAPII ChIP-seq (f). g, le séquençage en pourcentage lit le changement de densité (vieux/adulte) dans EU-seq comme on le voit sur la figure 2e, dans laquelle l'axe des x est la longueur moyenne des gènes de chaque catégorie. h, Nuage de points illustrant toutes les longueurs de gènes exprimées> 20 kb (axe x) et pourcentage de variation entre les personnes âgées et les adultes dans les densités EU-seq du TSS à 20 kb en aval (axe y) (n = 3 308). i, Pourcentage bloqué RNAPII dans les corps de gènes. Les couleurs indiquent les classes de longueur de gène comme sur la figure 2e. Les données sont la moyenne ± écart type (10–22 kb : n = 662 ; 22–30 kb : n = 644 ; 30–50 kb : n = 788 ; 50–70 kb : n = 587 ; 70–110 kb : n = 643 ; et >110 kb : n = 646).

Données source

Auparavant, nous avons signalé la perte préférentielle de l'expression de l'ARNm des gènes longs dans le foie des rongeurs âgés et l'hippocampe humain29, également notée plus tard dans les photorécepteurs de la mouche des fruits30 et le vieillissement cérébral31,32. Par conséquent, nous avons testé si la longueur du gène est impliquée dans GLPT. Nous avons d'abord sélectionné les gènes de la figure 3b avec le plus grand déclin transcriptionnel lié à l'âge. Ces gènes GLPThigh (n = 914) étaient en effet en moyenne significativement plus longs que tous les gènes exprimés ou les gènes régulés à la hausse ou à la baisse de la transcription (Extended Data Fig. 3d). Ensuite, nous avons regroupé tous les gènes exprimés en six classes de longueur de gène, chacune contenant un nombre similaire de gènes, et déterminé le pourcentage de changement d'ARN naissant et de RNAPII dans le corps du gène au cours du vieillissement. Cette analyse a révélé des tendances opposées claires dépendant de la longueur du gène: transcription en baisse et occupation croissante de RNAPII (Fig. 3e, f). Fait intéressant, lorsque nous avons tracé la longueur moyenne des gènes de chaque classe de gènes par rapport au pourcentage de diminution de la transcription sur les corps de gènes, toutes les classes ont présenté une régression transcriptionnelle linéaire similaire (Fig. 3g), avec une perte moyenne d'environ 0, 35% par kilobase dans le vieux foie. À titre de confirmation, le déclin de la transcription dans les 20 premiers kb du TSS était similaire pour toutes les longueurs de gène (Fig. 3h). Étant donné que les gènes> 70 kb représentaient déjà environ 60% du pool d'ARN naissant dépendant de RNAPII (données étendues Fig. 3e), les gènes longs ont contribué de manière disproportionnée à la réduction des niveaux d'ARN naissant. La diminution de la synthèse d'ARN de novo et l'abondance accrue de RNAPII dans les corps de gènes entraînent des temps de séjour plus longs et une production transcriptionnelle plus faible de RNAPII. En quantifiant la discordance entre les niveaux d'ARN naissants et l'occupation totale de RNAPII (données étendues Fig. 3f), nous avons estimé un RNAPII non productif global d'environ 40% dans les corps de gènes du foie de 2 ans d'une manière dépendante de la longueur des gènes (Fig. 3i), ce qui implique qu'ils sont bloqués. En supposant que les hépatocytes de souris ont un nombre similaire de molécules RNAPII par cellule que les fibroblastes humains en culture33, nous pensons que l'hépatocyte moyen de souris âgé de 2 ans contient à tout moment > 18 000 complexes RNAPII bloqués pendant l'élongation (Extended Data Fig. 3g). En résumé, le vieillissement du foie est caractérisé par une perte d'allongement de la transcription dépendant de la longueur du gène et à l'échelle du génome et une augmentation du blocage de RNAPII.

Par la suite, nous avons évalué si divers paramètres potentiels étaient corrélés avec le degré de GLPT pour identifier un mécanisme expliquant le décrochage RNAPII. Nous n'avons pas trouvé de différences significatives entre les gènes GLPThigh et les autres catégories de gènes (transcriptionnellement régulés à la hausse et à la baisse; reste) dans la teneur en nucléotides dans les corps de gènes, le taux d'erreur de transcription, l'épissage alternatif, l'accessibilité de la chromatine, les modifications des histones associées à l'euchromatine ou aux schémas de méthylation de l'ADN, ce qui indiquerait que les changements épigénétiques sont responsables (Extended Data Figs. 4–6). Ces facteurs ne sont pas corrélés avec le degré de GLPT lié à l'âge, qui est attendu lorsqu'un tel facteur est causalement impliqué, et n'expliquent donc pas le déclin transcriptionnel observé.

Compte tenu du blocage de la transcription dépendant de la longueur des gènes, une explication plausible est l'accumulation de dommages à l'ADN bloquant la transcription car les gènes longs ont une probabilité plus élevée d'acquérir des lésions stochastiques26,29. Par conséquent, nous avons surveillé la synthèse d'ARN de novo dans le foie de souris Xpg-/-, qui présentent de nombreuses caractéristiques d'un vieillissement prématuré généralisé et d'une durée de vie de 20 semaines en raison de défauts dans les voies de réparation de l'ADN TCR et de la réparation globale par excision des nucléotides du génome par laquelle ils sont incapables d'éliminer les lésions qui bloquent la transcription34. La coloration EU et EU-seq à l'âge de 7 et 14 semaines (Fig. 4a – c) ont révélé un déclin pannucléaire progressif, dépendant de l'âge, de la transcription. EU-seq dans le vieillissement prématuré de la réparation par excision des nucléotides du génome global et des souris Ercc1Δ / - défectueuses en TCR qui présentent une pathologie de vieillissement du foie plus sévère en raison d'un défaut supplémentaire dans la réparation des liaisons croisées entre brins35,36, présentaient déjà une perte de transcription élevée à 4 et encore plus à 10 semaines (Fig. 4d), montrant que l'étendue du déclin transcriptionnel, le déficit de réparation de l'ADN et la gravité de la pathologie hépatique sont corrélés.

a, ARN naissant marqué par l'UE (vert) dans les noyaux hépatiques de souris Xpg-/- âgées de 7 et 14 semaines par rapport à des souris WT âgées de 7 semaines. b, quantification du graphique en boîte et en moustaches de la Fig. 4a. Les lignes médianes montrent les médianes, les limites de la boîte marquent l'IQR et les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. Valeurs P : Xpg−/− de 7 semaines versus WT P = 2,4688 × 10−285 ; Xpg−/− de 14 semaines versus WT P = 0 ; test t bilatéral non apparié, 3 souris par groupe ; noyaux comptés n = 916, 864 et 738 pour WT, Xpg−/− âgés de 7 et 14 semaines. c, d, pourcentage de changements de densité de lecture EU-seq entre TSS et TTS chez les souris Xpg-/- (c) et Ercc1Δ/- (d) par rapport au vieillissement du foie WT (104 semaines, ligne noire). e, Pourcentage de déclin de la production d'ARN naissant dans les MDF quiescents Xpg-/-, Ercc1Δ/- et WT après 1, 2 et 4 semaines de culture dans des conditions hypoxiques (3 %) et normoxiques (20 %). Les données sont les valeurs moyennes ± sd P (test t non apparié bilatéral) sont : semaine 2 : Ercc1Δ/− versus WT : P = 0,002353336 ; semaine 4, Xpg−/− versus WT : P = 6,13324 × 10−9 ; Ercc1Δ/− versus WT : P = 1,21727 × 10−9. Nombre de noyaux : 3% O2, semaine 1 : 14 Xpg-/- et 14 WT ; 17 Ercc1Δ/- et 14 WT ; semaine 2 : 15 Xpg−/− et 16 WT ; 17 Ercc1Δ/- et 13 WT ; semaine 4 : 29 Xpg−/− et 27 WT ; 34 Ercc1Δ/- et 28 WT. f, diagramme en boîte et en moustaches d'ARN naissant marqué par l'UE fluorescent dans des MDF Ercc1Δ/− 24 h après l'irradiation UVC. Les lignes médianes montrent les médianes, les limites de la boîte marquent l'IQR et les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. Valeurs P (test t bilatéral non apparié) : 2 J m−2 contre 0 J m−2 = 5,66445 × 10−8 ; 4 J m−2 contre 0 J m−2 = 2,92531 × 10−28 ; 6 J m−2 contre 0 J m−2 = 5,59594 × 10−52. Noyaux comptés : 0 J m−2, n = 146 ; 2 J m-2, n = 118 ; 4 J m-2, n = 132 ; 0 J m-2, n = 137. g, Pourcentage de densités de lecture EU-seq de gènes> 110 kb du TSS à 10 kb en amont dans Ercc1Δ / - MDF 24 h après irradiation UVC par rapport aux cellules non irradiées. Ligne noire : classe de gènes > 110 kb à partir de données sur le vieillissement normal du foie. h, Le biais (fraction) du séquençage lit la cartographie du brin codant pendant le vieillissement WT à partir des données totales RNAPII et RNAPII-ser2p ChIP – seq sur tous les gènes (n = 3 809), courts (10–22 kb, n = 512) et gènes les plus longs (> 110 kb, n = 779). P < 0,0001, test t bilatéral non apparié par rapport aux gènes d'une longueur de gène de 1 à 10 kb, 3 souris par groupe. Les données sont la moyenne ± sem i, le biais (fraction) des lectures de séquençage cartographiant le brin codant pendant le vieillissement WT à partir des données totales RNAPII et RNAPII-ser2p ChIP-seq via le corps du gène (3 bacs) dans tous les gènes et les gènes les plus longs (> 110 kb, n = 779). Les données sont la moyenne ± sem j, Séquençage des profils de densité de lecture du gène Ghr à partir de EU-seq, RNAPII total (toutes les lectures agrégées) et RNAPII total divisé en codage et brin modèle dans le foie adulte WT (bleu) et âgé (rouge). k, ATM phosphorylé (rouge) et γH2A.X (vert) dans le foie de souris adultes et âgées. À droite, les intensités de fluorescence sont représentées sous forme de tracés en boîte et moustaches. Les lignes médianes montrent les médianes, les limites de la boîte marquent l'IQR et les moustaches indiquent les valeurs minimales et maximales. P = 7,19752 × 10−27 (test t bilatéral non apparié). Noyaux comptés : adulte n = 313 ; ancien n = 315 ; n = 3 souris par groupe. Barre d'échelle, 50 μm.

Données source

Pour examiner plus en détail les dommages endogènes spontanés à l'ADN en tant qu'instigateurs du déclin de la transcription, nous avons cultivé des fibroblastes dermiques de souris au repos (MDF) de souris Xpg-/-, Ercc1Δ/- et WT pendant 1, 2 et 4 semaines pour permettre aux dommages endogènes à l'ADN de s'accumuler. La quiescence évite la dilution des lésions, qui se produit lorsque les cellules prolifèrent. Fait intéressant, les MDF Xpg-/- et Ercc1Δ/- ont démontré un déclin dépendant du temps de la synthèse d'ARN naissante cultivée à 20% d'oxygène (Fig. 4e). Les MDF cultivés à 3% d'oxygène n'ont pas montré de transcription significativement réduite, suggérant des dommages oxydatifs à l'ADN comme cause de perte de transcription. Ensuite, nous avons évalué le niveau de dommages à l'ADN induisant le même degré de déclin transcriptionnel que celui observé dans le foie âgé. Les MDF Ercc1Δ/− quiescents ont été exposés à des doses croissantes de lumière ultraviolette C (UVC), ce qui induit des quantités connues de lésions de l'ADN bloquant la transcription37. La coloration EU et EU-seq ont démontré un déclin transcriptionnel dose-dépendant, dans lequel 2 J m-2 UVC, ce qui correspond à environ 1, 6 lésions bloquant la transcription par 100 kb d'ADN37, ont induit des niveaux de transcription 24 h après l'exposition aux UV similaires aux foies de souris WT de 2 ans (Fig. 4f, g). Ces niveaux de dommages associés à une réduction de la transcription de 0,35 % par kilobase expliquent également pourquoi RNAPI, RNAPIII et RNAP mitochondrial (mtRNAP) ne présentent pas de déclin significatif car leurs espèces d'ARN cibles sont très petites.

Si une fraction significative de l'allongement de RNAPII dans le vieillissement est bloquée par des lésions endogènes bloquant la transcription, on s'attend à ce que lors de l'étape d'amplification d'ADN spécifique au brin dans le protocole de bibliothèque RNAPII ChIP-seq, la lésion dans le brin matrice qui bloque réellement le RNAPII altère également l'amplification de l'ADN de ce brin, contrairement au brin non endommagé (codant). Cela devrait conduire à un biais d'amplification du brin en faveur du brin codant qui peut être visualisé par ChIP-seq spécifique au brin, comme indiqué pour les lésions bloquant la transcription induites par les UV38. Tout d'abord, nous avons confirmé que les dommages à l'ADN induits par les UV entraînaient un biais de brin de codage dans notre protocole ChIP-seq, qui disparaissait après un temps de réparation (Extended Data Fig. 7a). Il est important de noter que dans les foies âgés, nous avons trouvé un biais de brin de codage dépendant de la longueur du gène lié à l'âge dans les ensembles de données total et RNAPII-ser2p ChIP – seq (Fig. 4h). Les régions avec un biais de brin de codage élevé avaient à la fois un statut de méthylation de l'ADN local ou une teneur en nucléotides inchangés (données étendues Fig. 7b – f), indiquant que des perturbations bloquant la polymérase sont présentes dans l'ADN isolé et purifié de foies âgés, les identifiant comme ADN endommagé. De plus, le biais du brin codant lié à l'âge a augmenté vers les extrémités des gènes, en particulier dans les gènes longs (Fig. 4i), en corrélation avec le blocage de RNAPII dans les corps de gènes (Fig. 3) et le TCR étant plus actif au début des gènes39. Un exemple est le gène du récepteur de l'hormone de croissance (Ghr), un gène de plus de 265 kb fréquemment régulé à la baisse dans les foies âgés dans de nombreuses études indépendantes40, chez les souris mutantes Xpg−/− et Ercc1Δ/−18,34 et dans les cultures cellulaires exposées à la lumière UV41. Ghr démontre un GLPT clair et une abondance accrue de RNAPII dans le corps du gène. Nous avons également remarqué un déplacement de 20 % des lectures vers le brin codant dans les foies âgés (Fig. 4j), indiquant que la régulation négative de Ghr est le résultat direct de lésions bloquant la transcription. Le blocage de RNAPII induit par des dommages à l'ADN provoque une phosphorylation non canonique de l'ATM au point de contrôle des dommages à l'ADN en l'absence de cassures d'ADN double brin, ce que nous avons également observé dans les foies âgés (Fig. 4k), démontrant ainsi un stress transcriptionnel fréquent dans le vieillissement. Étant donné que l'étendue du biais du brin codant correspond au niveau attendu lorsqu'il est extrapolé à partir de cellules traitées aux UV, nos données révèlent que les lésions endogènes bloquant la transcription provoquent un blocage de RNAPII d'une manière dépendante de la longueur du gène, que nous avons désignée stress transcriptionnel lié à l'âge.

Pour évaluer l'importance fonctionnelle du stress transcriptionnel, nous avons quantifié son effet au niveau le plus pertinent, l'ARNm mature. La perte de transcription à travers les corps de gènes a affecté à la fois les introns et les exons, comme en témoigne le gène Igf1 (Fig. 5a, b), un régulateur clé de la détection des nutriments impliqué dans la détermination de la santé et de la durée de vie43,44, dont l'expression diminue avec l'âge45,46. Comme prévu, RNAPII s'est accumulé sur le corps du gène Igf1 de 79 kb. Fait intéressant, le biais du brin codant n'était pas présent dans le premier tiers du corps du gène qui était également caractérisé par des niveaux d'ARN et de RNAPII naissants normaux ou même plus élevés, ce qui indique que le déclin de la transcription est corrélé au biais du brin codant. Ainsi, le stress transcriptionnel induit par les dommages à l'ADN et non le silence du promoteur est le moteur de la baisse de l'expression de l'IGF1 dans le foie âgé. Pour quantifier les conséquences du stress transcriptionnel sur les exons à l'échelle du génome, nous avons calculé la perte d'exon du premier au dernier dans l'ARN naissant, qui a été multipliée par environ 1,5 avec le vieillissement pour tous les gènes exprimés et dépendait de la longueur du gène (Fig. 5c). Cela était cohérent avec une production d'ARNm plus faible au cours du vieillissement (Fig. 5d), fournissant un mécanisme pour la diminution de la teneur en ARNm cellulaire précédemment observée au cours du vieillissement2,3. Cela implique une diminution de la production transcriptionnelle et un biais de l'expression des gènes vers les petits gènes au cours du vieillissement.

a, b, Profils de densité de séquençage de l'ensemble du gène Igf1 (mm10, chr10: 87 858 265–87 937 047), y compris le biais du brin codant RNAPII (a) et les exons uniquement (b) de l'EU-seq du foie de souris WT adulte (bleu) et âgé (rouge). Les exons 1a et 1b sont des sites de départ alternatifs. c, rapports de densité EU-seq entre le dernier et le premier exons pour tous les gènes exprimés (P = 5,06731 × 10−9), gènes courts (10–22 kb) et longs (> 110 kb, P = 0,000482946). Les données sont la moyenne ± les valeurs sem P proviennent d'un test t bilatéral non apparié (vieux contre adulte). d, Abondances de transcrits complets (par rapport à l'adulte) estimées par lectures couvrant 3′UTR à partir de EU-seq de tous les gènes exprimés (P = 0,048761825), gènes courts (10–22 kb) et longs (> 110 kb, P = 1,78654 × 10−6). Les données sont la moyenne ± sem, les valeurs P proviennent d'un test t bilatéral non apparié. e, Voies surreprésentées significatives dans les gènes TShigh par les marques IPA, KEGG, Reactome et GSEA classées par catégorie de processus principale (gras). Les valeurs P agrégées ont été obtenues à partir d'un test exact de Fisher. Voir le tableau supplémentaire 2 pour des informations détaillées sur la voie.

Données source

Étant donné que le stress transcriptionnel réduit et fausse la sortie transcriptionnelle, nous avons analysé quels processus et voies cellulaires étaient les plus sensibles. Nous avons sélectionné des gènes avec une perte transcriptionnelle du premier au dernier exon> 1, 5 fois supérieure au vieillissement (n = 830), représentant des gènes avec des niveaux de stress transcriptionnels élevés (TShigh), pour un examen fonctionnel. Notamment, nous avons trouvé un chevauchement très significatif avec les profils globaux de six études indépendantes représentant des ARNm régulés à la baisse après des dommages à l'ADN induits par les UVC (tableau supplémentaire 1), ce qui confirme davantage le lien entre les lésions de l'ADN bloquant la transcription et le stress transcriptionnel lié à l'âge. L'examen fonctionnel a identifié plusieurs voies cellulaires significativement surreprésentées précédemment classées comme caractéristiques du vieillissement1 (Fig. 5e et Tableau supplémentaire 2), telles que les voies de détection des nutriments IGF1, l'insuline, l'hormone de croissance et la signalisation mTOR, qui sont toutes connues pour influencer la durée de vie1,44. L'autophagie, la réponse protéique dépliée et la voie de stress du réticulum endoplasmique ont également été identifiées, liant le stress transcriptionnel à la perte de protéostase. De plus, nous avons trouvé des processus métaboliques énergétiques clés tels que la phosphorylation oxydative et le métabolisme du pyruvate, qui étaient fonctionnellement réduits par le stress transcriptionnel dans le foie des souris Ercc1Δ/−26. D'autres processus identifiés comprenaient des facteurs immunitaires, le métabolisme des acides gras et la voie antioxydante NRF2, qui sont tous impliqués de manière causale dans la durée de vie et/ou les maladies liées à l'âge47,48,49,50. En conclusion, le stress transcriptionnel semble être une cause essentielle de la dérégulation des voies et processus caractéristiques du vieillissement chez les souris vieillissantes WT.

Enfin, nous avons examiné si le stress transcriptionnel était confiné au foie ou s'il se produisait également dans d'autres organes et espèces. L'ensemble de gènes régulé positivement par le promoteur contenait une signature de cellules B, ce qui indique une infiltration de cellules B liée à l'âge qui présentait également un stress transcriptionnel (Fig. 2f). L'EU-seq de reins de souris âgés de 2 ans a également montré un GLPT similaire à celui du foie de souris âgé (Fig. 6a). Ensuite, nous avons recherché et réanalysé des ensembles de données publics sur le vieillissement du séquençage de l'ARN total qui contenaient suffisamment de lectures cartographiant les introns représentant l'ARN naissant. Dans deux ensembles de données appropriés et étendus, tendon humain âgé51 et Caenorhabditis elegans52, nous avons découvert un GLPT similaire à celui du foie de souris âgé WT (Fig. 6a). Étant donné que la plupart des ensembles de données publics sont dérivés du séquençage de l'ARNm, nous avons également utilisé notre ensemble de gènes TShigh pour faire correspondre tous les ensembles de gènes liés à l'âge sélectionnés (n = 198) dans la bibliothèque de perturbations du vieillissement à l'aide de l'outil Enrichr pour GSEA. À des fins de comparaison, des ensembles de gènes régulés à la hausse et à la baisse par la transcription ont également été inclus. Nous avons trouvé une présence significative de gènes TShigh dans 65 % de tous les ensembles de données sur le vieillissement (Fig. 6b). Les signatures transcriptionnellement régulées à la hausse ou à la baisse ont obtenu des scores beaucoup plus faibles (Fig. 6b), alors qu'aucun chevauchement n'a été trouvé avec six ensembles de gènes aléatoires de taille similaire, ce qui indique que le stress transcriptionnel est le principal moteur des changements transcriptionnels dans les organes vieillissants.

a, pourcentage de changements de densité de lecture EU-seq de l'allongement de la transcription entre TSS et TTS des gènes exprimés (distribution 5-bin) dans les données EU-seq du foie de souris âgé WT (noir, cette étude, n = 3 par groupe, n = 3 970 gènes), rein de souris âgé (n = 2 par groupe, n = 2 135 gènes, 7,5 semaines contre 104 semaines, bleu) et ARN-seq total du tendon humain (n = 4 par groupe, n = 773 gènes, 69,5 ± 7,3 ans versus 19 ± 5,8 ans ; marron) et C. elegans (n ​​= 3 par groupe, n = 2 872 gènes, jour 10 versus jour 1 après le stade jeune adulte ; vert). Les données sont la moyenne ± sem b, diagramme à barres du chevauchement entre les ensembles de données sur le vieillissement de la GSEA et les classes de gènes TShigh, régulés positivement et régulés négativement par le promoteur, identifiées dans notre étude. La signification et le FDR ont été calculés par le test exact de Fisher et la méthode de Benjamini-Hochberg. c, rapport d'enrichissement génétique (axe x) entre les groupes de gènes identifiés et les ensembles de données de vieillissement de la GSEA chez trois espèces : souris (en haut), rat (au milieu) et humain (en bas) ; TShigh (gauche), promoteur régulé à la baisse (milieu) et promoteur régulé à la hausse (droite). La taille des points représente le nombre d'ensembles de données de vieillissement GEO. Si> 1 ensemble de données d'un tissu était présent, la moyenne ± sd et la valeur P agrégée (test exact de Fisher) sont affichées.

Données source

Ensuite, nous avons visualisé quels organes et tissus étaient significativement enrichis. Pour les organes qui ont plusieurs entrées dans la base de données, nous avons calculé les valeurs P agrégées corrigées du chevauchement moyen et du taux de fausses découvertes (FDR). Comme prévu, les profils d'ARNm hépatiques liés à l'âge de la souris et du rat partageaient la plus grande similitude avec l'ensemble de gènes TShigh (Fig. 6c). En fait, le stress transcriptionnel était un mécanisme plus dominant façonnant le transcriptome du vieillissement du foie que la régulation de la transcription par l'activité du promoteur. En outre, de nombreux autres organes tels que les reins, le cœur, le tissu adipeux, la rétine, les muscles, les poumons, le néocortex et la moelle épinière sont également apparus significativement enrichis pour les gènes sujets au blocage de RNAPII, révélant que de nombreux organes présentent un stress transcriptionnel lié à l'âge, ce qui explique le chevauchement des modèles d'expression génique et a également un impact plus important sur l'expression génique que la régulation des promoteurs liée à l'âge. Tous les organes n'affichaient pas une signature de stress transcriptionnel d'ARNm. Cela pourrait être dû au fait que notre liste de gènes de requête de stress transcriptionnel est biaisée en faveur de gènes spécifiques au foie et/ou que certains organes sont moins sujets au blocage de la transcription ; ce dernier est en accord avec la nature segmentaire du phénotype de vieillissement prématuré dans les syndromes TCR et les souris mutantes correspondantes34,36. Les tissus prolifératifs, par exemple, les cellules souches hématopoïétiques, la peau et l'intestin semblaient moins vulnérables, ce qui peut s'expliquer par la capacité de la réplication de l'ADN à résoudre le RNAPII bloqué par les dommages à l'ADN, qui protège les lésions de la réparation par d'autres mécanismes20. De plus, la division cellulaire dilue les dommages à l'ADN et peut également permettre la réparation. Ainsi, nous avons identifié le stress transcriptionnel comme un facteur principal façonnant les transcriptomes liés à l'âge et comme phénotype général du vieillissement dans de nombreux tissus et espèces.

Cette étude fournit des preuves que les dommages à l'ADN bloquant la transcription au cours du vieillissement normal provoquent un blocage fréquent de RNAPII à l'échelle du génome, ce qui entraîne une réduction de la production transcriptionnelle dépendante de la longueur du gène, entraînant une dérégulation de nombreuses voies connues pour affecter le vieillissement (Fig. 7). Sur la base des similitudes de blocage de la transcription dans les cellules traitées aux UV, nous estimons qu'un RNAPII initial bloqué sur une lésion bloquera environ trois complexes RNAPII ultérieurs provoquant une file d'attente. Les mécanismes sous-jacents responsables des changements d'expression génique liés à l'âge ont été largement insaisissables et on pense souvent qu'ils résultent de mécanismes de régulation actifs tels que la régulation du promoteur8, également dans les modèles de souris vieillissantes prématurées mutantes de réparation de l'ADN17. Cependant, nous suggérons que le stress transcriptionnel passif par des dommages à l'ADN en combinaison avec l'architecture des gènes, c'est-à-dire la longueur des gènes, représente une fraction substantielle de ces changements.

Modèle décrivant le blocage de RNAPII par des dommages à l'ADN et ses conséquences sur le vieillissement.

Chaque cellule peut subir jusqu'à 100 000 lésions de l'ADN par jour53, dont la plupart sont rapidement réparées par des processus de réparation dédiés. Les dommages à l'ADN en tant que cause du vieillissement sont dans une large mesure basés sur des syndromes de vieillissement prématuré avec une instabilité génomique sous-jacente, tels que le syndrome de Cockayne déficient en TCR et la trichothiodystrophie, qui présentent une courte durée de vie et de nombreuses caractéristiques de vieillissement prématuré principalement dans les tissus postmitotiques. Les modèles de souris correspondants34,35,54 affichent des transcriptomes d'ARNm qui se chevauchent de manière significative avec les souris WT âgées18,19. Nous montrons maintenant que le stress transcriptionnel passif, au lieu de la régulation active des gènes, est responsable de la formation du transcriptome vieillissant. Bien que nous n'ayons pas exclu toutes les raisons putatives expliquant le phénotype de stress transcriptionnel observé, nous avons identifié un biais vers le brin non transcrit dans les données RNAPII ChIP-seq provenant de foies âgés de WT, indiquant que les dommages à l'ADN bloquant la transcription dans les brins de matrice sont la cause la plus probable du blocage de RNAPII. Bien que les dommages à l'ADN s'accumulent au cours du vieillissement, il n'était pas clair jusqu'à présent si ces niveaux sont suffisants pour déclencher des réponses de vieillissement chez les organismes WT. Les lésions endogènes candidates bloquant la transcription, les aldéhydes21, les produits finaux de glycation avancée22 et les cyclopurines23,24,25, peuvent s'accumuler dans les organes âgés à des niveaux suffisants pour expliquer le stress transcriptionnel observé. Ainsi, l'accumulation spontanée et endogène de dommages à l'ADN, similaire au syndrome progéroïde de Cockayne et à la trichothiodystrophie, provoque un stress transcriptionnel dans le vieillissement normal.

Nos données indiquent comment les dommages à l'ADN provoquent le vieillissement via le stress transcriptionnel. Le stress transcriptionnel détermine en grande partie les profils d'expression du vieillissement dans de multiples organes ayant un impact sur la fonction des organes et provoque en particulier le dysfonctionnement de nombreuses voies caractéristiques du vieillissement. De plus, la nature stochastique des lésions de l'ADN peut expliquer le bruit transcriptionnel, qui augmente avec le vieillissement4,5,6. Le stress transcriptionnel pourrait avoir un impact supplémentaire sur le fonctionnement cellulaire en favorisant la perte de stoechiométrie du complexe protéique, un phénotype observé chez les killifish55 et C. elegans56 âgés. De plus, l'expression déséquilibrée de grands et petits gènes due à des lésions bloquant la transcription dans les cultures cellulaires peut induire la mort cellulaire et a été proposée comme un signal de vieillissement prématuré dans le syndrome de Cockayne57. Enfin, le blocage de RNAPII lui-même est également un signal direct du vieillissement. La dissection génétique du TCR et des syndromes héréditaires correspondants indique que les conséquences moléculaires des mutations du TCR sont en corrélation avec la sévérité du vieillissement prématuré20. Les défauts du TCR qui bloquent définitivement RNAPII sur les lésions de l'ADN conduisent à des formes plus sévères de vieillissement accéléré que les défauts de réparation qui permettent encore l'accessibilité de la lésion pour d'autres voies de réparation20. Cela a été prouvé chez des souris mutantes avec une mutation ponctuelle dans RNAPII qui abolit l'ubiquitination induite par les dommages à l'ADN nécessaire pour éliminer RNAPII bloqué d'une lésion à l'ADN, qui présentait une durée de vie réduite et un vieillissement prématuré38. RNAPII bloqué sur une lésion de l'ADN conduit à la formation d'une boucle R et à l'activation du point de contrôle des dommages à l'ADN ATM42, qui peut induire la mort cellulaire ou la sénescence58, fournissant ainsi un mécanisme expliquant comment le blocage de RNAPII conduit au vieillissement. Les boucles R augmentent dans les yeux des mouches des fruits âgées, principalement dans les gènes longs59, fournissant une preuve supplémentaire de ce scénario. Nous montrons qu'environ 40 % de tous les complexes RNAPII allongés sont bloqués par des dommages à l'ADN dans les foies âgés de WT ; ainsi, le signal de vieillissement identique qui provoque les syndromes progéroïdes se produit également dans le vieillissement normal. Fait intéressant, les cerveaux de patients atteints de la maladie d'Alzheimer présentaient également une expression réduite des gènes longs par rapport aux témoins appariés selon l'âge60, ce qui suggère que l'ampleur du stress transcriptionnel est impliquée dans l'étiologie de la maladie liée à l'âge. À l'inverse, la restriction alimentaire d'intervention favorisant la longévité restaure la perte d'expression des gènes longs29, indiquant que les interventions de longévité peuvent atténuer le stress transcriptionnel. En conclusion, nous proposons que l'accumulation de lésions endogènes de l'ADN avec l'âge déclenche un stress transcriptionnel qui façonne les profils d'expression génique liés à l'âge dans de nombreux organes et tissus, est présent sur de grandes distances évolutives et peut expliquer comment l'accumulation de dommages à l'ADN provoque un déclin fonctionnel, renforçant ainsi le rôle principal des dommages à l'ADN dans le processus de vieillissement16,17.

Le logement et les expériences de souris ont été réalisés conformément à la loi sur la protection des animaux du gouvernement néerlandais, en suivant le Guide pour le soin et l'utilisation des animaux de laboratoire et avec les directives approuvées par le Comité d'éthique néerlandais en pleine conformité avec la législation européenne. Le comité d'éthique institutionnel pour les soins et l'utilisation des animaux a approuvé tous les protocoles d'animaux. Des souris mâles WT (Mus musculus) dans un fond hybride F1 C57BL6J / FVB (1: 1) ont été euthanasiées à 15 semaines et 104 semaines d'âge. Les souches WT C57BL6J et FVB sont fréquemment obtenues auprès des Jackson Laboratories pour maintenir un fond génétique standard. Des modèles de souris vieillissant prématurément et déficients en réparation d'ADN qui ont été générés dans la maison et des compagnons de litière WT dans un fond hybride F1 C57BL6J / FVB (1: 1) ont été euthanasiés à 4 et 10 semaines pour les mutants Ercc1Δ / -35; et 7 et 14 semaines pour les mutants Xpg−/−34. Tous les animaux ont été élevés et maintenus sur des granulés synthétiques AIN93G (Research Diet Services ; teneur énergétique brute 4,9 kcal g−1 masse sèche, énergie digestible 3,97 kcal g−1). Les animaux ont été maintenus dans un environnement contrôlé (20 à 22 °C, cycle de lumière de 12 h : 12 h d'obscurité) et ont été logés individuellement dans des cages ventilées individuelles dans des conditions spécifiques exemptes d'agents pathogènes au Centre de ressources animales (Erasmus University Medical Center). Aucune méthode statistique n'a été utilisée pour prédéterminer la taille des échantillons, mais nos tailles d'échantillon sont similaires à celles rapportées dans les publications précédentes8,18,26,29,38,41. La collecte et l'analyse des données n'ont pas été effectuées à l'aveugle des conditions des expériences et la randomisation des animaux dans les groupes expérimentaux n'était pas applicable. Aucun animal n'a été exclu des groupes expérimentaux dans aucune analyse.

Pour évaluer la synthèse d'ARN de novo induite par les dommages à l'ADN endogène, les MDF Ercc1∆/-, Xpg-/- et WT (tous dans le fond génétique hybride C57BL6J/FVB F1) ont été isolés des queues des modèles de souris correspondants et cultivés dans du DMEM additionné de 10 % de FCS et de 1 % de PS à 5 % de CO2 et 3 % d'O2.

Les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de 5-EU (AXXORA) 0,088 mg par gramme de poids corporel. Cinq heures après l'injection intrapéritonéale, les souris ont été euthanasiées. Les échantillons de tissus ont été fixés au formol pour la coloration par fluorescence ou congelés pour l'isolement de l'ARN et les expériences ChIP.

Des tranches mesurant 3 à 5 µm ont été coupées à partir de morceaux de foie enrobés de paraffine et fixés au formol. Les tranches ont été montées sur des lames de microscope (Superfrost Ultra Plus Adhesion Slides, Thermo Fisher Scientific). Pour la coloration RNAPII, les échantillons ont été déparaffinés avec du xylène, réhydratés avec un gradient d'alcool et lavés avec de l'eau Milli-Q avant la récupération de l'antigène (30 min dans un tampon citrate, pH 6). Les anticorps utilisés étaient : l'anticorps Alexa Fluor 594-RPB1 (en dilution 1:250), reconnaissant toutes les formes de RNAPII indépendamment du statut de phosphorylation de leur CTD (cat. n° 664908, BioLegend) ; RNAPII-ser2p (n° de catalogue ab5095, Abcam); RNAPII-ser5p (n° de catalogue ab5131, Abcam); phospho-ATM (Ser1981, n° de catalogue 4526, Cell Signaling Technology); et phospho-histone H2A.X (Ser139, cat. n° 9718 ; Cell Signaling Technology) le tout en dilution 1:500. Pour réduire le niveau de fluorescence de fond, un kit de détection souris sur souris a été utilisé (cat. n° BMK-2202, Vector Laboratories). Les sections ont été contre-colorées à l'aide de DAPI ou de Hoechst 33342.

Après les étapes d'élimination et de réhydratation de la paraffine à base de xylène (l'étape de récupération de l'antigène a été omise pour la coloration de l'UE), nous avons utilisé le kit d'imagerie Click-iT RNA Alexa Fluor 488 (réf. c10329 ; Thermo Fisher Scientific) selon le protocole standard d'immunofluorescence. Les images ont été prises par un système ZEISS LSM 700. L'intensité de la coloration de l'ARN naissant a été quantifiée en calculant les valeurs de densité intégrées pour chaque coloration nucléaire à l'aide du logiciel Fiji61. La signification statistique a été calculée à partir des valeurs d'intensité de fluorescence normalisées à l'aide d'un test t de Student non apparié dans Prism version 7.04 (logiciel GraphPad). Pour la coloration in vitro de l'ARN naissant marqué par l'UE, les cellules ont été cultivées sur des lamelles. Dans les boîtes de croissance confluentes, le milieu a été remplacé par du milieu frais additionné de 1 % de FCS et (lorsque cela est indiqué) déplacé à 20 % d'O2 pendant le temps indiqué. Le milieu a été renouvelé deux fois par semaine. Pour mesurer la synthèse d'ARN de novo après le traitement UVC, les MDF Ercc1∆/− et WT (fond hybride C57BL6J/FVB F1) ont été cultivés jusqu'à confluence et maintenus comme décrit ci-dessus, suivis d'une irradiation UVC (0, 2, 4 et 6 J m−2 UVC) à l'aide d'une lampe germicide à 254 nm (Philips). Les tests ont été effectués 24 h plus tard pour permettre aux MDF de récupérer des effets transcriptionnels immédiats en trans. Pour évaluer leur niveau transcriptionnel, 1 mM EU a été ajouté au milieu pendant 1 h avant la collecte de cellules pour l'extraction de l'ARN total ou fixé pour la coloration par fluorescence. Les cellules ont été lavées avec une solution saline tamponnée au tris (TBS) glacée et fixées pendant 20 minutes sur de la glace dans du formol à 4 %. Ensuite, les cellules ont été lavées dans de l'albumine de sérum bovin (BSA) à 3 % dans du TBS et perméabilisées à l'aide de Triton X-100 à 0,5 % dans du TBS pendant 20 min à température ambiante. Les lamelles ont ensuite été lavées deux fois avec 3% de BSA dans du TBS et incubées avec le mélange réactionnel Click-iT (Invitrogen) pendant 30 min. Après la réaction Click-iT, les cellules ont été lavées une fois avec 3% de BSA dans du TBS et une fois avec du TBS avant d'être incubées dans du TBS contenant 1:1 000 Hoechst 33342 pendant 30 min. Les échantillons ont été montés à l'aide de Prolong Diamond (Invitrogen). Les images ont été obtenues avec un microscope ZEISS LSM700 et l'intensité de coloration de l'UE dans les noyaux a été quantifiée avec Fidji (image J 1.53q).

L'ARN total a été isolé à partir de tranches de foie et de rein congelées ou de cellules grattées à l'aide du kit miRNeasy (QIAGEN), y compris l'étape de DNase sur colonne (RNase-Free DNase Set, QIAGEN). La qualité et la quantité d'ARN ont été estimées avec le bioanalyseur (Agilent Technologies) et seul l'ARN de haute qualité (indice d'intégrité de l'ARN> 8) a été utilisé pour des analyses ultérieures. Le séquençage de l'ARN total a été effectué comme décrit ailleurs62. Pour isoler sélectivement l'ARN naissant marqué par l'UE, nous avons utilisé le kit de capture d'ARN naissant Click-iT (n° de catalogue c10365, Thermo Fisher Scientific) : de l'azide de biotine a été attaché aux groupes éthylène de l'ARN marqué par l'UE à l'aide de la chimie Click-iT. L'ARN naissant marqué par l'UE a été purifié à l'aide de billes magnétiques MyOne Streptavidin T1. L'EU-ARN capturé fixé sur des billes de streptavidine a été immédiatement soumis à la génération d'une bibliothèque de séquençage sur billes à l'aide du kit de préparation d'échantillons d'ARNm TruSeq v2 (Illumina) conformément aux protocoles du fabricant avec des modifications. Les premières étapes du protocole ont été sautées ; L'ADN complémentaire (ADNc) directement sur la perle a été synthétisé par transcriptase inverse (Super-Script II) en utilisant des amorces hexamères aléatoires. Les fragments d'ADNc ont ensuite été munis d'extrémités franches par une réaction de réparation d'extrémité, suivie d'une queue dA. Par la suite, des adaptateurs à code-barres double brin spécifiques ont été ligaturés et une amplification de la bibliothèque pendant 15 cycles a été réalisée. Les bibliothèques de PCR ont été nettoyées, mesurées sur un bioanalyseur Agilent à l'aide du test DNA1000, regroupées à des concentrations égales et séquencées par trois dans une voie sur un HiSeq 2500.

Le foie surgelé a été haché dans du PBS glacé, homogénéisé dans un homogénéisateur Dounce et filtré à travers un tamis cellulaire (Falcon). Après avoir ajouté du formaldéhyde (total 1 %), l'homogénat a été secoué sur de la glace pendant 10 min et trempé avec de la glycine. L'homogénat culotté a été lavé avec du PBS glacé, remis en suspension dans un tampon de lyse cellulaire (0,25% Triton X-100, EDTA 10 mM, EGTA 0,5 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0, sans EDTA complet et PhosSTOP, Sigma-Aldrich) et incubé pendant 10 min sur de la glace. Les échantillons ont été centrifugés et remis en suspension dans un tampon de lyse des noyaux (NaCl 0,15 M, EDTA 1 mM, HEPES 20 mM, pH 8,0, sans EDTA complet et PhosSTOP). Les échantillons ont ensuite été homogénéisés par un homogénéisateur Dounce et incubés sur de la glace pendant 10 min. La fraction nucléaire a été remise en suspension dans un tampon de sonication (50 mM HEPES, pH 7,8, 140 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % désoxycholate de sodium, 1 % dodécylsulfate de sodium, cOmplete EDTA-free et PhosSTOP). La chromatine a été soniquée avec un sonicateur Bioruptor (Diagenode) en fragments de 100 à 500 pb et centrifugée pour éliminer tous les débris cellulaires restants. Du surnageant, 15 µg de chromatine ont été utilisés pour un cycle d'immunoprécipitation. Pour ChIP-seq, cinq échantillons ont été regroupés. Des billes Dynabeads M-280 Sheep Anti-Lapin IgG ont été utilisées pour l'étape d'immunoprécipitation. Les échantillons de chromatine ont été préclarifiés avec des billes à 4 ° C, pendant 2 h. Les échantillons de chromatine pré-clarifiés ont été mis en rotation pendant une nuit à 4 ° C avec les anticorps RNAPII: RNAPII-ser2p, RNAPII-ser5p ou anticorps spécifique RNAPII RPB1-NTD (clone D8L4Y, Cell Signaling Technology). Des Dynabeads ont été ajoutées pendant 2 h aux échantillons pour éliminer les complexes protéine-ADN. Après immunoprécipitation, les échantillons ont été lavés deux fois avec les tampons suivants : tampon de sonication, deux fois avec le tampon A (50 mM HEPES, pH 7,8, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1 % Triton X-100, 0,1 % désoxycholate de sodium, 0,1 % SDS, cOmplete EDTA-free et PhosSTOP), deux fois avec le tampon B (20 mM Tris, pH 8, 1 mM ED TA, 250 mM LiCl, 0,5 % NP-40, 0,5 % désoxycholate de sodium, cOmplete EDTA free et PhosSTOP) et enfin deux fois avec du tampon Tris-EDTA (10 mM Tris, pH 8, 1 mM EDTA). La fraction liée de la chromatine a été isolée à l'aide du kit de récupération d'ADN IPURE pour ChIP (Diagenode). Les bibliothèques de séquençage ont été générées à l'aide du kit de préparation de bibliothèque de puces Illumina TruSeq. Les échantillons ont été séquencés sur la plateforme HiSeq 4000.

Les lectures EU-seq ont été prétraitées avec le logiciel de contrôle qualité FastQC v.0.11.9, FastQScreen v.0.14.0 et Trimmomatic v.0.35 (réf. 63) en utilisant les paramètres : SLIDINGWINDOW:4:15 LEADING:3 TRAILING:3 ILLUMINACLIP:adapter.fa:2:30:10 LEADING:3 TRAILING:3 MINLEN:36. Les lectures restantes ont été successivement alignées sur l'ADN ribosomique de la souris (BK000964.3), les séquences mitochondriales (UCSC, mm10) et le génome de référence de la souris (GRCm38/mm10) à l'aide de Tophat2 v.2.0.9 (réf. 64) avec les paramètres par défaut à l'exception de l'option -g 1. Les lectures ChIP-seq ont été alignées sur le génome de référence de la souris mm10 à l'aide de Bowtie65 v.2.1.0. L'ensemble de données public total RNA-seq a appliqué le même algorithme de cartographie avec EU-seq en utilisant le génome de référence correspondant (hg19 et ce10) pour étudier la dynamique de l'ARN naissant dans le vieillissement des espèces. Le même algorithme de mappage que celui utilisé avec ChIP-seq a été appliqué aux autres données publiques.

Tous les gènes, exons et introns RefSeq (version : 95) ont été extraits du navigateur de génomes de l'UCSC66 et les listes de gènes ont été réduites au transcrit le plus long pour chaque gène. Les gènes avec des régions chevauchant un autre gène codant ou non codant ont été supprimés. Ainsi, les gènes n'ayant que des régions uniques à un gène RefSeq spécifique ont été utilisés pour une analyse plus approfondie. Dans certaines expériences, comme indiqué dans cette étude, des régions génomiques spécifiques (du TSS à 1 kb en aval ; régions introniques uniquement ; du TSS à 20 kb en aval ; 3′UTR ; premier et dernier exon des gènes exprimés ; autour de la région du TSS (-0,75 kb à +0,75 kb et -0,3 kb à +0,3 kb) ont été générées de la même manière. Pour étudier le processus d'allongement productif par gène, les régions génomiques autour du TSS et Les TTS de gènes ont été divisés en k bacs proportionnels (k = 20 par défaut ; en raison de la qualité des données dans différents ensembles de données, le nombre de bacs varie (détails ci-dessous). Les gènes d'une longueur inférieure à 10 kb ont été supprimés de l'étude pour éviter que trop de lectures ne correspondent à des gènes courts chevauchant des bacs dans l'analyse de l'élongation proportionnelle des gènes.

Un pipeline Python (K_bining.py) a été créé qui prend des lectures alignées ARN/EU/ChIP–seq au format BAM/BW comme entrée pour quantifier les lectures dans la région d'élongation de la transcription des gènes et HTSeq a été effectué pour la quantification des lectures dans les régions génomiques susmentionnées. Des lectures par million (RPM) ont été appliquées pour normaliser différentes bibliothèques de séquençage afin d'exclure les variations techniques (en particulier la profondeur de séquençage) dans d'autres études. L'ensemble de gènes « tous les gènes » comprend tous les gènes avec au moins une cartographie de lecture dans la première kilobase. Un ensemble de gènes avec des gènes qui ont au moins 1 RPM dans chacun des 20 bacs a été construit et appelé « tous les gènes exprimés ». Pour étudier la distribution de lecture entre les corps de gènes et en raison de la profondeur de la séquence et de la qualité des données, un nombre différent de bacs (k) et le nombre de tous les gènes exprimés (n) ont été sélectionnés pour chaque ensemble de données EU-seq et public sur l'ARN total. Par conséquent, l'ensemble de « tous les gènes exprimés » dans le vieillissement WT contient : n = 3 970 gènes et ont été divisés en k = 20 bacs (> 90 % de toutes les lectures EU-seq sont mappées sur ces gènes). souris Ercc1Δ/− (k = 20, n = 2 430) ; Souris Xpg−/− (k = 20, n = 3 842) ; MDF Ercc1Δ/− traités aux UV (k = 10, n = 1974) ; rein vieillissant WT (k = 20, n = 2 135); tendon humain (k = 5, n = 773) ; C. elegans (k = 5, n = 2 872). Pour faire correspondre les données EU-seq de vieillissement WT avec les données RNAPII ChIP-seq correspondantes (générées à partir du même foie), les gènes correspondants de l'ensemble de gènes «tous les gènes exprimés» ont également été sélectionnés dans les ensembles de données RNAPII ChIP-seq. Le fond spécifique intra-échantillon a été déterminé en calculant les lectures dans les régions intergéniques et éliminé proportionnellement. Le signal de fond global a été soustrait en utilisant les échantillons d'entrée d'ADN. Pour définir biologiquement les « tous les gènes exprimés » (n = 3 970) dans le vieillissement WT, nous avons effectué une analyse de clustering k-mean combinée à des lectures EU-seq et ChIP-seq totales entre des échantillons adultes et âgés. Selon le critère décrit dans Extended Data Fig. 3a, nous avons défini les quatre principaux modèles trouvés dans l'analyse en grappes k-moyenne comme quatre groupes biologiques: gènes régulés à la hausse par le promoteur, n = 778 (niveau EU-seq et RNAPII ChIP – seq augmenté sur trois bacs); gènes régulés à la baisse par le promoteur, n = 394 (le niveau EU-seq et RNAPII ChIP-seq a diminué sur trois bacs); Gènes GLPThigh, n = 914 (forte diminution progressive du niveau EU-seq, forte augmentation du niveau RNAPII ChIP-seq sur trois bacs); gènes restants, n = 1 884 (légère diminution progressive du niveau EU-seq, légère augmentation RNAPII ChIP-seq sur trois bacs). Pour étudier la relation entre la longueur des gènes et le phénotype de stress transcriptionnel, les gènes exprimés (n = 3 970) chez les souris WT ont été divisés en six groupes en fonction de leur longueur, chacun contenant un nombre similaire de gènes : 10–22 kb (n = 662, moyenne = 16,47 kb, médiane = 16,75 kb) ; 22–30 ko (n = 644, moyenne = 26,87 ko, médiane = 26,94 ko) ; 30–50 ko (n = 788, moyenne = 40,19 ko, médiane = 39,68 ko) ; 50–70 ko (n = 587, moyenne = 59,18 ko, médiane = 59,02 ko) ; 70–110 ko (n = 643, moyenne = 87,93 ko, médiane = 86,75 ko) et > 110 ko (n = 646, moyenne = 199,47 ko, médiane = 160 ko). Dans les chiffres mesurant le comportement de la classe de gènes, nous avons d'abord calculé le signal moyen par gène de n = 3 souris, suivi d'une moyenne du signal pour tous les gènes de la classe de gènes.

L'ontologie des gènes et les analyses de regroupement fonctionnel des gènes TShigh ont été effectuées à l'aide de plusieurs bases de données et logiciels : Ingenuity Pathway Analysis, GSEA v.4.2.2 qui comprend également l'Encyclopédie des gènes et des génomes de Kyoto (KEGG), les bases de données Reactome Pathway, Aging Perturbations de GEO et les ensembles de données d'Enrichr27,28,67,68. Les ensembles de données des perturbations du vieillissement du GEO et les ensembles de données descendantes d'Enrichr n'ont été inclus que si le jeune/adulte > 8 semaines, l'âge > 14 mois et la différence d'âge entre les organes jeunes/adultes et âgés est > 6 mois (souris, rat) ; l'âge humain est> 56 ans avec au moins une différence d'âge de> 12 ans. Nous avons adopté un seuil FDR < 0,05. Les valeurs P agrégées pour les principaux processus biologiques identifiés ont été calculées en combinant les valeurs P des sous-voies détectées correspondantes à l'aide du test exact de Fisher.

Le rapport de déplacement RNAPII est le rapport entre RNAPII sur le TSS et RNAPII dans le premier corps de gène de 1 kb chez les personnes âgées et adultes. La valeur de densité totale de RNAPII autour du TSS (± 300 pb) a été divisée par la valeur de densité totale de RNAPII sur le premier corps de gène de 1 kb mesurée à partir de 300 pb en aval du TSS pour chaque gène. Pour comparer la synthèse d'ARN naissant de la première région de 1 kb des premiers introns ou du TSS à 1 kb en aval de tous les gènes entre les foies de souris adultes et âgés, tous les ensembles de données ont été normalisés uniquement en fonction de la profondeur de lecture du séquençage, sans correction pour le nombre réduit d'environ 1,5 fois de séquences introniques dans le foie âgé. Pour mesurer l'allongement productif de la transcription, tous les gènes exprimés ont été divisés en k bacs proportionnels, où le nombre moyen de lectures de l'ensemble de données EU-seq et RNAPII ChIP-seq a été calculé. Les comptages ont ensuite été normalisés au premier groupe et tracés. Les changements de densité en pourcentage par bin ont été calculés par : old(readcount) / adult(readcount) × 100 %. Étant donné que le premier et le dernier bac incluent le signal au TSS dans lequel la pause proximale du promoteur RNAPII est présente, et le TTS dans lequel RNAPII s'accumule, nous avons défini les 18 bacs du milieu comme la phase d'élongation de la transcription. La carte thermique à 3 compartiments est dérivée des données à 18 compartiments en agrégeant 6 compartiments suivants et en calculant les changements de pli log2 de chaque gène entre les échantillons anciens et adultes pour les lectures EU-seq et RNAPII ChIP-seq totales. Pour déterminer le pourcentage d'augmentation du blocage de RNAPII ou de RNAPII improductif dans les foies âgés (données étendues Fig. 3f), nous avons supposé une ligne de base dans les foies adultes dans laquelle le niveau total d'ARN naissant dans la phase d'élongation (18 bacs) est le résultat du total. niveaux de RNAPII dans la phase d'élongation (18 bacs). La relation moyenne sur n = 3 souris est définie comme ligne de base. Puisqu'il y a une augmentation des niveaux de RNAPII et une réduction des niveaux d'ARN naissants dans le corps du gène dans le foie âgé, le nombre prévu de lectures RNAPII ChIP-seq totales a été calculé, ce qui devrait prendre en charge ces niveaux d'ARN naissants sur la base de la ligne de base du foie adulte, c'est-à-dire le rapport du nombre de lectures EU-seq et du nombre total de lectures RNAPII ChIP-seq dans la phase d'élongation (18 cases). Par la suite, le nombre total de lectures RNAPII ChIP-seq observé par échantillon a été déterminé dans chaque échantillon de foie âgé. Ensuite, nous avons soustrait le nombre total de lectures RNAPII ChIP-seq attendu du nombre total de lectures RNAPII ChIP-seq observé et divisé par le nombre de lectures attendu dans le foie âgé : blocage de RNAPII dans le vieillissement (%) = (nombre de lectures RNAPII observé - nombre de lectures RNAPII attendu) / nombre de lectures RNAPII attendu × 100 %. Pour analyser la composition des nucléotides, les 50 premiers gènes de GLPThigh et les 50 derniers des gènes restants ont été sélectionnés dans la plage de longueur de 70 à 110 kb et ont été divisés en 35 bacs de TSS à TSS + 70 kb (2 kb par bac). Le pourcentage de composition nucléotidique (cytidine, thymine, adénine et guanine) a été déterminé par Qualimap v.2.21 (réf. 69). Le taux d'erreur de transcription dans les ensembles de données EU-seq a été calculé à l'aide de BioConductor seqTools (packages R v.1.2.0. et IRanges)70. Les taux d'erreur totaux ont été calculés comme le pourcentage de lectures totales avec une base non concordante à chaque position de lecture pendant l'étape d'alignement. L'analyse de l'abondance de lecture EU-seq sur les sites donneurs et accepteurs d'épissage a été réalisée à l'aide d'un script écrit sur mesure : Splicingdonor&acceptorfinder.py dans lequel les valeurs d'expression de ± 49 pb autour du site donneur et accepteur d'épissage pour tous les gènes sélectionnés ont été capturées par le HTSeq v.0.6.0. Les événements d'épissage alternatif ont été détectés par Astalavista v.4.0 (réf. 71) avec les paramètres par défaut. L'état de méthylation de l'ADN a été détecté par Qualimap v.2.21 et deepTools v.2.0 (réf. 72). Les profils moyens de RNAPII au niveau des promoteurs (± 750 pb autour du TSS) et les profils moyens de modification des histones (H3K27ac, H3K4me3 et méthylation de l'ADN) au niveau du TSS et des corps de gènes ont été tracés à l'aide du logiciel HOMER v.4.11 (commande annotatePeak.pl)73.

Pour calculer le nombre de RNAPII bloqués sur une lésion par rapport à la file d'attente derrière le RNAPII initialement bloqué, nous avons d'abord estimé le nombre de lésions d'ADN dans notre ensemble de données de gènes exprimés, qui a une longueur totale de 280 010 046 bp. Avec une densité de lésions de 1,6 pour 100 000 pb dans un génome diploïde, nous attendons environ 8 960 lésions d'ADN. Étant donné que les lésions d'ADN se produisent également sur les brins codant et matrice et que ce dernier n'est important que pour le blocage de RNAPII, il y a 4 480 lésions d'ADN dans le brin matrice de l'ensemble de gènes sélectionné. Si nous supposons que toutes les lésions d'ADN obstruent un complexe RNAPII et que nous avons environ 18 000 complexes RNAPII bloqués par cellule, nous estimons que pour chaque RNAPII bloqué sur une lésion d'ADN, trois complexes RNAPII sont en file d'attente. L'analyse du biais de brin dans les données RNAPII ChIP-seq a été effectuée comme décrit ailleurs38, qui est basée sur l'observation que l'amplification par PCR des bibliothèques RNAPII ChIP-seq est biaisée vers le brin codant s'il y a une lésion d'ADN bloquant la transcription dans le brin matrice sur lequel RNAPII est bloqué, avec quelques modifications. Nous avons d'abord vérifié si notre protocole ChIP-seq spécifique pouvait détecter le biais de brin et optimisé l'analyse en utilisant nos données RNAPII ChIP-seq précédemment publiées après le traitement UVB74. En bref, les lectures avant et arrière de RNAPII ChIP-seq ont été séparées et traitées par SAMtools v.1.9 (réf. 75) et comptées par BEDtools v.2.27.1 (réf. 76). Pour chaque gène de l'ensemble de gènes sélectionné, nous avons d'abord corrigé l'orientation du brin matrice (brin avant/arrière) car les gènes sont situés à la fois sur le brin avant et arrière. Ensuite, nous avons calculé pour chaque gène de l'ensemble de données le biais de fraction vers le brin codant, puis le biais de brin a été calculé sur tous les gènes exprimés dans l'ensemble de gènes.

Les expériences in vitro sont basées sur des triples d'expériences indépendantes et les tracés sont présentés comme des moyennes, sauf indication contraire. Les détails des tests statistiques et des quantifications utilisés dans cette étude sont décrits dans les parties correspondantes du texte principal, les légendes des figures ou les méthodes. La distribution des données était supposée normale, mais cela n'a pas été formellement testé. Tous les tests statistiques ont été effectués avec Prism ou les packages ou fonctions implémentés dans R (fonctions edgeRpackage et fisher.test) à l'exception de l'analyse d'enrichissement avec GSEA, Enrichr et Ingenuity Pathway Analysis, qui ont été réalisées et décrites en détail dans leurs applications Web.

Un cadre statistique et probabiliste a été généré pour l'incorporation de l'UE pour une gamme de distances entre les molécules de l'UE, et dans le cas d'une réduction de 1,5 fois pour une gamme de différences de distance d'incorporation de l'UE. La probabilité qu'au moins une UE soit incorporée dans l'ARN naissant a été modélisée dans la situation où il y a une réduction de 1,5 fois de l'incorporation de l'UE dans les vieux foies de souris en raison d'une absorption ou d'un traitement plus faible ou plus lent. Les hypothèses étaient les suivantes : (1) comme il existe au moins un excédent de biotine > 400 fois pour chaque UE incorporée dans l'ARN naissant dans la réaction Click-iT, la réaction est saturée ou suit la même asymptote ; (2) une seule incorporation EU par molécule d'ARN est suffisante pour isoler cette molécule spécifique; (3) L'incorporation d'UE est un processus stochastique dans lequel la concentration d'UE disponible dans le pool total de nucléotides est en corrélation linéaire avec la distance entre les molécules d'UE dans les ARN naissants. S'il existe une différence de disponibilité dans l'UE entre les souris adultes et les souris âgées, on s'attend à ce que dans les espèces d'ARN courtes (≤ 300 nucléotides), la probabilité d'au moins une incorporation de l'UE soit significativement plus faible et nous observerions donc empiriquement un pourcentage inférieur de lecture de la séquence. mappage à ces petites espèces d'ARN dans le foie âgé. Le processus d'incorporation de l'UE a été modélisé dans des espèces d'ARN naissantes au moyen d'un processus de Poisson. Plus précisément, on peut considérer le nombre d'incorporations d'EU dans l'ARN naissant comme un processus de Poisson non pas dans le temps, comme il est généralement utilisé, mais dans la longueur mesurée en nucléotides. Mathématiquement, si X(t) est un processus de Poisson alors la probabilité qu'il n'y ait aucun événement dans un intervalle de temps (0,t) se lit exp(-λt) où λ est l'intensité du processus de Poisson. De même, la probabilité qu'il y ait au moins un événement dans l'intervalle de temps (0,t) est donc 1 − exp(-λt). Pour chaque espèce d'ARN dans nos classes de longueur d'ARN spécifiées identifiées dans les ensembles de données EU-seq, la probabilité qu'au moins une UE ait été incorporée a ensuite été calculée à l'aide de la formule ci-dessus. Clairement, puisque \(1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over x}}} > 1 - {\mathrm{e}}^{ - {\textstyle{1 \over y}}}\) pour tout x < y, les processus de Poisson avec une intensité plus élevée présenteront nécessairement une plus grande probabilité qu'au moins une UE ait été incorporée que les processus de Poisson d'intensité plus faible. Trois groupes d'espèces d'ARN ont été examinés : (1) ≤ 300 nucléotides (nombre d'espèces d'ARN n = 7 932) ; (2) entre 1 000 et 3 000 nucléotides (nombre d'espèces d'ARN, n = 1983) ; et (3) entre 2 000 et 4 000 nucléotides (nombre d'espèces, n = 1 802). Le nombre d'espèces d'ARN reflète le nombre total présent dans la base de données du génome de Mus musculus (Ensembl). Les deux dernières classes, bien que représentant toujours des espèces à ARN court, sont incorporées en tant que contrôle positif dans lequel une différence, s'il y a 1,5 fois moins d'UE disponible, n'est pas attendue. Dans tous les cas, les vecteurs de probabilité n'étaient pas gaussiens comme calculé par le test de Kolmogorov-Smirnov ; ainsi, pour chaque intensité fixe du processus de Poisson sous-jacent, la médiane et l'intervalle interquartile (IQR) de la probabilité qu'au moins une UE soit incorporée sont calculés. La signification entre des intensités séparées de 1,5 fois a été calculée par le test U de Mann-Whitney.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports sur le portefeuille Nature lié à cet article.

Les données EU-seq et ChIP-seq ont été déposées sur le site Web NCBI Sequence Read Archive et sont accessibles au public (n° d'accès PRJNA603447). Les images de microscopie rapportées dans cet article seront partagées par le contact principal sur demande raisonnable. Plusieurs ensembles de données publics ont été réanalysés, notamment : les données totales d'ARN-seq du tendon humain51 (https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E-MTAB-2449/) et Caenorhabditis elegans52 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA357503) pour la Fig. 6a, la méthylation de l'ADN (https://www.nc bi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE95361)77, histones H3K27ac et H3K4me3 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA281127) pour les Figs de données étendues. 5 et 6, MNase-seq (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE58005)78 et RNAPII ChIP–seq data from UVB-irradiated cells (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/bioproject/?term=PRJNA230028) for Extended Data Fig. 7a. Les données sources sont fournies avec ce document.

Tous les logiciels utilisés dans cette étude sont publiés et cités soit dans le texte principal, soit dans les Méthodes. Tout le code original a été déposé sur : https://github.com/Pothof-Lab/Transcriptional-Stress. Les approches d'analyse de données utilisant des progiciels publiés sont décrites dans les méthodes.

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Nous remercions M. Tresini, G. Garinis, P. Mastroberardino et C. Milanese pour fournir des réactifs et des protocoles. Nous remercions Y. van Loon et W. Vermeij pour une assistance générale avec des expériences de souris. Nous remercions P. van Arp pour son soutien au séquençage de l'ARN. Le séquençage de l'ARN a été effectué dans l'installation ErasmusMC HuGeF dirigée par AG Uitterlinden et J. van Meurs et dans l'installation ErasmusMC Biomics dirigée par W. van Ijcken. RNAPII ChIP–seq a été réalisé par la plateforme GenomEast, membre du consortium « France Génomique » (ANR-10-INBS-0009). Nous reconnaissons le soutien financier des National Institutes of Health/National Institute of Aging (P01 AG017242 ; Réparation de l'ADN, mutations et vieillissement cellulaire) à JHJH et JP, European Research Council Advanced Grant Dam2Age to JHJH, the European commission EU ITN Address (GA-316390) to JHJH, Dutch research organization ZonMW Memorabel project no. 733050810 à JP et JHJH, Deutsche Forschungsgemeinschaft (Fondation allemande pour la recherche) projet no. 73111208-SFB829 à JHJH et Programme commun européen sur les maladies rares (EJPRD TC-NER) à JHJH Les bailleurs de fonds n'ont joué aucun rôle dans la conception de l'étude, la collecte et l'analyse des données, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

Ces auteurs ont contribué à parts égales : Akos Gyenis, Jiang Chang.

Département de génétique moléculaire, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Pays-Bas

Akos Gyenis, Jiang Chang, Joris JPG Demmers, Serena T. Bruens, Sander Barnhoorn, Renata MC Brandt, Marjolein P. Baar, Marko Raseta, Kasper WJ Derks, Jan HJ Hoeijmakers et Joris Pothof

Université de Cologne, Faculté de médecine, Groupe d'excellence pour la recherche sur le vieillissement, Institut pour la stabilité du génome dans le vieillissement et la maladie, Cologne, Allemagne

Akos Gyenis & Jan HJ Hoeijmakers

Centre de médecine moléculaire, Centre médical universitaire d'Utrecht, Utrecht, Pays-Bas

Marjolein P.Baar

Département de génétique clinique et École d'oncologie et de biologie du développement, Maastricht University Medical Center, Maastricht, Pays-Bas

Kasper WJ Derks

Centre Princess Maxima d'oncologie pédiatrique, Institut Oncode, Utrecht, Pays-Bas

Jan HJ Hoeijmakers

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JP a conçu et supervisé le projet. JP, AG et JC ont conçu les expériences. JP, AG, JC et JHJH ont interprété les données. JP, AG et JC ont rédigé le manuscrit et préparé les figures. JHJH a fait une lecture critique, a introduit le concept de la perte de gènes longs liée à l'âge et a édité le manuscrit. RMCB et SB ont réalisé les expériences sur la souris et les injections EU. AG a effectué et analysé la coloration EU et RNAPII chez des souris WT. SB a effectué et analysé la coloration EU chez des souris Xpg-/-. AG a développé l'EU-seq et préparé tous les échantillons de séquençage. JC, AG et KWJD ont conçu le pipeline d'analyse EU-seq. JC et KWJD ont créé le pipeline de cartographie et de normalisation EU-seq. JC a conçu les algorithmes et écrit les scripts pour les analyses de données. JC et AG ont effectué les analyses bioinformatiques. JJPGD a effectué les tests d'accumulation de stress transcriptionnels in vitro. MR a effectué les analyses statistiques. STB et MPB ont effectué la coloration EU dans des cultures cellulaires exposées aux UV et ont analysé la sénescence cellulaire.

Correspondance à Joris Pothof.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

Nature Genetics remercie Evgeny Nudler, George Garinis et les autres examinateurs anonymes pour leur contribution à l'examen par les pairs de ce travail. Les rapports des pairs examinateurs sont disponibles.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

a–c, nuages ​​de points XY de (a) RNAPII total, (b) RNAPII-ser5p et (c) RNAPII-ser2p; AU : unités arbitraires. bleu : foies adultes de type sauvage ; rouge = vieux foie. n = 3 souris/groupe. Nombre total de noyaux comptés : a, adulte : n = 206, ancien : n = 155. b, adulte, n = 748 ; vieux n = 701. c, adulte : n = 984 ; vieux, n = 674.

Données source

a, organigramme des analyses du séquençage de l'ARN naissant marqué par l'UE (EU-seq). b, c, distribution de lecture de séquence dans EU-seq et séquençage de l'ARN total dans les introns et les exons (b) et cartographié sur les gènes (c), montrant un nombre accru de lectures introniques dans EU-seq, indiquant un enrichissement naissant de l'ARN. d, parcelles de bioanalyseur d'ADNc synthétisé sur billes pour générer des bibliothèques EU-seq. Étant donné que la transcriptase inverse ne peut pas synthétiser l'ADNc via la biotine liée de manière covalente à l'ADN, l'ADNc n'est généré qu'entre les biotines liées par covalence à l'UE ou de la biotine liée à l'UE à l'extrémité de l'ARN. L'ADNc adulte et ancien est presque identique, indiquant des taux d'incorporation similaires dans l'UE. e, tableau illustrant l'incorporation de l'UE pour une gamme de distances entre les molécules de l'UE modélisées par le processus de Poisson. Trois groupes d'espèces d'ARN ont été examinés : 1) ≤ 300 nucléotides (n = 7932), 2) 1000 à 3000 nucléotides (n = 1983) et 3) 2000 à 4000 nucléotides (n = 1802). La médiane et l'intervalle interquartile (IQR) sont affichés. f, tableau du cadre statistique et probabiliste illustrant une réduction de 1,5 fois pour une plage de différences de distance d'incorporation dans l'UE. Si l'incorporation de l'UE diffère entre les adultes et les personnes âgées, on s'attend à ce que dans les espèces d'ARN ≤ 300 nucléotides, la probabilité d'au moins une incorporation de l'UE soit significativement plus faible. Pour chaque paire spécifiée d'intensités séparées de 1,5 fois, le changement de pli attendu dans le foie âgé a été calculé et les vecteurs de probabilités correspondants à 7932 dimensions ont été comparés par le test U de Mann-Whitney. Il existe une probabilité très élevée et significative qu'une différence soit observée entre les adultes et les personnes âgées (p < 2,2 × 10−16, colonne 3) s'il y a une réduction de 1,5 fois de l'incorporation d'UE dans le foie âgé. g, lectures de séquence en pourcentage dans les ensembles de données EU-seq cartographiant les catégories de longueur des espèces d'ARN i) ≤ 300 nucléotides, ii) 1 000 à 3 000 nucléotides et iii) 2 000 à 4 000 nucléotides. La catégorie de longueur ≤300 nucléotides montre une augmentation non significative (valeur p = 0,061093, test t bilatéral non apparié) de 1,2 fois dans le foie âgé, ce qui indique qu'il est peu probable que la disponibilité de l'UE soit différente entre les foies adultes et âgés. Les données sont moyennes ± SEM. h, pourcentage de lectures d'ARN naissant marquées par l'UE synthétisées par différentes ARN polymérases (RNAPI-II-III et RNAP mitochondriale (RNAP-MT)). Les anciennes valeurs ajustées (orange) ont été calculées par compensation proportionnelle de la réduction de la transcription naissante, comme observé sur la figure 1a. n = 3 souris/groupe. Les données sont moyennes ± SEM. i, Épissage alternatif dans les données EU-seq. n = 3 souris/groupe. Les données sont moyennes ± SEM. j, Rapports des sites donneurs et accepteurs d'épissage dans EU-seq. n = 3 souris/groupe. Les données sont moyennes ± SEM.

Données source

a, Représentation schématique de l'identification basée sur le regroupement k-means des mécanismes de régulation putatifs derrière les changements d'expression génique liés au vieillissement. b, c, Le changement moyen de facteur Log2 de l'EU-seq et du RNAPII ChIP-seq total se lit dans le foie vieillissant dans l'ensemble des corps de gènes (3 bacs) de (b) gènes «promoteurs régulés à la hausse» (n = 778) et (c) gènes «promoteurs régulés à la baisse» (n = 394). Calculé à partir de la Fig. 2 f. Les données sont moyennes ± SEM. d, longueur moyenne des gènes (panneau de gauche) de tous les gènes exprimés, gènes régulés à la hausse par le promoteur, gènes régulés à la baisse par le promoteur et gènes avec une perte progressive élevée de transcription productive (GLPThigh) comme le montre la figure 2a et classés par longueur de gène (panneau de droite) Groupes : 10–22 kb (bleu ; n = 662) ; 22–32 ko (noir ; n = 644) ; 32–50 ko (rose ; n = 788), 50–70 ko (jaune ; n = 587), 70–110 ko (orange ; n = 643) et >110 ko (rouge ; n = 646). Les données sont moyennes ± SEM. Valeur P = 7,84163*10−22, test t bilatéral non apparié. e, La contribution (%) de chaque classe de longueur de gène au pool total d'ARN naissant dans les échantillons adultes. f, Calcul de la fraction de complexes RNAPII improductifs dans le foie âgé. g, Estimation du nombre de complexes RNAPII décrochants dans le foie âgé.

Données source

Paramètres transcriptionnels dans les groupes de gènes fonctionnels identifiés (tels que décrits dans la Fig. 3a étendue) : a–d, composition moyenne des nucléotides par longueur de gène kb dans le brin matrice pour les 70 premiers kb du TSS des 50 meilleurs gènes GLPThigh 70–80 kb (ligne noire) par rapport aux 50 gènes restants 70–80 kb qui contiennent de faibles niveaux de GLPT (ligne rouge). Les données sont moyennes ± SEM. e, Taux d'erreur de transcription dans les données EU-seq des foies adultes (bleus) et anciens (rouges) de type sauvage dans 4 ensembles de gènes différents : « Promoteur régulé positivement » (n = 778), « Promoteur régulé négativement » (n = 394), GLPThigh (n = 914), reste (n = 1884). Les données sont moyennes ± SEM. f, diagramme à barres montrant le rapport entre les lectures EU-seq cartographiées sur les sites donneurs et accepteurs d'épissage des gènes dans chaque groupe de gènes fonctionnels dans e. Moyenne de n = 3 / groupe affiché. Les données sont moyennes ± SD.

Données source

Groupes de gènes fonctionnels : gènes régulés positivement par le promoteur, gènes régulés négativement par le promoteur, gènes avec une perte progressive élevée de transcription productive (GLPThigh) et reste. Les données sont moyennes ± sd Les lignes bleues représentent le foie adulte, les lignes rouges représentent le vieux foie. Moyenne de n = 3 / groupe indiqué pour : a, Total RNAPII. b, sérine 5 phosphorylée (ser5p) RNAPII. c, acétylation de l'histone 3 lysine 27 (H3K27Ac; chromatine ouverte). d, histone 3 lysine 4 triméthylation (H3K4Me3; chromatine ouverte). e, chromatine inaccessible car la MNase ne digère que l'ADN non lié aux protéines, y compris les nucléosomes.

Données source

Groupes de gènes fonctionnels : gènes régulés positivement par le promoteur, gènes régulés négativement par le promoteur, gènes avec une perte progressive élevée de transcription productive (GLPThigh) et reste. Les lignes bleues représentent le foie adulte, les lignes rouges représentent le vieux foie. Moyenne de n = 3 / groupe illustré de la densité de lecture de séquençage de TSS + 750 bp à TTS + 4 kb pour : a, acétylation de l'histone 3 lysine 27 (H3K27Ac ; chromatine ouverte). b, triméthylation de l'histone 3 lysine 4 (H3K4Me3; chromatine ouverte). c, chromatine inaccessible car la MNase ne digère que l'ADN non lié aux protéines, y compris les nucléosomes. d, statut de méthylation de l'ADN.

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a, Diagramme à barres représentant le biais du brin codant dans les données totales RNAPII ChIP-seq 1 heure et 6 heures après l'irradiation des cellules MCF7 avec 55 J/m2 d'UVB (données de 76). Tous les gènes (n = 18224), gènes courts (10–22 kb) et gènes longs (>110 kb). Les données sont moyennes ± SEM. Notez que le biais de brin n'est présent que dans les cellules MCF7 1 heure après le traitement UVB, lorsque RNAPII est toujours bloqué sur les lésions de l'ADN et que la réparation de l'ADN est en cours. Après 6 heures, la plupart des RNAPII bloqués ont été éliminés des lésions d'ADN. Cela montre que i) le protocole utilisé est capable de détecter un biais vers le brin codant et peut donc être utilisé pour analyser des échantillons vieillissants, ii) le biais du brin codant est un phénotype transitoire après UVB. Sur la base des quantités publiées de biais de brin codant après une densité de lésion d'ADN induite par les UVC connue, nous estimons que les foies de souris âgées de type sauvage affichent une fraction de biais de brin codant comprise entre 0, 05 et 0, 10. b – f, couverture moyenne de la méthylation de l'ADN locale ( b ) et ( c – f ) état de la composition locale des nucléotides dans les brins matrices de 50 gènes présentant le biais de brin codant le plus élevé en général. La région intronique intragénique est choisie avec le biais de brin codant le plus élevé (loci de biais de brin élevé). Cet ensemble de gènes de locus est comparé ti) des loci intragéniques sélectionnés au hasard de taille similaire : 6 fois 50 emplacements introniques aléatoires dans le brin matrice, et ii) le transcriptome intronique complet ; tous les introns du transcriptome (y compris les emplacements à biais de brin élevé). Moyenne de n = 50 / groupe affiché. Les données sont moyennes ± SD.

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Tableau supplémentaire 1. Chevauchement entre les gènes TShigh et six études transcriptomiques indépendantes avec des gènes régulés à la baisse par les dommages causés par les UV. Tableau lié à la Fig. 5. Tableau supplémentaire 2. Voies et processus cellulaires significativement surreprésentés dans la catégorie TShigh. Tableau relatif à la Fig. 5.

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Réimpressions et autorisations

Gyenis, A., Chang, J., Demmers, JJPG et al. Le blocage de l'ARN polymérase à l'échelle du génome façonne le transcriptome au cours du vieillissement. Nat Genet 55, 268-279 (2023). https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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Reçu : 17 décembre 2021

Accepté : 07 décembre 2022

Publié: 19 janvier 2023

Date d'émission : Février 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41588-022-01279-6

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